LncRNA FEZF1-AS1調(diào)控特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究*

滿(mǎn)君， 宋龍飛， 劉永全

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科， 2.康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 山東 濰坊 261035）

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是指慢性、進(jìn)行性、纖維化性及原因不明的肺間質(zhì)性病變，表現(xiàn)彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、上皮-間充質(zhì)相互作用（epithelial interstitial transition, EMT）、成纖維細(xì)胞過(guò)度增生及細(xì)胞基質(zhì)過(guò)度沉積，最終導(dǎo)致彌漫性間質(zhì)纖維化[1]。IPF 是肺系疑難重癥疾病，確診后平均生存期為3 年左右，5 年生存率為30%～50%。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，IPF 發(fā)病機(jī)制主要與EMT 有關(guān)，EMT 指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變、細(xì)胞極性消失、遷移運(yùn)動(dòng)能力提高的現(xiàn)象[2-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度>200 nt、不編碼蛋白的RNA，其大量存在于真核生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，廣泛參與生物體內(nèi)各種重要的生理過(guò)程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZ 家族鋅指1-反義RNA 1（LncRNA FEZF1-AS1）在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT 中發(fā)揮重要作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT 過(guò)程相關(guān)的多種關(guān)鍵分子和信號(hào)通路。MicroRNA（miRNA）是一種重要的非編碼小RNA，廣泛參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控。MicroRNA-200c-3p（miR-200c-3p）在多種疾病EMT過(guò)程中的作用逐漸被揭示，研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c-3p在心肌梗死及乳腺癌、胃癌、膽囊癌等EMT 轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-7]。然而，LncRNA FEZF1-AS1在IPF 中的作用尚無(wú)研究，且LncRNA FEZF1-AS1 是否通過(guò)miR-200c-3p 發(fā)揮作用尚不清楚。本研究分析LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能，探討IPF 的發(fā)病機(jī)制，為尋找IPF 有價(jià)值的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

A549 細(xì)胞購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，A549 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/mL 青霉素、100 u/mL 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下松蓋培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%鋪滿(mǎn)時(shí)再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）（上海近岸生物科技有限公司），DMEM/F12 液體培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone 公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO 公司），CCK-8 檢測(cè)試劑盒（日本DoJinDo公司）；Transwell 嵌套小室（美國(guó)Corning 公司），TRIzol（北京全式金生物技術(shù)有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司），F(xiàn)astKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit 試劑盒（蘇州銳博生物科技有限公司），Lipofectamine 6000? 轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Si LncRNA FEZF1-AS1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（廣州市銳博生物科技有限公司），Si LncRNA FEZF1-AS1 NC（對(duì)照）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（廣州市銳博生物科技有限公司），miR-200c-3p 引物序列（廣州市銳博生物科技有限公司），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH 抗體（美國(guó)Proteintech公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將原始濃度為10 μg/mL的TGF-β1稀釋500 倍后建立TGF-β1（20 ng/mL）作用于A549 細(xì)胞48 h 誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和模型組。細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建LncRNA FEZF1-AS1 突變質(zhì)粒及空白質(zhì)粒，依據(jù)Lipofectamine 6000?試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將模型組細(xì)胞分為T(mén)GF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒），Blank 組（不做任何處理的A549 細(xì)胞）。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后采用qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將A549 細(xì)胞分組為Blank 組、Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組、Si LncRNA FEZF1-AS1 組。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究又將Si LncRNA FEZF1-AS1 組設(shè)置3 組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，即Si LncRNA FEZF1-AS1-1 組、Si LncRNA FEZF1-AS1-2 組、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 組，共分為5 組觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1 和miR-200c-3p 表達(dá) 采用TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，分別應(yīng)用FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒及miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。記錄Ct值，采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析，分別以GAPDH 和U6 作為內(nèi)參計(jì)算LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 和miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.3.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞分組為Blank 組、TGF- β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，胰酶消化細(xì)胞數(shù)調(diào)整至4×104個(gè)/mL，100 μ L/well 接種于96 孔板同時(shí)加入TGF- β120 ng/mL，分別在培養(yǎng)0、24 和48 h 時(shí)每孔加入10 μL CCK-8 溶液，4 h 后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度（OD 值）。

