• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重癥醫(yī)學(xué)科耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因型和同源性分析

    2024-05-28 07:33:10張立榮
    Journal of Hainan Medical College 2024年8期
    關(guān)鍵詞:耐藥研究

    張立榮,江 滟

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院微免教研室,貴州 貴陽 550025;2.貴州省黔東南州從江縣人民醫(yī)院檢驗科,貴州 從江 557400;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗中心微免科,貴州 貴陽 550004)

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)所致的下呼吸道感染、化膿性感染在革蘭陽性球菌感染病原菌中占比非常高,近幾年由它引起的感染死亡率逐年增高[1],在青霉素尚未研究發(fā)現(xiàn)之前,由金黃色葡萄球菌感染造成的死亡率達(dá)80%以上,然而在青霉素引入治療未達(dá)兩年,耐藥菌株陸續(xù)在各個國家及地區(qū)發(fā)現(xiàn),且數(shù)量急劇增加,現(xiàn)如今大部分醫(yī)院調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)已對青霉素耐藥率達(dá)90%以上[2]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcus aureus, MRSA)的 高 耐 藥率更是給臨床帶來了極大的治療困難,研究顯示mecA耐藥基因產(chǎn)生后而賦予菌體耐藥性,致使大部分β-內(nèi)酰胺類藥物對其治療無效[3]。同時MRSA菌株之間還存在著耐藥基因與毒力基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或綴合,導(dǎo)致菌株對多種類抗菌藥物產(chǎn)生極高的耐藥性,從而形成強大侵襲致病力[4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在美國由革蘭陽性球菌造成的多耐藥菌致死率最高的菌仍是MRSA[5,6]??咕幬锎罅渴褂门c細(xì)菌耐藥性存在必然的聯(lián)系,探討二者的相關(guān)關(guān)系旨在對臨床指導(dǎo)使用抗菌藥物有一定作用。多位點序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)是是一種重要的分子生物學(xué)分析方法,對新出現(xiàn)的不同抗生素耐藥菌株,及毒力、與抗原相關(guān)的特殊基因型,起重要研究作用[7]。

    本研究擬對貴州省從江縣人民醫(yī)院(以下簡稱該院)重癥醫(yī)學(xué)科下呼吸道分離的SA 的耐藥變遷情況進(jìn)行回顧性分析,并對其中40 株MRSA 的耐藥基因進(jìn)行檢測及同源性分析以期為臨床用藥和醫(yī)院感染控制提供有效的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 患者一般資料

    表1 年齡、性別與感染人數(shù)的關(guān)系Tab 1 The relationship between age, gender, and number of infected individuals

    1.2 實驗菌株

    收集該院重癥醫(yī)學(xué)科2018 年1 月~2021 年12月下呼吸道感染患者痰液、血液標(biāo)本分離出的40 株MRSA。本研究經(jīng)貴州省從江縣人民醫(yī)院倫理委員會通過,患者均知情同意并簽署知情同意書。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 VITEK2-compact 微生物分析儀對菌株進(jìn)行鑒定及藥敏,儀器法得到的藥敏試驗結(jié)果結(jié)合手工藥敏法分析所有藥敏結(jié)果,得到的藥敏結(jié)果以美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會最新標(biāo)準(zhǔn)作結(jié)果判斷[9]。

    1.3.2 MRSA 的判定 將30 μg 頭孢西丁藥敏紙片貼于已接種好SA 的MH 平板上,經(jīng)35 ℃培養(yǎng)16~18 h 后 觀 察,抑 菌 圈 直 徑≤21 mm 即 可 判 定 為MRSA。

    1.3.3 耐藥基因檢測 按天根生化試劑公司提供的細(xì)菌DNA 試劑盒操作方法而提取到SA 的DNA,引物的設(shè)計借鑒文獻(xiàn)[10],從而合成SA 的3 種耐藥基因(mecA、SCCmec、femB) 及耐消毒劑基因(qacA/B),引物信息見表2。

    表2 基因引物擴(kuò)增序列Tab 2 Primer sequences

    1.3.4 同源性分析 從pubMLST 網(wǎng)站上(https://pubmlst.org/bigsdb? db=pubmlst-abaumannii_seqdef)查詢并獲得SA 的管家基因,PCR 法擴(kuò)增上述管家基因部分基因片段,得到的PCR 產(chǎn)物送至第三方測序公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果按順序依次輸入MLST 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中。從而得到每株菌相對應(yīng)的序列型。

