基于生物信息學(xué)分析糖酵解相關(guān)基因?qū)LBCL免疫微環(huán)境的影響

祁玉嬌 劉聰聰 黃大帥 李紅玲

基金項(xiàng)目：國家衛(wèi)健委胃腸腫瘤診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2022年度碩博士/博士后基金項(xiàng)目（編號：NHCDP2022005）

作者簡介：祁玉嬌（1994.3-），女，甘肅鎮(zhèn)原縣人，碩士研究生，主要從事淋巴瘤的研究

通訊作者：李紅玲（1969.12-），女，甘肅蘭州人，博士，主任醫(yī)師，主要從事淋巴瘤的研究

摘要：目的? 探討基于糖酵解相關(guān)基因預(yù)測彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）的腫瘤免疫微環(huán)境，并研究其潛在機(jī)制。方法? 從NCICCR數(shù)據(jù)庫中下載DLBCL患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息，基于糖酵解相關(guān)基因，采用共識聚類的方法將其分為C1簇和C2簇。采用Kaplan-Meier（K-M）生存分析、ESTIMATE、TIMER和ssGSEA分析來確定所識別的2個(gè)簇類之間的生存、功能和腫瘤微環(huán)境（TME）的差異性。通過GO、KEGG和GSEA功能分析闡明其潛在機(jī)制。結(jié)果? 2個(gè)簇類之間的生存率顯著不同；K-M生存曲線表明，C1簇的存活率高于C2簇，并且免疫評分、ESTIMATE評分與基質(zhì)評分高于C2簇。GO和KEGG分析表明，兩簇之間的差異性表達(dá)基因主要在細(xì)胞外基質(zhì)和免疫途徑中富集。GSEA分析顯示，免疫通路在C1簇的富集度高于C2簇。結(jié)論? 差異性表達(dá)基因于C1簇中與腫瘤免疫微環(huán)境顯著相關(guān)，并且生存率高于C2簇。說明糖酵解代謝失調(diào)導(dǎo)致了腫瘤免疫微環(huán)境的損害，從而導(dǎo)致DLBCL預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；免疫微環(huán)境；糖酵解；預(yù)后

中圖分類號：R733.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.001

文章編號：1006-1959（2024）09-0001-07

Effect of Glycolysis-related Genes on the Immune Microenvironment of DLBCL

Based on Bioinformatics Analysis

QI Yu-jiao1，LIU Cong-cong1，HUANG Da-shuai1，LI Hong-ling2

（1.College of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China;

2.Department of Oncology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，Gansu，China）

Abstract：Objective? To explore the prediction of tumor immune microenvironment in diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） based on glycolysis-related genes， and to study its potential mechanism.Methods? The RNA-seq data and corresponding clinical information of DLBCL patients were downloaded from the NCICCR database. Based on the genes related to glycolysis， they were divided into C1 cluster and C2 cluster by consensus clustering method. Kaplan-Meier （K-M） survival analysis， ESTIMATE， TIMER， and ssGSEA analysis were used to determine differences in survival， function， and tumor microenvironment （TME） between the two identified cluster classes. The potential mechanism was elucidated by GO， KEGG and GSEA functional analysis.Results? The survival rates between the two clusters were significantly different. The K-M survival curve showed that the survival rate of C1 cluster was higher than that of C2 cluster， and the immune score， ESTIMATE score and matrix score were higher than those of C2 cluster. GO and KEGG analysis showed that the differentially expressed genes between the two clusters were mainly enriched in extracellular matrix and immune pathways. GSEA analysis showed that the enrichment of immune pathways in C1 cluster was higher than that in C2 cluster.Conclusion? Differentially expressed genes in C1 cluster are significantly associated with tumor immune microenvironment， and the survival rate is higher than that in C2 cluster. It indicates that the disorder of glycolysis metabolism leads to the damage of tumor immune microenvironment， which leads to the poor prognosis of DLBCL.