1.3.4 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分組為Blank 組、TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，將細(xì)胞懸液接種到6 孔板中，加入TGF-β120 ng/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)孔底后，用10 μL的無(wú)菌微量移液器吸頭垂直在消毒后在細(xì)胞板上劃痕，并將細(xì)胞洗滌3 遍，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察0、48 h各組細(xì)胞的變化。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕面積- 48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積。

1.3.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，每組細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)/孔。配制Transwell 上室液和下室液：上室加無(wú)血清培養(yǎng)基，下室是TGF-β120 ng/mL 含血清完全培養(yǎng)基，上室液每孔200 μL，下室液每孔800 μL。將上層小室放入下層小室，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞鋪在上層小室中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，取出上室，用棉簽擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，800 μL 甲醇中固定10 min，采用吉姆薩染色液染色細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)、拍照。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量 細(xì)胞分組后，采用裂解液裂解每組細(xì)胞，裂解完后，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取各組細(xì)胞蛋白，采BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF 膜，室溫?fù)u床封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 充分洗滌PVDF 膜后加入二抗37 ℃搖床孵育2 h。TBST 洗滌后加入ECL 顯影，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)的方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的比較

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組（P<0.05）；模型組細(xì)胞E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表2 和圖1。

圖1 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

表2 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表2 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

組別空白對(duì)照組模型組t 值P 值E-cadherin蛋白0.66 ± 0.01 0.46 ± 0.09 3.638 0.020 N-cadherin蛋白0.44 ± 0.04 0.72 ± 0.02 6.688 0.003 Vimentin蛋白0.61 ± 0.009 0.79 ± 0.02 10.020 0.001

2.2 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p基因表達(dá)的比較

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 和miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組（P<0.05）；模型組細(xì)胞miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表3 空白對(duì)照組與模型組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

組別空白對(duì)照組模型組t 值P 值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.35 ± 0.09 1.73 ± 0.03 4.269 0.013 miR-200c-3p mRNA 1.08 ± 0.003 0.20 ± 0.01 119.000 0.000

2.3 各組LncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染效率的比較

5 組轉(zhuǎn)染效率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩兩比較結(jié)果示，Si LncRNA FEZF1-AS1-1 組、Si LncRNA FEZF1-AS1-2 組、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 組的LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于Blank 組（P<0.05）；且Si LncRNA FEZF1-AS1-1 組、Si LncRNA FEZF1-AS1-2組、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 組的LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量也低于Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）。見(jiàn)表4

表4 各組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表4 各組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注 ： ①與Blank 組比較，P <0.05；②與Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，P <0.05。

組別Blank組Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組Si LncRNA FEZF1-AS1-1 組Si LncRNA FEZF1-AS1-2 組Si LncRNA FEZF1-AS1-3 組F 值P 值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.00±0.02 1.08±0.02 0.61±0.03①②0.51±0.03①②0.30±0.02①②183.100 0.000

2.4 沉默LncRNA FEZF1-AS1對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，Blank 組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖數(shù)（OD450）值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 733.000，P=0.000）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組不同時(shí)間點(diǎn)OD450值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=895.400，P=0.000）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組不同時(shí)間點(diǎn)OD450值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 383.000，P=0.000）。Blank 組、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組及TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組隨時(shí)間的變化趨勢(shì)有差別（F=221.250，P=0.000）。見(jiàn)表5。

表5 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖的比較 （±s）

表5 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖的比較 （±s）

注 ： ①與0 h 比較，P <0.05； ②與24 h 比較，P <0.05； ③與Blank 組比較，P <0.05； ④與TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組比較，P <0.05。

組別Blank組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1組F 值P 值0 h 0.24±0.01 0.25±0.008 0.25±0.005 0.932 0.444 24 h 0.62±0.007①0.97±0.03①③0.75±0.02①③④81.100 0.000 48 h 1.09±0.01①②1.54±0.02①②③1.27±0.02①②③④168.700 0.000 F 值1 733.000 895.400 1 383.000 P 值0.000 0.000 0.000