    管家基因引物設(shè)計參考文獻(xiàn)[11],引物信息分別見于見表3。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃變 性30 s,57 ℃退 火 1.5 min,共 進(jìn) 行30 個 循環(huán),最后72 ℃延伸1.5 min。

    表3 金黃色葡萄球菌管家基因引物擴(kuò)增序序列Tab 3 Primer amplified sequence of housekeeper gene of Staphylococcus aureus

    1.4 同一克隆菌株判定標(biāo)準(zhǔn)

    運用凝膠圖像分析系統(tǒng),作電泳條帶識別分析,將數(shù)據(jù)整理后,運用eBURST 軟件、MEGA7.0軟件進(jìn)行遺傳相關(guān)信息分析,判斷7 個管家基因型中的6 個基因型相同即為同一流行克隆群,包含3個及以上ST 型的克隆群為1 個克隆復(fù)合體(Clonal complex, CC)[12]。

    騰訊與武漢市公安局交通管理局?jǐn)y手打造了全國第一個24小時不打烊、全年無休的無人警局,在無人警局中肉眼驗證身份證的方法已經(jīng)被淘汰,只用刷臉便可入場和辦理業(yè)務(wù)。此外,無人警局還提供智慧化服務(wù)。如智慧管家能精準(zhǔn)推送駕駛證、機動車、違法及事故等相關(guān)信息,還能提供智能引導(dǎo)及交通出行服務(wù);智能客服小微24小時在線答疑,特別繁瑣問題還可以通過觸摸一體機視頻直接與警員溝通處理。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

    運用SPSS29.0 軟件中的統(tǒng)計學(xué)方法皮爾遜相關(guān)性分析(Peason Correlation)分析細(xì)菌耐藥率與各類抗菌藥物用藥頻率的關(guān)系,P<0.05 表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,存在相關(guān)關(guān)系,>0 表示為正相關(guān),負(fù)數(shù)表示為負(fù)相關(guān)。r>0.8 表示耐藥率與DDDs 明顯相關(guān),0.4~0.6 為中等程度相關(guān)關(guān)系,r<0.4 為不存在相關(guān)關(guān)系。

    2 結(jié)果

    2.1 標(biāo)本分布情況

    2018~2021 年ICU 下呼吸道感染共分離出637株SA,其中以痰液標(biāo)本占比最高,共分離出226 株(35.48%),全血112 株(17.58%),胸水中共分離出107 株(16.8%),肺 泡 灌 洗 液 共 分 離 出86 株(13.5%),肺膿腫穿刺液共分離出59 株(9.26%),其他標(biāo)本共分離出47 株(7.38%),見表4。

    表4 2018 年-2021 年金黃色葡萄球菌標(biāo)本分布情況Tab 4 Distribution of Staphylococcus aureus specimens from 2018 to 2021

    2.2 耐藥變遷情況

    SA 耐藥變化情況顯示連續(xù)4 年青霉素耐藥率均高于92%以上,居高不下。四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明4 年平均耐藥率分別為40.19%、34.22%、33.90%。苯唑西林平均耐藥率為20.04%,奎奴普丁/達(dá)福普丁平均耐藥率僅有3.61%。耐藥趨勢顯示四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明耐藥率在2019 年有所下降后卻又再次持續(xù)升高。紅霉素、苯唑西林、左氧氟沙星、奎奴普丁/達(dá)福普丁的耐藥率呈現(xiàn)逐年增長趨勢。耐藥情況見表5。

    表5 2018-2021 年金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]Tab 5 Resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics in 2018~2021[n(%)]

    2.3 各抗菌藥物的DDDs

    2018~2021 年左氧氟沙星的DDDs 位于榜首,其次為頭孢類抗菌藥物(頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林),青霉素、慶大霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、苯唑西林呈下降趨勢,萬古霉素、替加環(huán)素、頭孢曲松呈上升趨勢。見表6。

