大孔吸附樹脂分離純化甘草廢渣中總黃酮的工藝研究

范博　舒泉湧　李宗霖　翟帆

摘要 ［目的］開發(fā)大孔吸附樹脂分離純化甘草廢渣中總黃酮的工藝。［方法］以靜態(tài)吸附試驗比較D101B、AB-8、DM-130這3種大孔吸附樹脂對甘草廢渣中總黃酮的吸附量和解吸率，篩選最優(yōu)樹脂。采用單因素試驗篩選動態(tài)吸附過程中樣液濃度、上樣速度、上樣體積、20%乙醇洗脫體積、洗脫劑濃度、洗脫劑體積。［結(jié)果］AB-8大孔樹脂用于分離純化甘草廢渣中總黃酮效果最佳，樣液濃度為2.345～3.126 mg/mL，上樣速度為1.0～1.5 mL/min，上樣體積為64 mL，20%乙醇洗脫體積為5 BV，80%乙醇洗脫體積為4 BV。經(jīng)過該純化工藝總黃酮濃度從15.63%提升至65.68%。［結(jié)論］該方法適用于甘草廢渣中總黃酮的初步分離純化。

關(guān)鍵詞 大孔吸附樹脂；分離純化；甘草廢渣；總黃酮；工藝

中圖分類號 R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2024）08-0159-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.08.037

Study on the Process of Separating and Purifying Total Flavonoids from Licorice Waste Residue Using Macroporous Resin

FAN Bo1，SHU Quan-yong2，LI Zong-lin3 et al

（1.Shaanxi Pharmaceutical Holding Group Co.， Ltd.， Xian，Shaanxi 710075;2.Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712099;3. Shaanxi Pharmaceutical Holding Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Xian，Shaanxi 710075）

Abstract ［Objective］To develop a process for separating and purifying total flavonoids from licorice waste residue using macroporous resin.［Method］Comparing the adsorption capacity and desorption rate of D101B， AB-8 and DM-130 for total flavonoids to screen the optimal resin.Single factor experiments were used to screen the sample concentration， sample flow rate， sample volume， 20% ethanol elution volume， eluent concentration and eluent volume during the dynamic adsorption process.［Result］AB-8 macroporous resin had the best separation and purification effect for total flavonoids in licorice waste residue. The sample concentration was 2.345-3.126 mg/mL， the sample flow rate was 1.0-1.5 mL/min， and the sample volume was 64 mL，20% ethanol elution volume was 5 BV， and 80% ethanol elution volume was 4 BV. After this purification process， the total flavonoid concentration increased from 15.63% to 65.68%.［Conclusion］This method is suitable for the preliminary separation and purification of total flavonoids from licorice waste residue.

Key words Macroporous adsorption resin;Separation and purification;Licorice residue;Total flavonoids;Process

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根莖，在我國歷代本草書籍中均有記載，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛咳止痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效［1-2］。在我國，甘草是藥食同源植物之一［3］，除了作為中藥飲片應(yīng)用外，主要用來提取甘草酸及制備甘草浸膏，通過煎煮法提取后的廢渣多被丟棄，造成巨大的環(huán)境污染和資源浪費［4-8］。甘草廢渣中含有甘草素、甘草查耳酮A及光甘草定等黃酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、美白等生理活性，被廣泛應(yīng)用于保健品和化妝品中，其中光甘草定更有“美白黃金”的稱號［9-12］。目前關(guān)于甘草廢渣中總黃酮的分離純化研究較少。大孔吸附樹脂可用于中藥材中黃酮、生物堿、萜類、皂苷等常規(guī)的分離純化，具有適用范圍廣、成本低、選擇性強(qiáng)、易于再生等優(yōu)點［13-16］。該研究采用大孔吸附樹脂對甘草廢渣中總黃酮進(jìn)行分離純化，以期為該藥材的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 藥材與試劑

甘草廢渣，由陜西富捷藥業(yè)有限公司提供；蘆丁，UV測定時含量92.4%，中國食品藥品檢定研究院；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗用水娃哈哈純凈水。D101B、AB-8、DM-130 大孔樹脂，西安藍(lán)曉科技新材料有限公司。

1.2 儀器

Cary 50 Conc 紫外-可見分光光度儀（Varian）；AG135&PB3002-S電子天平（METTLER TOLEDO）；1 000 μL & 100 μL移液槍（Eppendorf）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KYC-100B臺式恒溫培養(yǎng)搖床（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草黃酮粗提物的制備