Key words：Diffuse large B-cell lymphoma;Immune microenvironment;Glycolysis;Prognosis

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤（NHL）的類型，是以臨床特點(diǎn)、免疫表型、療效及預(yù)后等差異為主要表現(xiàn)的一組高度異質(zhì)性疾病，約占我國全部NHL的37.9%[1]?；诶孜魡慰沟拿庖呋?，近40%的DLBCL患者沒有受益[2，3]。以利妥昔單抗為基礎(chǔ)的R-CHOP加X方案也未能改善某些患者的總生存期（OS）[4]。許多新的治療方法的出現(xiàn)，如抗CD19嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞療法雖已顯示出對難治性和復(fù)發(fā)性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（R/R DLBCL）的顯著療效。但該療法在近25%的患者中仍屬失敗[5]。因此，進(jìn)一步探索一種針對DLBCL患者個(gè)體化靶向治療的預(yù)后基因具有重要意義。

糖酵解（glycolysis）是指細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUTs）將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)裂解為兩分子丙酮酸的這一過程。研究者在上個(gè)世紀(jì)20年代已發(fā)現(xiàn)Warburg效應(yīng)，即使在氧含量充足時(shí)，腫瘤細(xì)胞也會傾向于糖酵解進(jìn)而代謝葡萄糖。糖酵解通路除了向機(jī)體供能，還可產(chǎn)生丙酮酸和6-磷酸葡萄糖，為腫瘤細(xì)胞提供合成脂肪酸和核苷酸所需的原料。此外，糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸，可以分泌到細(xì)胞外產(chǎn)生一種導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)重塑的酸性微環(huán)境，從而幫助腫瘤的生長[6]。因此，靶向糖酵解已被認(rèn)為是腫瘤治療的一種新的治療策略。

腫瘤微環(huán)境（TME）是以腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)元素、免疫細(xì)胞之間的相互作用為基礎(chǔ)，對淋巴瘤的生存、治療反應(yīng)和病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)有重要影響[7]。但關(guān)于探討DLBCL中糖酵解相關(guān)基因（GRGs）與腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）之間的相互作用仍然比較淺。因此，本研究從生物信息數(shù)據(jù)庫中收集與糖酵解相關(guān)的基因和數(shù)據(jù)，闡明糖酵解與DLBCL的TIME之間的關(guān)系，初步探討糖酵解相關(guān)基因的潛在機(jī)制和生物學(xué)作用，以期為臨床醫(yī)生提供更準(zhǔn)確的治療方向。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源? 從癌癥基因組數(shù)據(jù)庫（NCICCR：https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下載本研究所需的RNA-seq數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者已明確診斷為DLBCL的數(shù)據(jù)樣本；②表明基因表達(dá)矩陣和臨床信息的樣本；③臨床信息完整的樣本，包括年齡、性別、生存時(shí)間和生存狀態(tài)；④若有配對樣本，只包括1個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①正常組織樣本；②無表達(dá)值的樣本；③樣本的表達(dá)值存在偏倚。從分子簽名數(shù)據(jù)庫[8]（MSigDB：gsea-msigdb.org）中共搜索GRGs集（BIOCARTA_GLYCOLYSIS_PATHWAY、HALLMARK_GLYCOLYSIS、KEG_GLYCOLYSIS_GL

UCONEOGENESIS、REACTOME_GLYCOLYSIS、WP_

GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS）295個(gè)。

1.2方法

1.2.1 分子亞型的鑒定? 首先，通過單因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)56個(gè)GRGs與DLBCL的預(yù)后相關(guān)，采用共識聚類[9]進(jìn)行聚類分析，使用凝聚層次聚類，對樣本進(jìn)行10次重復(fù)，利用經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù)圖確定最優(yōu)的聚類數(shù)。

1.2.2 腫瘤微環(huán)境分析? 利用ESTIMATE算法[10，11]估計(jì)惡性腫瘤組織中的基質(zhì)細(xì)胞，計(jì)算基質(zhì)評分和免疫評分。采用TIMER免疫浸潤分析[12]，計(jì)算6種免疫浸潤細(xì)胞（B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞）的表達(dá)。

1.2.3 功能富集分析? 利用R包“Limma”識別兩個(gè)簇類之間的差異表達(dá)基因?；虮倔w論（GO）[13]分析和京都基因組百科全書（KEGG）分析[14]使用“clusterProfiler”包[15]來富集在MATESCAPE中可視化的相關(guān)通路。通過GSEA[16]基因集富集分析（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.JSP）進(jìn)行基因集變異分析，以證明信號通路在兩個(gè)簇之間的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 所有統(tǒng)計(jì)分析和作圖均采用R軟件（版本4.0.2）和SangerBox軟件（版本3.0）[17]完成。采用K-M進(jìn)行生存分析，Log-rank檢驗(yàn)分析整體生存率（OS）的差異。用t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)或？字2檢驗(yàn)識別各變量之間的差異。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果