    表6 2018-2021 年常用抗菌藥物的DDDsTab 6 DDDs of common antibacterial drugs in 2018-2021

    2.4 耐藥率與各抗菌藥物的DDDs 的相關(guān)性

    相關(guān)性分析表明,SA 對苯唑西林耐藥率與苯唑西林DDDs 存在明顯正相關(guān),SA 對左氧氟沙星耐藥率與左氧氟沙星DDDs 存在明顯正相關(guān),SA 對克林霉素耐藥率與復(fù)方新諾明DDDs 存在明顯負(fù)相關(guān),其他抗菌藥物耐藥率與各藥物DDDs 相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。見表7。

    表7 金黃色葡萄球菌耐藥率與常用抗菌藥物DDDs 的相關(guān)性Tab 7 Correlation between drug resistance rate of Staphylococcus aureus and DDDs

    2.5 耐藥基因檢測結(jié)果

    40 株MRSA 的mecA基 因 檢 出39 株 占 比97.5%(39/40),SCCmec基因、femB基因檢測結(jié)果為陰性。6 株菌檢出耐消毒劑qacA/B基因,占比15%(6/40),mecA、qacA/B基因共同檢出5 株,占比12.5%(5/40)具體情況見表8,部分電泳結(jié)果見圖1、2。

    圖1 mecA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Electrophoresis of mecA gene amplification products

    圖2 qacA/B 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Electrophoresis of qacA/B gene amplification products

    表8 40 株MRSA 耐藥基因檢測結(jié)果Tab 8 Detection results of drug resistance genes of 40 MRSA strains

    2.6 MLST 分型結(jié)果

    40 株MRSA 各管家基因測序結(jié)果經(jīng)與Pubmlist 數(shù)據(jù)庫比對,得到的數(shù)據(jù)顯示共得到7 個序列型,占比最高的型別為ST59 型,其后占比從高到低依次為ST45 型,ST239 型、ST28 型、ST188 型、ST1型和ST630 型。8 株ST59 型菌株來源于不同時間不同病人,5 株源于同一時間不同病人同屬ST59型。4 株ST59、5 株ST45 型源于不同時間段的不同病人,表明該院存在科內(nèi)克隆菌株,在不同病人間的傳播和流行。分型結(jié)果見表9。

    表9 MRSA 多位點序列分型結(jié)果Tab 9 Results of MRSA multiple-point sequence typing

    2.7 基于eBURST 算法的進(jìn)化分析

    遺傳學(xué)上將序列有所差異但存在相關(guān)性的集合稱之為克隆復(fù)合體,其中CC 中的核心ST 型是相對流行的型別,可由其衍生出許多與它相關(guān)的親緣性型別,eBURST 軟件將3 個及3 個以上ST 分型推算為一個CC,其中包含一個最原始的ST 型,其余2個或以上ST 型為其親緣型別。運用e BURST 軟件對40 株MRSA 實驗菌株進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果顯示7 個ST 型共形成一個克隆型,即(ST239-ST630),及5 個獨特型(ST1、ST28、ST45、ST188、ST59)。所有試驗菌株未能形成1 個CC,僅有ST239 和ST630 存在一個點位變異,未發(fā)現(xiàn)第三個存在兩點變異的ST 型,所以未能形成一個CC。將40 株MRSA 實驗菌株與國際MRSA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),ST1、ST239、ST188、ST630 同屬與CC5家族,ST45 歸屬于CC45 家族,本研究中的40 株MRSA 中 的ST45 為 該 家 族 的 祖 先,ST59 歸 屬 于CC59 家族,本研究中的40 株MRSA 中的ST45 為該家族的祖先。

    2.8 分離株遺傳進(jìn)化分析

    遺傳學(xué)上常將遺傳的多樣性通過遺傳距離來作為基準(zhǔn),從而表達(dá)群體演化過程及群體遺傳的差異性,如遺傳距離較小,種群的分化時間則較短,遺傳距離越遠(yuǎn),則分化時間更長。運用MEGA7.0 軟件對菌株的等位基因譜作進(jìn)化分析,據(jù)核酸序列上的STs 的進(jìn)化距離從而繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹圖(如圖3 所示),從進(jìn)化樹圖中可以看出,對于有互相有單位點變異的ST239 與ST630、ST1 與ST188,其 親緣關(guān)系相近。表明菌株在進(jìn)化時,大多數(shù)時候保持遺傳的相對穩(wěn)定性(即進(jìn)化得出的ST 型一致),但也可能出現(xiàn)多位點的變異,致使細(xì)菌基因呈現(xiàn)多態(tài)性。