甘草廢渣100 g，經(jīng)50 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎后過2號篩備用。加70%乙醇1 500 mL，加熱回流提取1 h，過濾，濾渣加1 000 mL的70%乙醇再提取一次，合并濾液。減壓蒸餾除去溶劑，50 ℃鼓風(fēng)干燥，即得甘草黃酮粗提物。

2.2 甘草總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液制備。取蘆丁對照品20 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，備用。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

參考《中國藥典》（2020版）一部槐花藥材項下總黃酮含量測定方法［1］，精密量取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加水至3.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁試液1 mL，混勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在500 nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=13.317x-0.001 29（R2=0.999 1），線性范圍為0.008 12～0.048 72? mg/mL。

2.2.3 總黃酮含量測定方法。

取甘草黃酮粗提物約40 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加20%乙醇溶解。取1 mL置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”項下顯色操作，記錄吸光度，代入線性方程計算總黃酮含量。靜態(tài)吸附及動態(tài)吸附試驗得到的醇溶液取適量定容至線性范圍，同法顯色測定，計算總黃酮含量。

2.2.4 精密度試驗。

取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中第3份溶液（濃度0.022 mg/mL），在500 nm波長下測定吸光度6次，計算RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗。

取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中第3份溶液（濃度0.022 mg/mL），分別于0、5、10、15、20、25、30 min在500 nm波長下測定吸光度，計算RSD為1.32%，表明樣品顯色后在30 min之內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗。取甘草黃酮粗提物6份，每份約40 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加20%乙醇溶解。取1 mL 置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”項下顯色操作，記錄吸光度，代入線性方程計算總黃酮含量，6份樣品含量RSD為2.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率。分別取甘草黃酮粗提物6份，每份約20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，分別精密加入蘆丁對照品溶液5 mL，搖勻溶解后，加20%乙醇溶液定容至刻度。取1 mL 置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”項下顯色操作，記錄吸光度，代入線性方程計算總黃酮含量，6份樣品平均回收率為97.63%，RSD為2.32%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 大孔吸附樹脂預(yù)處理

取D101B、AB-8、DM-130 大孔樹脂適量，投入燒杯中，加95%乙醇浸泡24 h，過濾，用95%乙醇反復(fù)清洗，直至乙醇液加水不渾濁。接著用純化水沖洗，直到無明顯的乙醇?xì)馕?。然后?%氫氧化鈉溶液將樹脂浸泡2～4 h，將堿液過濾，用純化水沖洗至水接近中性。再用4%鹽酸溶液將樹脂浸泡2～4 h，將酸液過濾，用純化水沖洗至水接近中性，抽干備用。

2.4 靜態(tài)吸附研究

2.4.1 樹脂篩選。

取甘草黃酮粗提物5 g，精密稱定，共6份，分別置100 mL錐形瓶中，加入50 mL 20%乙醇超聲溶解至無明顯顆粒物。稱取預(yù)處理的3種樹脂各5 g，平行2份，置錐形瓶中，密塞。將錐形瓶置恒溫?fù)u床中振蕩24 h（20 ℃，120 r/min），過濾，20%乙醇沖洗樹脂并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，測定總黃酮含量，計算樹脂吸附量：吸附量=（C0V0－C1V1）/M，式中，C0 、C1分別為初始濃度、吸附后濾液濃度，V0、V1分別為吸附前溶液體積、吸附后溶液體積，M為樹脂質(zhì)量。將樹脂抽干，置100 mL錐形瓶中，加入50 mL乙醇，同上操作，進(jìn)行靜態(tài)解吸附試驗，計算解吸率：解吸率=C2V2/（C0V0－C1V1）×100%，式中，C2 、V2分別為解吸附后總黃酮濃度和溶液體積。結(jié)果見表1，由表1可見AB-8樹脂對甘草黃酮的吸附量和解吸率均較高，因此選擇AB-8樹脂對甘草黃酮粗提物進(jìn)行分離純化。

2.4.2 靜態(tài)吸附曲線繪制。

取甘草黃酮粗提物5 g，共3份，分別置100 mL錐形瓶中，加入50 mL 20%乙醇超聲溶解至無明顯顆粒物。取AB-8樹脂加入錐形瓶中，密塞，將錐形瓶置恒溫振蕩器中振蕩（20 ℃，120 r/min），分別于1、2、3、4、5、6 h精密量取液體1 mL測定總黃酮濃度，計算吸附量。以時間為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)吸附曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，5 h甘草總黃酮達(dá)到吸附平衡。

