M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-10 調(diào)控膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的研究

趙向陽(yáng)，江博文，陶 滔，談 燚

（蚌埠醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 蚌埠 233004）

膽囊癌（gallbladder cancer， GBC）是一種常見(jiàn)的膽道惡性腫瘤，約占80%～95%，該病具有侵襲性且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，所以致死率高，5 年生存率低于5%［1-3］。現(xiàn)階段對(duì)GBC 發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不充分，積極挖掘新的分子靶點(diǎn)并針對(duì)性開(kāi)發(fā)相應(yīng)藥物將有助于改善GBC 預(yù)后狀況。

腫 瘤 微 環(huán) 境（tumor microenvironment， TME）是一個(gè)參與腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展每個(gè)階段的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，主要構(gòu)成有腫瘤細(xì)胞、多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages， TAMs）是TME 中含量很高的一種免疫細(xì)胞，主要分為M1 型和M2 型，其中M2 型即TAMs 一般所指代的巨噬細(xì)胞，能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及抑制免疫應(yīng)答［4-6］。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是Ⅱ類(lèi)細(xì)胞因子家族的成員，其生物活性形式是一種可溶性的36 kDa 同源二聚體［7］。IL-10 可由巨噬細(xì)胞、多種T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞分泌，并在腫瘤中可發(fā)揮免疫抑制作用，降低免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞造成的損傷［8］。此外，IL-10 還在部分腫瘤中被證實(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤［9］、非小細(xì)胞肺癌［10］、肝癌［11］、卵巢癌［8］等。IL-10 的濃度在包括GBC 在內(nèi)的多種腫瘤中顯著升高［12］，但目前在GBC 中關(guān)于IL-10 生物效應(yīng)方面的研究偏少。本實(shí)驗(yàn)意在探討M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及IL-10 在該調(diào)控中的作用，為將來(lái)膽囊癌臨床治療的開(kāi)展提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要材料

人單核細(xì)胞株THP-1 購(gòu)自ATCC 公司；人GBC 細(xì)胞株NOZ 和GBC-SD 由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院徐明課題組惠贈(zèng)；佛波酯、人重組IL-4 和IL-13 購(gòu) 自MCE 公 司；RPMI 1640 培 養(yǎng) 基 選 自Gibco 公司；人IL-10 中和抗體購(gòu)自Biolegend 公司；ELISA檢測(cè)試劑盒選自江蘇晶美公司；CCK-8 檢測(cè)試劑盒選自上海碧云天公司；Matrigel 膠選自BD 公司；Trizol 購(gòu)自Takara 公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)公司；兔源多克隆抗體E-cadherin 和鼠源單克隆抗體Vimentin 選自武漢三鷹公司；兔源多克隆抗體GAPDH、鼠二抗和兔二抗購(gòu)自愛(ài)博泰克公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

THP-1、NOZ 和GBC-SD 細(xì) 胞 在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，將THP-1細(xì)胞種入六孔板（細(xì)胞密度為1×106個(gè)），先用150 nmol/L 的PMA 誘導(dǎo)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基后，再用20 ng/L 的IL-4 和IL-13 誘導(dǎo)48 h 即為M2 型巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)前后拍照記錄；誘導(dǎo)完成后棄舊培養(yǎng)基，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，收集上清作條件培養(yǎng)基（M2-CM）。實(shí)驗(yàn)分組：Control 組（用不含血清的培養(yǎng)基作對(duì)照處理）、M2-CM 組（用M2-CM 處理）、M2-CM+anti-IL-10 組（用含10 μg/L 的IL-10中和抗體的M2-CM 處理）、M2-CM+IgG 組（用含10 μg/L 的IL-10 同型對(duì)照抗體的M2-CM 處理）。

1.3 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)

收集誘導(dǎo)前后的THP-1 細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)RNA 濃度，定量并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒使用說(shuō)明對(duì)樣品中的待測(cè)基因定量分析。采用2-ΔΔCT計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。用于實(shí)驗(yàn)的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 ELISA

收集THP-1 和M2 巨噬細(xì)胞的上清液，參考ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)兩組細(xì)胞上清中IL-10 的表達(dá)量。

1.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NOZ 和GBC-SD 細(xì)胞懸液加入96 孔板中（每孔100 μL，3 000 個(gè)），待細(xì)胞貼壁 后，按 各 組 要 求 分 別 孵 育0 h、24 h、48 h 和72 h后，以10∶1 比 例 向 每 孔 加 入CCK-8 溶 液，再 孵 育120 min，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各組450 nm 處的吸光度值。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

制備N(xiāo)OZ 和GBC-SD 細(xì)胞的細(xì)胞懸液并鋪板于6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌槍頭在孔內(nèi)均勻劃直線，分組處理48 h。在0 h 和48 h 觀測(cè)劃痕寬度并拍照，而后利用Image J 軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)