    圖3 MEGA 分析構(gòu)建40 株MRSA 的進(jìn)化樹Fig 3 Evolution tree of 40 MRSA strains analyzed and constructed by MEGA

    3 討論

    SA 是呼吸道和皮膚的定植菌,是引起化膿性感染的主要病原菌,可導(dǎo)致局部感染如癤或癰甚至全身性感染[13]。MRSA 為世界衛(wèi)生組織重點關(guān)注的多重耐藥菌株對象之一,因其高耐藥性及高傳播能力,易集中爆發(fā)于重癥監(jiān)護(hù)室下呼吸道感染患者,臨床抗感染治療困難,患者病死率高[14]。

    本研究中SA 對呋喃妥因耐藥率僅為0.9%(6/637),對利奈唑胺、替加環(huán)素、萬古霉素完全敏感。這一點和省內(nèi)某醫(yī)院、南方福建,北方遼寧某醫(yī)院一致,均未發(fā)現(xiàn)三者的耐藥菌株,本研究出現(xiàn)23 株奎奴普丁耐藥株,耐藥率為3.61%[15-18],同比成都地區(qū)4 年內(nèi)耐藥率有所不同,該地區(qū)奎奴普丁耐藥率為0[19]。利福平、利奈唑胺敏感性較好。呋喃妥因常應(yīng)用于尿路感染,不建議治療下呼吸道感染[20],因此替加環(huán)素、萬古霉素以及利奈唑胺推薦使用。MRSA 所致的感染性疾病以四環(huán)素類、糖肽類/脂肽類抗生素、喹努普汀/達(dá)福普、復(fù)方新諾明推薦使用,呋喃妥因不推薦。本研究結(jié)果提示除傳統(tǒng)經(jīng)驗藥物外,其對利福平以及慶大霉素敏感性亦較高。

    該院主要以頭孢類抗生素及青霉素類使用率最高,其中頭孢類抗生素以頭孢曲松作為代表作抗生素,其使用率最高,兩類抗生素用藥頻率呈現(xiàn)逐年增長趨勢,臨床對這兩類抗生素的偏向性選擇明顯,可能主要原因是青霉素類抗生素屬廣譜抗生素且為初級抗生素,是臨床中抗感染的首選藥物,頭孢類抗生素因其抗菌活性較青霉素類更強,且過敏反應(yīng)少等原因,逐漸成為青霉素抗感染失敗后的首選藥物,因此二者使用率一直居高不下,提示現(xiàn)階段臨床抗感染藥物選擇主要為青霉素類及頭孢類。

    細(xì)菌耐藥變遷可能有多方面原因,SA 耐藥率與各抗菌藥物用藥頻率的相關(guān)性分析顯示,大部分藥物耐藥率與自身藥物DDDs 無相關(guān)性,部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯正相關(guān),部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯負(fù)相關(guān),這與有關(guān)報道是一致的[21]。SA 對苯唑西林的產(chǎn)生抗藥的機理是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶及產(chǎn)生了除PBP2a的另外一種低親和力PBPs 導(dǎo)致耐藥,左氧氟沙星抗菌作用主要是以抑制細(xì)菌DNA 活性,從而致使細(xì)菌DNA 無法復(fù)制及合成而死亡,SA 對苯唑西林、左氧氟沙星耐藥率與各自用藥頻率存在明顯正相關(guān),藥物使用頻率越高,越容易導(dǎo)致SA 對這兩種藥物產(chǎn)生耐藥性??肆置顾氐哪退幝逝c復(fù)方新諾明用藥頻率存在明顯負(fù)相關(guān),復(fù)方新諾明用藥頻率高可能會使克林霉素的耐藥率低,表明藥物的應(yīng)用與細(xì)菌耐藥性關(guān)系比較復(fù)雜,存在相互交叉作用。本研究中有部分藥物使用頻率DDDs 與SA 耐藥性無相關(guān)關(guān)系,可能與本研究未涉及到的一些耐藥變遷因素有關(guān),有待更進(jìn)一步研究。

