單細(xì)胞測序技術(shù)在慢性阻塞性肺疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

楊澤華，丁毅鵬

（海南省人民醫(yī)院（海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?70100）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺病，是一種異質(zhì)性肺部疾病［1］。據(jù)最新WHO 數(shù)據(jù)顯示，COPD 是全球第三大死因。并且由于我國人口老齡化、空氣污染和吸煙率的上升等原因，預(yù)計(jì)未來COPD 的患病率、死亡率和社會(huì)負(fù)擔(dān)仍會(huì)增加［2］。在COPD 的研究中，常用到基因測序。傳統(tǒng)的測序方法獲得的是細(xì)胞群體的總平均反應(yīng)，無法反映每個(gè)細(xì)胞之間的差異性，不能完全揭示疾病的發(fā)病機(jī)制等。單細(xì)胞測序（single cell sequencing，SCS）技術(shù)可以在單細(xì)胞水平上對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組等進(jìn)行測序，揭示基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)以及發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間的異質(zhì)性和稀有細(xì)胞等。目前迫切需要這項(xiàng)技術(shù)來幫助研究COPD 的發(fā)病機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)可靠的早期診斷方法和治療方法等，從而減輕疾病負(fù)擔(dān)。本文將介紹單細(xì)胞測序技術(shù)及相關(guān)進(jìn)展，并對(duì)其在COPD 研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 SCS 技術(shù)概述

1977 年，Sanger 等［3］發(fā)明了第一代基因測序技術(shù)，基因測序成為探索細(xì)胞遺傳物質(zhì)變化和疾病發(fā)展的強(qiáng)有利工具。2009 年Tang［4］首次通過單細(xì)胞RNA 測序方式實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞內(nèi)5 000 多個(gè)mRNA 表達(dá)信息的平行檢測，開啟了單細(xì)胞技術(shù)的測序時(shí)代。

SCS 技術(shù)的流程主要包括單細(xì)胞制備、文庫構(gòu)建、高通量測序和數(shù)據(jù)處理分析［5］。

單細(xì)胞制備的質(zhì)量極大影響測序分析結(jié)果，傳統(tǒng)分選方法有梯度稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選、激光顯微切割等，不僅效率低，而且容易損傷細(xì)胞。目前更多使用高通量的細(xì)胞捕獲方法，如微流控芯片捕獲等［6］。

SCS 主要包括：基因組，主要用于檢測單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異及染色體結(jié)構(gòu)變異；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，可以直觀地反映出細(xì)胞間基因表達(dá)差異；表觀遺傳組［7］，可從單細(xì)胞水平獲得甲基化水平數(shù)據(jù)，補(bǔ)充DNA 變異和RNA 表達(dá)之外的數(shù)據(jù)；蛋白質(zhì)組，可以解構(gòu)細(xì)胞群體并推斷蛋白質(zhì)豐度關(guān)系；空間轉(zhuǎn)錄組，可以描繪、分析細(xì)胞的空間位置及其在空間中的基因表達(dá)譜。多組學(xué)［8］可以全面綜合分析細(xì)胞，得到更多更全面的遺傳信息。

數(shù)據(jù)處理分析：先把數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化，然后進(jìn)行主成分分析降維，再進(jìn)行t 分布隨機(jī)鄰接嵌入或統(tǒng)一流形逼近與投影降維［9］，實(shí)現(xiàn)可視化；根據(jù)細(xì)胞的特征將大量的細(xì)胞分成不同的亞群。對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，可以了解每種細(xì)胞類型的生物學(xué)功能，揭示和理解生物學(xué)過程中的關(guān)鍵分子機(jī)制；利用擬時(shí)序分析，推斷細(xì)胞間的發(fā)展過程，可以發(fā)現(xiàn)罕見的細(xì)胞類型和隱性狀態(tài)?；谂潴w-受體數(shù)據(jù)庫和單細(xì)胞基因數(shù)據(jù)，可以分析細(xì)胞間的信息交流等［10］。