2.1鑒定GRGs的分子亞型? 基于單變量Cox回歸分析產(chǎn)生了56個(gè)與糖酵解相關(guān)的預(yù)后基因。采用共識聚類方法將DLBCL患者分為亞組。當(dāng)出現(xiàn)K = 2時(shí)，組內(nèi)平均一致性最高，確定了最優(yōu)的聚類穩(wěn)定性（圖1A～圖1C），233例患者聚為C1簇，248例患者聚為C2簇。通過熱圖可視化兩種亞型中GRGs的表達(dá)水平（圖1D），發(fā)現(xiàn)C1簇和C2簇之間存在明顯的表達(dá)差異。此外，利用對數(shù)秩檢驗(yàn)方法評估了不同組樣本之間的預(yù)后差異顯著性，最終觀察到C1簇患者的總生存率優(yōu)于C2簇患者的生存率（P=2.6e-5，圖1E）。這些結(jié)果都表明，GRGs可以將DLBCL患者分為兩種不同的分子亞型。

2.2兩種亞型之間的TIME存在顯著差異? ESTIMATE算法顯示，在DLBCL患者中C1簇和C2簇之間的Stromal評分（P=1.0e-32）、Immune評分（P=8.0e-3）和ESTIMATE評分（P=1.2e-20）均有差異（圖2A），并且C1簇的各項(xiàng)評分均高于C2簇。此外，TIMER算法顯示除B細(xì)胞（P=0.04）、CD8 T細(xì)胞（P=0.16）和巨噬細(xì)胞（P=0.06）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，C1簇的CD4 T細(xì)胞（P=4.6e-6）、中性粒細(xì)胞（P=4.7e-4）與樹突狀細(xì)胞（P=7.7e-9）的表達(dá)量均高于C2簇（圖2B、圖2C）。這些結(jié)果表明，C2簇的免疫狀態(tài)和基質(zhì)微環(huán)境相對較低，并且兩種分子亞型的腫瘤微環(huán)境存在顯著差異。

2.3 DEGs和功能富集分析? 使用R軟件包“l(fā)imma”進(jìn)行差異分析，獲得兩個(gè)簇之間的DEGs并進(jìn)行功能富集分析，以探索其潛在的信號機(jī)制。共檢測到196個(gè)DEGs，其中184個(gè)基因表達(dá)被上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)被下調(diào)（圖3A）。為了進(jìn)一步確定DEGs在兩個(gè)簇之間的功能，采用“clusterProfiler”包得到基因的富集結(jié)果。KEGG富集分析顯示，DEGs在細(xì)胞外基質(zhì)和免疫相關(guān)的生物學(xué)過程中富集，包括ECM受體相互作用、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路（圖3B）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)一些DEGs和免疫微環(huán)境相關(guān)的信號通路（圖3C）。

2.4 MATESCAPE分析? 網(wǎng)絡(luò)富集圖顯示兩個(gè)簇之間的DEGs明顯富集于細(xì)胞外基質(zhì)和免疫通路（圖4A），PPI分析也確定了6個(gè)亞模型（圖4B），其均表明兩個(gè)簇之間的DEGs與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探討富集通路和DLBCL患者的預(yù)后關(guān)系，采用ssGSEA分析，對兩個(gè)集群之間的通路相對表達(dá)差異進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)C1簇明顯富集于免疫相關(guān)通路和細(xì)胞基質(zhì)（圖4C）。這些結(jié)果表明，GRGs的表達(dá)與DLBCL患者的TME和免疫密切相關(guān)。