將Matrigel 液與預(yù)冷無(wú)血清培養(yǎng)基充分混勻，加入每個(gè)上室后，于37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h。取預(yù)先處理的NOZ 和GBC-SD 細(xì)胞（分組處理了72 h），用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，每個(gè)上室加100 μL（每孔7 000 個(gè)），下室分別加入600 μL 的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h 后取出小室，PBS 洗滌后在4%的多聚甲醛和0.1%的結(jié)晶紫中分別浸泡15 min，PBS洗滌后倒置放在吸水濾紙上，晾干表面水分，高倍鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)并拍照。

1.8 Western blot 實(shí)驗(yàn)

用RIPA 于冰上裂解各組細(xì)胞，提取蛋白并對(duì)各組蛋白樣品定量；蛋白樣品先電泳分離（先70 V，30 min，再120 V，60 min），后 電 轉(zhuǎn) 至PVDF 膜 上（250 mA，120 min）；PVDF 膜用牛奶封閉120 min后，放入配好的一抗稀釋液中于4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜（稀釋比例分別為：Vimentin 1∶20 000、E-cadherin 1∶20 000 和GAPDH 1∶5 000）。第二天取出PVDF膜，TBST 洗膜3 遍共約15 min，而后在二抗稀釋液中（稀釋比均為1∶5 000）于搖床上室溫孵育120 min，孵育結(jié)束再次洗膜，之后蘸取ECL 反應(yīng)液進(jìn)行曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graphpad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)分析誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定

THP-1 在誘導(dǎo)前懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈圓形或類(lèi)圓形，經(jīng)PMA、IL-4 和IL-13 誘導(dǎo)后，細(xì)胞貼壁，形態(tài)轉(zhuǎn)為略不規(guī)則形并伸出偽足（圖1A）。經(jīng)RTqPCR 檢測(cè)顯示，與未誘導(dǎo)的THP-1 相比，誘導(dǎo)后細(xì)胞中M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子CD206 和Arg 1［13］表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.05），而M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo) 志 分 子CD80 和iNOS［13，14］表 達(dá) 無(wú) 明 顯 變 化 或 略有下降（P＞0.05，P＜0.05，圖1B），這說(shuō)明M2 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

圖1 M2 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定Fig 1 Induction and identification of M2 macrophages

2.2 IL-10 在M2 型巨噬細(xì)胞內(nèi)和M2 型巨噬細(xì)胞上清液中高表達(dá)

經(jīng)RT-qPCR 和ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與誘導(dǎo)前的THP-1 相 比，IL-10 在M2 型 巨 噬 細(xì) 胞 內(nèi) 的mRNA水平表達(dá)升高（P＜0.05，圖2A），在上清液中的蛋白含量明顯增多（P＜0.05，圖2B）。

圖2 IL-10 在THP-1 和M2 型巨噬細(xì)胞內(nèi)及上清中的表達(dá)情況Fig 2 Expression of IL-10 in THP-1 and M2 macrophages and its supernatant

2.3 M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10 促進(jìn)GBC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：NOZ 和GBC-SD 細(xì)胞在被處理48 h 和72 h 后，相較于Control 組，M2-CM 組的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與M2-CM 組相比，M2-CM+anti-IL-10 組的細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P＜0.05），M2-CM+IgG 組的細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)M2-CM 可使GBC 的細(xì)胞遷移率升高，在anti-IL-10 中和了M2-CM 中的IL-10 之后，GBC 的細(xì)胞遷移率明顯下降（P＜0.05），而IL-10 的同型對(duì)照抗體對(duì)GBC 細(xì)胞遷移率無(wú)明顯影響（P＞0.05），見(jiàn)圖4。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M2-CM 組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于Control 組和M2-CM+anti-IL-10 組（P＜0.05），而和M2 -CM+IgG 組 相 比 無(wú) 明 顯 差 異（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖3 M2 型巨噬細(xì)胞和IL-10 對(duì)GBC 細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the proliferation of GBC cells

圖4 M2 型巨噬細(xì)胞和IL-10 對(duì)GBC 細(xì)胞遷移的影響Fig 4 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the migration of GBC cells

圖5 M2 型巨噬細(xì)胞和IL-10 對(duì)GBC 細(xì)胞侵襲的影響Fig 5 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the invasion of GBC cells

2.4 M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10 促進(jìn)GBC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

為探明M2 型巨噬細(xì)胞和IL-10 對(duì)GBC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，利用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Control 組 相 比，M2-CM 組 上 皮 表 型E-cadherin 的 表達(dá)明顯下降，而間質(zhì)表型Vimentin 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與M2-CM 組相比，M2-CM+anti-IL-10組E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)變化明顯被抑制（P＜0.05），M2-CM+IgG 組E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 M2 型巨噬細(xì)胞和IL-10 對(duì)GBC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the expression of proteins related to epithelial-mesenchymal transformation in GBC cells