2 SCS 技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展

SCS 技術(shù)正迅速成為各種研究中不可替代的方法，已經(jīng)應(yīng)用在許多呼吸系統(tǒng)疾病的研究當(dāng)中。

呼吸系統(tǒng)疾病中肺纖維化的發(fā)病率在逐漸增加，目前的診斷和治療方法欠佳。Reyfman 等［11］通過正常和纖維化肺組織的單細(xì)胞RNA 測序，在纖維化患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的、新的促纖維化肺泡巨噬細(xì)胞群體。通過制作分析肺纖維化的單細(xì)胞圖譜，揭示了單個(gè)細(xì)胞群中纖維化基因表達(dá)的共同和不同模式并證明了肺纖維化患者肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞的異質(zhì)性。單細(xì)胞RNA 測序可以在早期疾病患者的肺樣本上進(jìn)行，這樣我們可以識(shí)別早期肺纖維化患者并進(jìn)行有效干預(yù)。

肺癌是癌癥死亡的主要原因之一，其內(nèi)部存在明顯異質(zhì)性，這種異質(zhì)性有很重要的研究意義。而SCS 技術(shù)在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間異質(zhì)性方面有很大的優(yōu)勢。Maynard 等［12］在靶向治療前和治療中，使用從30 名患者獲得的49 份臨床活檢進(jìn)行轉(zhuǎn)移性肺癌的單細(xì)胞RNA 測序，描繪的細(xì)胞圖譜揭示了復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，為肺癌的精準(zhǔn)化治療提供依據(jù)。

3 SCS 技術(shù)在COPD 中的研究進(jìn)展

3.1 COPD 的概述

COPD 以持續(xù)氣流受限為主要臨床特征，以異常的氣道炎癥為病理特征［13］。其危險(xiǎn)因素較多，首要因素是主動(dòng)吸煙或被動(dòng)接觸二手煙導(dǎo)致的煙草暴露［14］；還有職業(yè)接觸、空氣污染、生物質(zhì)燃料［15］、兒童期哮喘和既往肺部感染史以及α1-抗胰蛋白酶遺傳性缺乏等因素。

COPD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，過去研究發(fā)現(xiàn)與炎癥機(jī)制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡機(jī)制、氧化應(yīng)激機(jī)制和自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等有關(guān)［16］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA 損傷［17］、異常自噬［18］和細(xì)胞焦亡［19］與COPD 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究分析COPD 的發(fā)病機(jī)制可以為COPD 的早期診斷、預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

COPD 患者常在癥狀明顯后才就診，而此時(shí)疾病一般都發(fā)展到了中晚期，臨床干預(yù)效果差。并且目前COPD 的診斷金標(biāo)準(zhǔn)肺功能檢查［2］，需要患者的肺功能降低到一定程度才能做出診斷。同時(shí)因?yàn)榉喂δ軝z查設(shè)備成本較高，操作較復(fù)雜，需要相對(duì)嚴(yán)格和復(fù)雜的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)解讀，導(dǎo)致我國肺功能檢查率低。2018 年，COPD 患者中接受過肺功能檢查的僅占總患病人數(shù)的12%［20］。這給COPD 的預(yù)防和治療帶來了很大的困難。

3.2 COPD 的研究進(jìn)展

目前缺乏可靠的早期診斷方法，不能及時(shí)對(duì)早期COPD 進(jìn)行有效的干預(yù)。如果能篩查診斷出早期COPD 患者，并對(duì)其進(jìn)行有效的干預(yù)和治療，可以更好地減緩疾病進(jìn)展，減輕疾病負(fù)擔(dān)。當(dāng)前的治療方法無法阻止疾病的進(jìn)展，我們需要去發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，尋找更有效的治療方法。

COPD 是基因與環(huán)境相互作用導(dǎo)致的多基因疾病。NHLBI 資助的慢COPD 遺傳流行病學(xué)研究（COPDGene）是有史以來調(diào)查COPD 發(fā)展中涉及的遺傳因素的最大規(guī)模的研究之一，它對(duì)理解COPD 遺傳基礎(chǔ)至關(guān)重要。迄今為止，已有超過20個(gè)基因位點(diǎn)確定與COPD 影響狀態(tài)相關(guān)，另外一些基因位點(diǎn)顯示與COPD 相關(guān)表型如肺氣腫、慢性支氣管炎和低氧血癥相關(guān)［21］。