    據(jù)報道青霉素結(jié)合蛋白PBP2a 對β-酰胺酶類抗生素的親和力極低,是導(dǎo)致MRSA 多耐藥的主要原因,而mecA是編碼PBP2a 蛋白最重要的基因結(jié)構(gòu),因此mecA基因的攜帶率導(dǎo)致了MRSA 多耐性的產(chǎn)生[22]。多數(shù)研究提示mecA基因檢測法測定MRSA的準(zhǔn)確為96.83%,這種基因檢測方法比起傳統(tǒng)的苯唑西林紙片法更簡單、更快速、更準(zhǔn)確。因此,此檢測方法在我院更值得提倡及推廣,使MRSA 檢測更快速高效,更好的為臨床提供藥敏指導(dǎo)[23]。研究所收集的40 株MRSA 中mecA基因占比97.5%,和多數(shù)文獻(xiàn)報道一致[24,25]。MRSA 中若檢出mecA基因則提示均對青霉素、頭孢菌素以及單環(huán)酰胺類高度耐藥,本研究與上述學(xué)者研究結(jié)果基本吻合。40 株MRSA 中未發(fā)現(xiàn)攜帶SCCmec、fem耐藥基因菌株,這可能與本次收集的數(shù)量不足有關(guān)。

    國外學(xué)者指出[26]SA 攜帶耐消毒劑基因后即對普通消毒劑產(chǎn)生耐性,而致使其無法被殺滅,其中耐消毒劑基因qacA/B對季胺類、胍類及腙類消毒劑抗性表現(xiàn)最為明顯,是導(dǎo)致近幾年來MRSA 對這幾類消毒劑抗性增加的主要原因[27]。東北地區(qū)燒傷患者的qacA/B基因的攜帶率為86.32%[28],高于馬來西亞某醫(yī)院對報道的qacA/B攜帶率為53.13%,丁新玲等[29]報道的MRSA 菌株qacA/B基因攜帶率為56%,而MSSA 的qacA/B基因攜帶率稍低,攜帶率為41%,伊朗某省對MRSA 及MSSA菌株qacA/B基因攜帶率亦是不同,分別為68%、58.2%[30],表明多地區(qū)關(guān)于qacA/B基因存在顯著性地區(qū)差異,及標(biāo)本類型之間的差異,MRSA 攜帶率高于MSSA。40 株MRSA 中發(fā)現(xiàn)6 株攜帶有qacA/B基因,攜帶率為15%,攜帶率雖低于部分地區(qū)報道,標(biāo)本主要收集于ICU 下呼吸道感染標(biāo)本,可能與收集標(biāo)本類型不夠全面有關(guān),但依然存在對抗性增加的風(fēng)險。ICU 內(nèi)的消毒劑使用高于普通科室,尤其多使用氯類、季胺類和醛類消毒劑,而qacA/B基因主要使細(xì)菌增加上述消毒劑的抗性。普通常規(guī)方法無法檢測出菌株是否攜帶qacA/B基因,需采用PCR 法才能檢測出菌株是否攜帶耐消毒劑基因qacA/B基因,因此定期收集耐藥或敏感菌掌握qacA/B基因攜帶情況。有利于了解本地區(qū)攜帶耐消毒劑MRSA 菌株的分子流行病學(xué)情況,從而合理規(guī)范消毒劑的使用。

    本研究仍存在一些不足之處,如數(shù)據(jù)資料收集到得標(biāo)本數(shù)偏小,可能研究結(jié)果會造成偏倚,還需要加大菌株數(shù)量的收集及增加更長年限來更好的驗證本結(jié)論;此外,研究僅對耐消毒劑qcaA/B 基因進(jìn)行了檢測,尚不能表明MRSA 未攜帶有耐消毒劑的其它基因。