3 討論

由于GBC 早期癥狀缺乏特異性且進(jìn)展迅速，通?；颊叱踉\時(shí)病情已至晚期，喪失了根治性手術(shù)機(jī)會(huì)［3，15］，只能被迫接受化療、放療和靶向治療等非手術(shù)性姑息療法。雖然化療是非手術(shù)治療的首選方案［1］，但是由于化療藥無(wú)法忽視的耐藥性和全身毒性等問(wèn)題，使得GBC 化療療效比較有限［16］；而GBC對(duì)放療不敏感［15］，GBC 的靶向治療目前尚未取得突出成效，5 年生存率未有得到明顯提高［17］。因此需要更加深入探究GBC 致瘤的內(nèi)在機(jī)制，努力尋找更有效的分子靶點(diǎn)和優(yōu)化治療方案，來(lái)延長(zhǎng)患者生存期和改善患者預(yù)后。

近幾年，隨著對(duì)TME 的研究深入，針對(duì)TME所開(kāi)展的抗腫瘤研究也逐漸成為了諸多學(xué)者所關(guān)注一個(gè)議題。M2 型巨噬細(xì)胞是TME 的重要組成，能夠分泌多種可溶性細(xì)胞因子，諸如TGF-β1、CCL5、CCL18 和CCL22 等［18-21］，在這些細(xì)胞因子介導(dǎo)下，M2 型巨噬細(xì)胞可推動(dòng)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展或抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的塑造。阻斷這些細(xì)胞因子的功能發(fā)揮可能是切斷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞之間相互聯(lián)系的一個(gè)新思路。在本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，IL-10 在M2 巨噬細(xì)胞的mRNA 水平高表達(dá)，以及在其上清液中明顯增多，所以推測(cè)IL-10 可能是M2 巨噬細(xì)胞發(fā)揮促癌能力的重要媒介。

越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，IL-10 可參與多種腫瘤的生長(zhǎng)與進(jìn)展，IL-10 或可作為抗腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)。有文獻(xiàn)指出，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中IL-10 的表達(dá)上調(diào)可作為癌癥分期和轉(zhuǎn)移潛力進(jìn)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)［7］。此外IL-10 還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移能力。比如，Zhang 等［22］研究指出，IL-10 可以通過(guò)升高KPNA2 表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；另有文獻(xiàn)表明，IL-10 介導(dǎo)了人類(lèi)白細(xì)胞抗原-E 對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)調(diào)控［23］；在胃癌、肺癌和膀胱癌中，M2 型巨噬細(xì)胞來(lái)源的IL-10 促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展［24-26］。IL-10 除了在細(xì)胞層面體現(xiàn)了它作為分子靶標(biāo)的潛力，也在動(dòng)物水平的研究中證明了它在臨床治療中的可能價(jià)值。Gordy 等［27］研究表明，在黑色素瘤模型中，IL-10 中和抗體以依賴(lài)于Ⅰ型干擾素活性的方式增強(qiáng)了MIP3α-gp100DNA 疫苗的抗癌效果。為探明IL-10 在GBC 中的作用，本實(shí)驗(yàn)用M2 型巨噬細(xì)胞上清液和IL-10 中和抗體處理GBC細(xì)胞，結(jié)果顯示M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)GBC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有促進(jìn)作用，而阻斷IL-10 后，M2 型巨噬細(xì)胞的這一促進(jìn)效應(yīng)明顯減弱。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是一種癌細(xì)胞上皮樣狀態(tài)喪失轉(zhuǎn)而獲得間質(zhì)表型的可塑性過(guò)程，此轉(zhuǎn)化過(guò)程可使得腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力獲得提升［20］。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的EMT，例如，有實(shí)驗(yàn)證明M2 型巨噬細(xì)胞在腎細(xì)胞癌中可通過(guò)分泌CXCL13 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和EMT［28］；在肺鱗狀細(xì)胞癌中，M2 型 巨 噬 細(xì) 胞 通 過(guò) 釋 放TGF-β 激 活Smad/ZEB 通路促進(jìn)癌細(xì)胞EMT［29］；Chen 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在CCL2/AKT/β-catenin 通路介導(dǎo)下M2-CM 可激發(fā)三陰性乳腺癌細(xì)胞的EMT。而在本實(shí)驗(yàn)中也得到了相似結(jié)果，M2 型巨噬細(xì)胞可下調(diào)GBC 細(xì)胞Ecadherin 的表達(dá)以及上調(diào)Vimentin 的表達(dá)，中和IL-10 后，EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的這一變化明顯被抑制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10 促進(jìn)GBC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，揭示了M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)GBC 細(xì)胞功能調(diào)控的分子機(jī)制，為GBC 的精準(zhǔn)治療提供了新的理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

趙向陽(yáng)：實(shí)驗(yàn)構(gòu)思、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和文章撰寫(xiě)；江博文、陶滔：協(xié)助部分實(shí)驗(yàn)實(shí)施和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；談燚：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和文章批改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。