煙霧暴露等環(huán)境因素不能完全解釋COPD 的易感性?；诩易搴腿巳旱难芯勘砻?，COPD 風(fēng)險(xiǎn)的 很 大 一 部 分 與 遺 傳 變 異 有 關(guān)［22］，如HHIP 和FAM13A［23］。識(shí) 別 與COPD 相 關(guān) 的 遺 傳 因 素 可 能有助于解釋疾病的異質(zhì)性，評(píng)估個(gè)體易感性及預(yù)后，并確定新的個(gè)性化治療方法。單核苷酸變異對(duì)許多人類疾病和性狀都有影響，Ding 等［24］通過病例對(duì)照研究首次揭示了TLR9 和TLR2 多態(tài)性對(duì)中國人COPD 的發(fā)展具有保護(hù)作用。這些研究強(qiáng)烈表明遺傳因素是COPD 易感性的重要及實(shí)質(zhì)性因素。

Sakornsakolpat 等［25］對(duì) 來 自 英 國 生 物 庫 的35 735 例病例和222 076 例對(duì)照進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定了82 個(gè)具有全基因組顯著性的基因座。其中對(duì)表型的最大貢獻(xiàn)不是來自具有大效應(yīng)的罕見變異，而是來自許多具有小效應(yīng)的常見變異的組合效應(yīng)。這種常見疾病-常見變異模型為全基因組關(guān)聯(lián)分析提供了強(qiáng)有力的支持。COPD 中鑒定的幾十到幾百個(gè)基因座中，只有一小部分相關(guān)基因座被研究了功能效應(yīng)，如FGF7 基因在影響COPD 風(fēng)險(xiǎn)中的作用［26］和FAM13A 可能通過促進(jìn)β-catenin降解而影響COPD 的易感性［27］。此類研究通常能對(duì)COPD 的發(fā)病機(jī)制有新的發(fā)現(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)外泌體與COPD 的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，其中，環(huán)狀RNA（circRNAs）在外泌體中具有富集性和穩(wěn)定性［28］，有望成為COPD 的生物標(biāo) 志 物 或 提 供 新 的 治 療 靶 點(diǎn)。Liu［29］采 集3 例COPD 患者和3 例非COPD 患者的新鮮外周血，檢測其mRNA、miRNA、lncRNA 和CircRNA 的表達(dá)，鑒定分析其差異表達(dá)，揭示了RNA 在COPD 中的參與和潛在的調(diào)控作用，這將有助于COPD 的病理學(xué)研究和COPD 治療靶點(diǎn)的探索。其構(gòu)建的lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和CircRNA-miRNAmRNA（ceRNA）相互作用網(wǎng)絡(luò)有望為未來的COPD 研究提供有價(jià)值的信息。

3.3 SCS 技術(shù)在COPD 研究中的應(yīng)用

COPD 是一種復(fù)雜的多基因疾病，受遺傳和環(huán)境因素相互的影響。SCS 技術(shù)在COPD 中的應(yīng)用是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，目前國內(nèi)外的研究正在積極探索該技術(shù)在COPD 發(fā)病機(jī)制、病理、生理過程以及診斷和治療方面的應(yīng)用。它是一種能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)進(jìn)行測序分析的技術(shù)，可以幫助我們深入了解細(xì)胞類型、細(xì)胞功能和細(xì)胞間的相互作用等方面的細(xì)胞生物學(xué)問題，目前仍然需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證和擴(kuò)展這些發(fā)現(xiàn)，并將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。