2.5 動態(tài)吸附研究

2.5.1 樹脂動態(tài)吸附容量研究。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。取甘草黃酮粗提物8 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上樣，每20 mL（1個柱體積，用1 BV表示）收集一份流出液，測定總黃酮含量。以流出液體積為橫坐標(biāo)、總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制總黃酮動態(tài)吸附容量曲線，如圖2所示。20 mL樹脂可處理4 BV的料液而不發(fā)生泄露（以流出液濃度為上樣濃度1/10為泄露標(biāo)準(zhǔn)），此時樹脂床共吸附甘草總黃酮249.23 mg，即泄露前AB-8樹脂對甘草總黃酮的動態(tài)吸附容量為12.46 mg/mL。達(dá)到飽和時可處理8倍樹脂體積量，吸附容量可達(dá)17.09 mg/mL。當(dāng)上樣濃度為3.13 mg/mL，第4份流出液濃度為0.293 mg/mL，以此確定上樣體積為80 mL，實際操作取80%作為上樣體積，即64 mL。

2.5.2 上樣濃度對動態(tài)吸附的影響。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，共5份，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。分別精密稱取甘草黃酮粗提物2、4、6、8、10 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上樣5 BV，用20%乙醇沖洗，合并水洗液及流出液，搖勻，測定總黃酮吸附質(zhì)量。由圖3可知，總黃酮吸附質(zhì)量隨著上樣濃度增加而增加，當(dāng)上樣濃度為2.345 mg/mL后，動態(tài)吸附質(zhì)量增加變緩。由于上樣液濃度太低，樹脂吸附飽和時間較長，而太高又會過早泄露或出現(xiàn)固體析出的問題，因此，最終確定上樣濃度為2.345～3.126 mg/mL。

2.5.3 上樣速度對動態(tài)吸附的影響。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，共5份，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。分別精密稱取甘草黃酮粗提物6 g，共5份，加400 mL 20%乙醇溶解，分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min流量上樣，測定總黃酮濃度，計算泄露前總黃酮吸附質(zhì)量。結(jié)果見圖4。流速過小，樹脂吸附達(dá)到飽和所需時間較長，過大則提早泄露，樹脂吸附容量小，由此確定上樣流速為1.0～1.5 mL/min。

2.5.4 20%乙醇洗脫體積考察。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。取甘草黃酮粗提物6 g，精密稱定，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上樣64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，每一個柱體積（1 BV）收集一份洗脫液，測定總黃酮濃度，當(dāng)濃度為上樣濃度1/10時，即可終止20%乙醇洗脫。試驗結(jié)果顯示5 BV 20%乙醇洗脫較為合適。

2.5.5 洗脫劑濃度對解吸率的影響。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。稱取甘草黃酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min流量上樣64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脫5 BV，然后分別以50%、60%、70%、80%、95%乙醇洗脫1 BV，分別收集洗脫液，測定總黃酮濃度，計算總黃酮解吸率及累積解吸率。從圖5可以看出，80%乙醇能洗脫出絕大部分甘草總黃酮，因此選擇80%乙醇作為解析溶劑。

2.5.6 動態(tài)解吸曲線繪制。

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。稱取甘草黃酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上樣64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脫5 BV，然后以80%乙醇洗脫，每0.5 BV收集一份洗脫液，測定總黃酮濃度，以柱體積為橫坐標(biāo)、甘草總黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)解吸曲線，如圖6所示。由圖6可知，4 BV的80%乙醇可將甘草總黃酮洗脫完全。

2.6 大孔吸附樹脂分離純化甘草總黃酮工藝驗證試驗

取預(yù)處理的AB-8樹脂20 mL，精密稱定，共3份，以20%乙醇為溶劑濕法裝柱。稱取甘草黃酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，分別以1.0 mL/min 流量上樣64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脫5 BV，然后以80%乙醇洗脫4 BV，收集洗脫液，減壓干燥，得甘草總黃酮。結(jié)果如表2所示，AB-8樹脂分離純化甘草總黃酮的純度為65.68%，收率為89.15%，表明該純化工藝收率高，穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

該研究運用大孔吸附樹脂分離純化甘草廢渣中的總黃酮，確定的最佳分離純化工藝為：20 mL AB-8型大孔吸附樹脂，甘草黃酮粗提物以20%乙醇溶解，上樣體積為64 mL，濃度為2.345～3.126 mg/mL，上樣速度為1.0～1.5 mL/min；洗脫時采用20%乙醇洗脫5 BV去除雜質(zhì)，再用4 BV 80%乙醇洗脫甘草總黃酮，最終所得總黃酮純度為65.68%。該工藝成本低廉、簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，為甘草資源的綜合利用提供了一條新的途徑。

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作者簡介 范博（1988—），男，甘肅張掖人，工程師，從事中藥及天然產(chǎn)物分離純化研究。

收稿日期 2023-07-20