    MRSA 菌株的克隆群存在地區(qū)性差異,美國常見型別主要是ST1 和ST8,歐洲多以ST80 為常見型 別,而 亞 洲 國 家 則 多 以ST30、ST59 型 為 主[31]。本次研究的40 株MRSA 經(jīng)MLST 分型結(jié)果顯示,ST59 型菌株是我院重癥醫(yī)學(xué)科主要的流行菌株,占比為42.5%(17/40),與亞洲部分報道一致。2000年以前我國的主要流行型別為ST239-t030-SCCmecIII,2000 以 后 主 要 以ST239-t037-SCCmecIII 為主,目前國內(nèi)主要流行的型別主要以ST239 和ST59 為主[32],本實驗研究與其基本一致。本研究中檢出的ST188、ST45 這一型別在韓國及國內(nèi)的廣州相關(guān)研究中也有發(fā)現(xiàn),其他型別檢出量較少[33,34]。表明ST59、ST45 兩種型別可能同為重癥監(jiān)護(hù)室克隆株的總趨勢,并且會造成科內(nèi)傳播的風(fēng)險。臨床醫(yī)師及醫(yī)院感控部門應(yīng)引起高度重視,及時隔離MRSA 感染病人,采取相應(yīng)措施減少科內(nèi)流行克隆株的傳播。

    作者貢獻(xiàn)度說明:

    張立榮:查詢并整理相關(guān)課題文獻(xiàn),建立課題研究方案,對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與相關(guān)統(tǒng)計分析,撰寫論文;江滟:研究選題推薦,為試驗提供技術(shù)或材料支持,全篇論文的指導(dǎo)性支持。