3討論

全球范圍內(nèi)最常見的非霍奇金淋巴瘤類型是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，患者常表現(xiàn)為腫瘤腫塊惡性生長[18]。采用R-CHOP方案，可治愈60%～70%的DLBCL患者。但是，仍有30%～40%的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，或者針對一小部分患者，采用此方案進(jìn)行治療后無效。對于能夠忍受干細(xì)胞移植的年輕患者，通常會推薦自體干細(xì)胞移植療法[19]。其中一部分患者療效尚可，但有相當(dāng)一部分患者仍不能通過這種方法治愈。目前迫切需要制定有效的風(fēng)險(xiǎn)分層方法和個(gè)性化的靶向治療策略。在本研究中，鑒定了兩個(gè)分子亞型，它們分別表現(xiàn)出顯著不同的糖酵解景觀。ESTIMATE分析顯示，預(yù)后較差的患者基質(zhì)評分均低于預(yù)后較好的患者。進(jìn)一步的功能分析也顯示GRGs與腫瘤微環(huán)境和免疫相關(guān)。

共識聚類是一種基于基因表達(dá)矩陣將樣本分類為不同亞組的可靠方法。首先，基于GRGs表達(dá)矩陣，通過共識聚類確定了兩個(gè)分子亞組，它們的總生存率也有顯著差異，然后對它們依次進(jìn)行免疫和功能分析，探討糖酵解在DLBCL中的作用。

由于腫瘤進(jìn)展與周圍間質(zhì)改變有關(guān)，免疫細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的關(guān)鍵成分[20]，因此TIME對患者的預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。此外，腫瘤細(xì)胞的代謝狀態(tài)異常會導(dǎo)致TIME的代謝變化。ESTIMATE算法是一種創(chuàng)新的方法[10]，根據(jù)基因表達(dá)值來推斷腫瘤的純度，免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤中所占的比例。通過ESTIMATE算法將腫瘤樣本中的免疫成分定量地顯示，并對TIME進(jìn)行了反映。此前，有研究[21]已證實(shí)免疫功能與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)。本研究顯示，預(yù)后效果更好的患者獲得了更高的免疫評級，這與此前的報(bào)告相符。此外，本研究應(yīng)用TIMER來評估這兩個(gè)分子亞群的免疫狀態(tài)。TIMER是一種對6個(gè)腫瘤浸潤性免疫亞群進(jìn)行定量幫助的網(wǎng)絡(luò)工具。TIMER分析顯示，在簇2中，6個(gè)免疫細(xì)胞中有3個(gè)的豐度明顯降低，因此，可以假設(shè)免疫狀態(tài)可能與不良預(yù)后有關(guān)。

基于已鑒定的DEGs、GO分析、KEGG分析和MATESCAPE分析協(xié)同提示，免疫失調(diào)和細(xì)胞外基質(zhì)失調(diào)可能介導(dǎo)糖酵解在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的作用。因此，本研究進(jìn)行了GSEA分析，對其潛在機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步明確。GSEA分析是一種整合基因表達(dá)信息，明確不同組基因集表達(dá)趨勢的方法。在本研究中，GSEA分析出了與KEGG、GO富集相關(guān)通路一致的結(jié)果。這些結(jié)果均表明，GRGs的表達(dá)與DLBCL患者的免疫失調(diào)和不良預(yù)后有關(guān)。

通過上述生物信息學(xué)分析得出：糖酵解代謝失調(diào)導(dǎo)致了TIME的損害，從而導(dǎo)致DLBCL預(yù)后不良。因此，干擾糖代謝途徑對治療DLBCL患者有重要價(jià)值，多條證據(jù)表明，葡萄糖代謝賦予DLBCL腫瘤細(xì)胞能量和生存特權(quán)，可以滿足腫瘤細(xì)胞的生物能量和生物合成的需求。未來的研究需要揭示糖酵解在DLBCL過程中的作用，這些研究可能會確定用于治療該疾病患者的新的代謝靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過共識聚類的方法在DLBCL中確定了兩種分子亞型。采用TIME分析和功能富集分析顯示，糖酵解會導(dǎo)致腫瘤免疫微環(huán)境失調(diào)，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

參考文獻(xiàn)：

[1]Satou A，Bennani NN，F(xiàn)eldman AL.Update on the classification of T-cell lymphomas， Hodgkin lymphomas， and histiocytic/dendritic cell neoplasms[J].Expert Review of Hematology，2019，12（10）：833-843.

[2]Elena CM，Camila P，Pilar L，et al.Diffuse Large B-Cell Lymphoma in Chile： The Impact of Combined CHOP Plus Rituximab in the Public Health System[J].JCO Global Oncology2022，8：e2200165.