SCS 可以幫助鑒定分析COPD 患者肺組織中的不同細(xì)胞類型，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞等，并進(jìn)一步研究分析它們?cè)贑OPD 理過程中的功能和相互作用。國內(nèi)研究報(bào)道中，彭玲等［30］利用GEO 公共數(shù)據(jù)庫中18 例COPD 患者及28例健康對(duì)照組共219 257 個(gè)肺組織單細(xì)胞RNA 測序結(jié)果，分析高內(nèi)皮細(xì)胞小靜脈（HEV）內(nèi)皮細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HEV 內(nèi)皮細(xì)胞在COPD 中升高，并具有免疫調(diào)節(jié)的作用，有望成為COPD 治療的潛在靶標(biāo)。越來越多的SCS 數(shù)據(jù)產(chǎn)生并整合到一個(gè)可公開訪問的數(shù)據(jù)庫中。這極大地促進(jìn)了COPD 的相關(guān)研究，對(duì)探索COPD 發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的治療方法有很大的幫助。

SCS 可以幫助分析COPD 患者肺組織中炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的變化。通過比較不同細(xì)胞類型中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平，可以了解COPD 炎癥反應(yīng)的機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。國外研究報(bào)道中，Sauler等［31］描繪了晚期COPD 受試者或?qū)φ辗蔚囊浦卜谓M織的單細(xì)胞RNA 測序譜并使用轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)分析，確定了COPD 中不同上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群中以前未認(rèn)識(shí)到的基因表達(dá)和細(xì)胞相互作用的變化，強(qiáng)調(diào)了COPD 中細(xì)胞損傷和炎癥的復(fù)雜性和多樣性。未來的研究的特定轉(zhuǎn)錄失調(diào)的結(jié)果將提供對(duì)導(dǎo)致疾病的機(jī)制的見解。

在COPD 發(fā)展過程中，香煙煙霧是主要危險(xiǎn)因素，它對(duì)小氣道上皮細(xì)胞有誘導(dǎo)作用，而上皮細(xì)胞損傷是COPD 重要的病理特征。SCS 可以揭示COPD 發(fā)展過程中上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制，以及相關(guān)細(xì)胞類型的功能和相互作用。Wohnhaas 等［32］利用單細(xì)胞RNA 測序揭示了以前未認(rèn)識(shí)到的小氣道上皮內(nèi)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性和對(duì)急性和慢性香煙煙霧暴露的細(xì)胞類型特異性影響。了解小氣道上皮細(xì)胞圖譜和細(xì)胞（亞）類型在煙霧暴露反應(yīng)中的特異性作用可能有助于開發(fā)COPD 的細(xì)胞特異性治療方法。

通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，可以比較COPD 患者和健康人群中各個(gè)細(xì)胞類型的基因表達(dá)差異。這有助于了解COPD 發(fā)生和發(fā)展過程中細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的變化，從而揭示COPD 的潛在機(jī)制。Pei等［33］對(duì)COPD 患者和健康對(duì)照者的血漿外泌體進(jìn)行測序，并對(duì)外周血單核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行單細(xì)胞RNA 測序，然后構(gòu)建了競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)來描述COPD 中PBMCs 和外泌體之間的相互作用。此外還生成了COPD 患者PBMCs 的外泌體RNA 圖譜和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，描述了免疫功能受損和COPD 發(fā)展之間的可能聯(lián)系，確定了外泌體在介導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)中的可能作用，有助于最終闡明COPD 發(fā) 展 的 基 礎(chǔ) 機(jī) 制。而Huang 等［34］對(duì) 來 自COPD 和具有不同吸煙史的供體的年齡分層，對(duì)照肺組織的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA 測序分析，為COPD 的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)觀點(diǎn)，并證明了靶向單核細(xì)胞在COPD 診斷和治療中的潛力。這兩項(xiàng)研究促進(jìn)了對(duì)COPD 發(fā)病機(jī)制的理解，并發(fā)現(xiàn)了COPD 中診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

一些研究發(fā)現(xiàn)，COPD 患者的肺組織中存在與鐵死亡相關(guān)的基因表達(dá)異常。這些異常可能導(dǎo)致鐵在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而引發(fā)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。此外，COPD 患者肺組織中存在與鐵死亡相關(guān)的細(xì)胞亞群，如巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。Fan 等［35］綜合分析來自COPD 巨噬細(xì)胞的單細(xì)胞RNA 測序數(shù)據(jù)，揭示了巨噬細(xì)胞鐵死亡在COPD 中的重要作用，新的生物標(biāo)志物（SOCS1 和HSPB1）可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞鐵死亡參與COPD 的發(fā)病機(jī)制。這表明SOCS1 和HSPB1 可以作為COPD 新的治療靶點(diǎn)。