    所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。

    猜你喜歡
    耐藥研究
    如何判斷靶向治療耐藥
    Ibalizumab治療成人多耐藥HIV-1感染的研究進(jìn)展
    FMS與YBT相關(guān)性的實證研究
    miR-181a在卵巢癌細(xì)胞中對順鉑的耐藥作用
    2020年國內(nèi)翻譯研究述評
    遼代千人邑研究述論
    超級耐藥菌威脅全球,到底是誰惹的禍?
    視錯覺在平面設(shè)計中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    新版C-NCAP側(cè)面碰撞假人損傷研究
    国产精品一区二区免费欧美| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 男女之事视频高清在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲美女视频黄频| 丝袜美腿在线中文| 91麻豆av在线| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 深爱激情五月婷婷| 99热6这里只有精品| 久久人妻av系列| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美激情久久久久久爽电影| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美在线一区亚洲| 九九爱精品视频在线观看| 日韩国内少妇激情av| 午夜免费成人在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99热6这里只有精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 999久久久精品免费观看国产| 热99在线观看视频| 在线观看午夜福利视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本 av在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产单亲对白刺激| 亚洲性久久影院| 午夜福利在线在线| 乱人视频在线观看| 成人二区视频| 少妇高潮的动态图| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美在线一区亚洲| 中文在线观看免费www的网站| 国产乱人伦免费视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 看黄色毛片网站| 国产精品综合久久久久久久免费| or卡值多少钱| 干丝袜人妻中文字幕| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费看a级黄色片| a级毛片a级免费在线| 精品人妻熟女av久视频| 91在线观看av| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本免费a在线| 国产69精品久久久久777片| 在线播放无遮挡| 最好的美女福利视频网| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜a级毛片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产中年淑女户外野战色| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲美女黄片视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 如何舔出高潮| 亚洲专区国产一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩欧美精品免费久久| 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利18| 免费大片18禁| 亚洲美女搞黄在线观看 | 免费av毛片视频| 精品久久久久久久末码| 久久久久久久亚洲中文字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| a级毛片a级免费在线| 亚洲人与动物交配视频| 不卡视频在线观看欧美| 99热网站在线观看| 久久久国产成人免费| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 一夜夜www| 中出人妻视频一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 十八禁网站免费在线| 1024手机看黄色片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国产亚洲精品久久久com| 免费人成在线观看视频色| 亚洲 国产 在线| 淫秽高清视频在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| xxxwww97欧美| 黄色日韩在线| 亚洲内射少妇av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲无线观看免费| 99久久精品热视频| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 一进一出好大好爽视频| 国产淫片久久久久久久久| 麻豆一二三区av精品| 国产av在哪里看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一区二区在线av高清观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成年免费大片在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 香蕉av资源在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩欧美在线乱码| 日韩欧美精品v在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 九九爱精品视频在线观看| 熟女电影av网| 亚洲最大成人av| 成人鲁丝片一二三区免费| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 99精品久久久久人妻精品| 看黄色毛片网站| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲av免费高清在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日本一二三区视频观看| 欧美潮喷喷水| 日韩中字成人| 国产美女午夜福利| 亚洲色图av天堂| 久久中文看片网| 在线免费十八禁| 国产精品不卡视频一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久九九热精品免费| av专区在线播放| 最好的美女福利视频网| 久久九九热精品免费| 免费av观看视频| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久久久av不卡| 真人做人爱边吃奶动态| 久久久久久久久大av| 久9热在线精品视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久这里只有精品中国| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av.av天堂| 久99久视频精品免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| www.色视频.com| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线免费观看的www视频| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | eeuss影院久久| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲精品av在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久久色成人| 婷婷亚洲欧美| 舔av片在线| 国产av一区在线观看免费| 久久久久久九九精品二区国产| 免费观看人在逋| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色在线成人网| 久99久视频精品免费| 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 九色国产91popny在线| 波多野结衣高清无吗| 欧美黑人巨大hd| 看片在线看免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成年人精品一区二区| 在线看三级毛片| 欧美区成人在线视频| 亚洲无线在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区三区高清视频在线| 嫩草影院入口| 国产探花极品一区二区| 亚洲国产欧美人成| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 性欧美人与动物交配| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 九九热线精品视视频播放| 99久久成人亚洲精品观看| 此物有八面人人有两片| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本熟妇午夜| 露出奶头的视频| 日本在线视频免费播放| 午夜福利18| 久久久色成人| 少妇高潮的动态图| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品福利在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 日本成人三级电影网站| 久久久久久久精品吃奶| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 无人区码免费观看不卡| av天堂中文字幕网| 岛国在线免费视频观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| avwww免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产午夜福利久久久久久| 国产高清有码在线观看视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 91久久精品国产一区二区三区| 99久久成人亚洲精品观看| av在线观看视频网站免费| 国产成人影院久久av| 国产精品亚洲美女久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 别揉我奶头 嗯啊视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 能在线免费观看的黄片| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久久久久久大av| 国产单亲对白刺激| av中文乱码字幕在线| 久久久色成人| 欧美三级亚洲精品| 一夜夜www| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品456在线播放app | 一级av片app| 日韩国内少妇激情av| 国产精品一及| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人国产综合亚洲| 亚洲内射少妇av| 一本精品99久久精品77| 一区福利在线观看| 久久草成人影院| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 露出奶头的视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久久久久大av| 91麻豆av在线| 国产一区二区三区av在线 | 午夜福利视频1000在线观看| 黄色日韩在线| 亚洲国产精品成人综合色| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 色5月婷婷丁香| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄色欧美视频在线观看| 久久中文看片网| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲美女黄片视频| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲电影在线观看av| 男女视频在线观看网站免费| 色综合色国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女边吃奶边做爰视频| 国产激情偷乱视频一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 久久久精品大字幕| 十八禁网站免费在线| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久久久大av| 中文字幕免费在线视频6| 