[3]Choi KH，Lee SJ，Mun SH，et al.Consolidative Radiotherapy after Complete Remission following R-CHOP Immunochemotherapy in Stage III-IV Diffuse Large B-Cell Lymphoma Patients： A Systematic Review and Meta-Analysis[J].Cancers （Basel），2023，15（15）：3940.

[4]Toyama K，Nakayama K，Terasaki S，et al.Real-world efficacy of DA-EPOCH-R/HD-MTX regimen in CD5-positive diffuse large B cell lymphoma： a single-institute analysis[J].Journal of Clinical and Experimental Hematopathology，2023，63（1）：19-24.

[5]Sang W，Shi M，Yang J，et al.Phase II trial of co-administration of CD19- and CD20-targeted chimeric antigen receptor T cells for relapsed and refractory diffuse large B cell lymphoma[J].Cancer Medicine，2020，9（16）： 5827-5838.

[6]Vaupel P，Schmidberger H，Mayer A.The Warburg effect： essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression[J].International Journal of Radiation Biology，2019，95（7）：912-919.

[7]Cioroianu AI，Stinga PI，Sticlaru L，et al.Tumor Microenvironment in Diffuse Large B-Cell Lymphoma： Role and Prognosis[J].Analytical Cellular Pathology（Amsterdam），2019，2019：8586354.

[8]Yucheng F，Zhijian J，Yuhui S，et al.Construction and validation of a novel apoptosis-associated prognostic signature related to osteosarcoma metastasis and immune infiltration[J].Translational Oncology，2022，22：101452.

[9]Tu S，Qiu Y.Molecular subtypes and scoring tools related to Foxo signaling pathway for assessing hepatocellular carcinoma prognosis and treatment responsiveness[J].Frontiers in Pharmacology，2023，14：1213506.

[10]Jiaxin D，Quyuan T，Ying L，et al.Assessment of the targeted effect of Sijunzi decoction on the colorectal cancer microenvironment via the ESTIMATE algorithm[J].PLoS One，2022，17（3）：e0264720.

[11]Petitprez F，Levy S，Sun CM，et al.The murine Microenvironment Cell Population counter method to estimate abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations in murine samples using gene expression[J].Genome Medicine，2020，12（1）：86.

[12]Li T，F(xiàn)u J，Zeng Z，et al.TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells[J].Nucleic Acids Research，2020，48（W1）：W509-W514.

[13]The Gene Ontology Consortium.The Gene Ontology Resource：20 years and still GOing strong[J].Nucleic Acids Research，2019，47（D1）：D330-D338.

[14]Minoru K，Yoko S，Masayuki K.KEGG mapping tools for uncovering hidden features in biological data[J].Protein Science，2021，31（1）：47-53.

[15]Tianzhi W，Erqiang H，Shuangbin X，et al.clusterProfiler 4.0： A universal enrichment tool for interpreting omics data[J].The Innovation，2021，2（3）：100141.

[16]Canzler S，Hackermüller J.multiGSEA： a GSEA-based pathway enrichment analysis for multi-omics data[J].BMC Bioinformatics，2020，21（1）：561.

[17]Yang F，Shi H，Xu T，et al.Allogeneic stem cell transplantation combined with conditioning regimen including donor-derived CAR-T cells for refractory/relapsed B-cell lymphoma[J].Bone Marrow Transplantation，2023，58（4）：440-442.

[18]Li S，Young KH，Medeiros LJ.Diffuse large B-cell lymphoma[J].Pathology，2018，50（1）：74-87.

[19]Epperla N，Hamadani M.Hematopoietic cell transplantation for diffuse large B-cell and follicular lymphoma： Current controversies and advances[J].Hematology/oncology and Stem Cell Therapy，2017，10（4）：277-284.

[20]Hinshaw DC，Shevde LA.The Tumor Microenvironment Innately Modulates Cancer Progression[J].Cancer Research，2019，79（18）：4557-4566.

[21]Yang J，Yu L，Man J，et al.Immune scoring model based on immune cell infiltration to predict prognosis in diffuse large B-cell lymphoma[J].Cancer，2023，129（2）：235-244.

收稿日期：2023-09-09；修回日期：2023-09-24

編輯/成森