近幾年，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）對(duì)全球醫(yī)療保健系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。有研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者感染SARS-CoV-2 的風(fēng)險(xiǎn)及感染后死亡率比健康人高。Johansen 等［36］對(duì)健康人和COPD 患者接種新型冠狀病毒疫苗7 天后分化的原代支氣管上皮細(xì)胞（pBECs）進(jìn)行了單細(xì)胞RNA 測序分析，并將變化與病毒滴度、促炎反應(yīng)和干擾素產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)COPD 的pBECs 更容易受到SARS-CoV-2 感染。我國COPD 患者多，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床指導(dǎo)意義，對(duì)COPD 患者防治SARS-CoV-2 有積極的影響。

干細(xì)胞治療是一種新興的治療方法，被廣泛研究應(yīng)用于COPD 的治療中，而SCS 可以幫助鑒定COPD 肺組織中的干細(xì)胞類型和狀態(tài)。COPD 的特征是不可逆的肺組織損傷，許多研究發(fā)現(xiàn)了肺損傷后遠(yuǎn)端氣道干/祖細(xì)胞（DASCs）的潛在再生功能。Wang 等［37］把小鼠和人類DASCs 擴(kuò)增、分析，并移植到受傷的小鼠肺中，然后進(jìn)行單細(xì)胞分析以揭示移植細(xì)胞的分化途徑。最后，將人DASCs 移植到COPD 小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)分離的小鼠和人DASCs 可以無限擴(kuò)增，并能夠在體外進(jìn)一步分化為成熟的肺泡結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞表達(dá)典型的Ⅰ型肺泡細(xì)胞標(biāo)志物以及特異性分泌蛋白。這些發(fā)現(xiàn)表明，DASCs 肺內(nèi)移植可以重建功能性肺結(jié)構(gòu)，表明DASCs 移植在治療COPD 中的潛在治療作用。DASCs 在COPD 過程中發(fā)揮多種作用，結(jié)合SCS揭示其具體機(jī)制，也許可以逆轉(zhuǎn)COPD 的不可逆損傷，并為開發(fā)新的干細(xì)胞治療策略提供理論依據(jù)。

這些研究提供了關(guān)于細(xì)胞類型、細(xì)胞功能和細(xì)胞間的相互作用等方面的重要信息，有望進(jìn)一步理解COPD 的發(fā)病機(jī)制，以及發(fā)掘新的診斷及治療方法。

4 討論

在過去十年中，SCS 已被證明是生命科學(xué)領(lǐng)域的變革技術(shù)之一。目前應(yīng)用在COPD 研究中，如確定以前未鑒定的細(xì)胞亞群、發(fā)現(xiàn)COPD 新的生物標(biāo)志物、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測慢阻肺疾病患者相關(guān)診斷基因標(biāo)志物［38］等。但是，目前SCS 技術(shù)仍存在較多問題有待改善，如成本問題、單細(xì)胞分離獲取的質(zhì)量問題、基因捕獲的效率和質(zhì)量問題、細(xì)胞物理位置的缺失、擴(kuò)增偏倚問題和實(shí)驗(yàn)批次效應(yīng)［39］等。

由于目前COPD 缺乏可靠的早期診斷方法，無法及時(shí)進(jìn)行早期干預(yù)，并且臨床治療無法阻止疾病的進(jìn)展，導(dǎo)致其發(fā)病率、患病率和死亡率高，造成嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。所以急需找尋可靠的早期診斷方法和有效的治療方法來減解決這一問題。而SCS技術(shù)在COPD 發(fā)病機(jī)制的研究中有很大的作用，有望實(shí)現(xiàn)COPD 的早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后預(yù)測，提高患者生命質(zhì)量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

楊澤華：選題，論文結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)收集，撰稿，修稿；丁毅鵬：主要對(duì)選題、文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。