午夜福利18| 在线免费观看不下载黄p国产 | 夜夜夜夜夜久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 99久久九九国产精品国产免费| 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕av在线有码专区| 国产成年人精品一区二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产一区二区在线观看日韩| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品人妻视频免费看| 两人在一起打扑克的视频| 日韩一本色道免费dvd| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲最大成人手机在线| 免费在线观看影片大全网站| 午夜爱爱视频在线播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 国内精品久久久久久久电影| 午夜福利在线在线| 成年免费大片在线观看| 精品人妻视频免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利在线在线| 日本黄色片子视频| 91av网一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 又粗又爽又猛毛片免费看| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利高清视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 22中文网久久字幕| 很黄的视频免费| 国产三级中文精品| 久久99热6这里只有精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产高潮美女av| 美女cb高潮喷水在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 男女视频在线观看网站免费| 国产老妇女一区| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色一级大片看看| 毛片一级片免费看久久久久 | 俄罗斯特黄特色一大片| 一个人看视频在线观看www免费| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品亚洲美女久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 18+在线观看网站| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲国产精品成人综合色| 色综合色国产| 性色avwww在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 真人一进一出gif抽搐免费| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 日韩一本色道免费dvd| 三级毛片av免费| 日日啪夜夜撸| 最新在线观看一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 老司机福利观看| 少妇丰满av| 欧美极品一区二区三区四区| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文在线观看免费www的网站| 我的女老师完整版在线观看| 国内精品久久久久精免费| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲av五月六月丁香网| 久久亚洲真实| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精华一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 51国产日韩欧美| 欧美+亚洲+日韩+国产| 简卡轻食公司| 97碰自拍视频| 美女高潮的动态| 亚洲美女黄片视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久这里只有精品中国| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品,欧美在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 九色成人免费人妻av| 赤兔流量卡办理| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产亚洲精品av在线| 日本免费a在线| 国产毛片a区久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产熟女欧美一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 久久99热这里只有精品18| 观看免费一级毛片| 成年女人永久免费观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| av天堂中文字幕网| 最近在线观看免费完整版| 22中文网久久字幕| 男人狂女人下面高潮的视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 麻豆国产97在线/欧美| 在线观看舔阴道视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色日韩在线| 久久久国产成人免费| 波多野结衣高清无吗| 一级av片app| 婷婷六月久久综合丁香| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产黄a三级三级三级人| 波多野结衣巨乳人妻| 在线观看美女被高潮喷水网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美成人一区二区免费高清观看| 12—13女人毛片做爰片一| 精品无人区乱码1区二区| 久久国产乱子免费精品| 午夜久久久久精精品| 天堂动漫精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美激情在线99| 熟女电影av网| 三级毛片av免费| 日本色播在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产一区二区在线av高清观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | av在线蜜桃| 很黄的视频免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品日产1卡2卡| 亚洲美女视频黄频| 在线播放国产精品三级| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品人妻久久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久色成人| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲不卡免费看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲性久久影院| 亚洲精华国产精华精| 成年女人看的毛片在线观看| 能在线免费观看的黄片| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲在线自拍视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 搞女人的毛片| 在线观看午夜福利视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美性感艳星| 在线a可以看的网站| 久9热在线精品视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91在线观看av| 成人无遮挡网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产视频内射| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看精品视频网站| 国产精品女同一区二区软件 | 国产成人av教育| 日本色播在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩欧美免费精品| 日本成人三级电影网站| 少妇人妻精品综合一区二区 | 在线a可以看的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99热这里只有是精品50| 黄色视频,在线免费观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产探花在线观看一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 热99re8久久精品国产| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲三级黄色毛片| 岛国在线免费视频观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 欧美zozozo另类| 悠悠久久av| 成人二区视频| 国产男人的电影天堂91| 欧美人与善性xxx| 国产精华一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| av在线老鸭窝| 午夜亚洲福利在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 夜夜夜夜夜久久久久| 色吧在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 午夜精品在线福利| www日本黄色视频网| 免费在线观看日本一区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产爱豆传媒在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 免费高清视频大片| 日韩精品中文字幕看吧| 国产美女午夜福利| 久久99热这里只有精品18| 午夜日韩欧美国产| 国产成人影院久久av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 又爽又黄a免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 婷婷精品国产亚洲av| 精品无人区乱码1区二区| 99热网站在线观看| 中文资源天堂在线| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久6这里有精品| 悠悠久久av| 精品久久久久久成人av| 成年女人永久免费观看视频| 国产黄片美女视频| av女优亚洲男人天堂| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产在线男女| 久久午夜福利片| 亚洲精品一区av在线观看| 午夜久久久久精精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日本黄大片高清| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产亚洲欧美98| 日日撸夜夜添| 国产精品野战在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线观看免费视频日本深夜| 成人鲁丝片一二三区免费| 色吧在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 69人妻影院| 国产免费一级a男人的天堂| 精品久久久久久成人av| 中文字幕熟女人妻在线| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品伦人一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 波野结衣二区三区在线| 久久精品国产亚洲网站| 精品乱码久久久久久99久播| 国产免费男女视频| 久9热在线精品视频| 99久久精品热视频| 成人永久免费在线观看视频| 午夜精品在线福利| 成人国产麻豆网| 搡老熟女国产l中国老女人| 好男人在线观看高清免费视频| 国产主播在线观看一区二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美色视频一区免费| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩欧美在线乱码| 亚洲四区av| 婷婷六月久久综合丁香| 成人永久免费在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 99热网站在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 高清日韩中文字幕在线| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产男人的电影天堂91| 免费av不卡在线播放| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品久久久久久久久av| 国产高清不卡午夜福利|