2.5 沉默LncRNA FEZF1-AS1 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Blank 組、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組和TGF- β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（27.06±1.64）%、（48.09±1.36）%、（34.31±0.65）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.110，P=0.000）。兩兩比較結(jié)果顯示，與Blank 組比較，TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組細(xì)胞劃痕愈合率升高（P<0.05）；與TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組中細(xì)胞劃痕愈合率降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞劃痕愈合的檢測(cè) （×100）

2.6 沉默LncRNA FEZF1-AS1 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Blank 組、TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組和TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（223.00±3.06）、（325.30±2.91）、（272.70±5.78）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=153.400，P=0.000）。兩兩比較結(jié)果示，TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組遷移細(xì)胞數(shù)大于Blank 組（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組遷移細(xì)胞數(shù)小于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞遷移的檢測(cè) （×100）

2.7 LncRNA FEZF1-AS1基因抑制miR-200c-3p的表達(dá)

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Blank 組、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 與miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）；而TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于Blank 組（P<0.05）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組miR-200c-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 各組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA、miR-200c-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表6 各組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA、miR-200c-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注 ： ①與Blank 組比較，P <0.05； ②與TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，P <0.05。

組別Blank組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1組F 值P值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.29±0.06 5.09±0.12①2.83±0.11①②365.900 0.000 miR-200c-3p mRNA 1.10±0.03 0.15±0.006①0.40±0.003①②1076.000 0.000

2.8 LncRNA FEZF1-AS1 促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank 組、TGFβ1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組和TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TGF- β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組N-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 組Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組（P<0.05）。見(jiàn)圖4 和表7。

圖4 LncRNA FEZF1-AS1促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)

表7 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表7 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注 ： ①與Blank組比較，P <0.05； ②與TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，P <0.05。

組別Blank組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1組F 值P 值E-cadherin蛋白0.87±0.02 0.40±0.01①0.71±0.02①②176.600 0.000 N-cadherin蛋白0.48±0.01 0.87±0.01①0.71±0.01①②266.100 0.000 Vimentin蛋白0.38±0.02 0.87±0.01①0.63±0.03①②112.600 0.000

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為IPF 發(fā)病機(jī)制主要與EMT有關(guān)，認(rèn)為肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制，肺成纖維細(xì)胞的活化及膠原沉積等在IPF 發(fā)病中具有關(guān)鍵的作用[8]。TGF-β1誘導(dǎo)因子可通過(guò)多種不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT，是目前IPF 細(xì)胞模型復(fù)制中較為成熟的方法。LncRNA 作為人類(lèi)基因組中重要調(diào)節(jié)因子，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯或翻譯后水平調(diào)控基因表達(dá)，與人類(lèi)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FEZF1-AS1 不僅在各種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及Warburg 效應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，還參與調(diào)節(jié)EMT[9]。研究表明抑制LncRNA FEZF1-AS1 可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT，發(fā)現(xiàn)LncRNA FEZF1-AS1 通過(guò)調(diào)控前列腺癌中的miR-25-3p/ITGB8 軸促進(jìn)自噬和EMT[10]。沉默LncRNA FEZF1-AS1 還可抑制非小細(xì)胞肺癌NSCLC 的細(xì)胞增殖和侵襲，LncRNA FEZF1-AS1 可通過(guò)增加E-cadherin 的表達(dá)，降低Slug、Twist 和Vimentin 的表達(dá)，抑制NSCLC 細(xì)胞EMT[11]。研究顯示，LncRNA FEZF1-AS1 是肝癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)控因子，沉默LncRNA FEZF1-AS1 基因可通過(guò)抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制EMT，從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[12]。故目前研究發(fā)現(xiàn)LncRNA FEZF1-AS1 在多種腫瘤的EMT 過(guò)程中均起著關(guān)鍵作用，但LncRNA FEZF1-AS1 在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化中的作用尚未有報(bào)道。本研究首次證實(shí)，LncRNA FEZF1-AS1 在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化中明顯高表達(dá)，LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT 過(guò)程，且進(jìn)一步證實(shí)在IPF 中LncRNA FEZF1-AS1 可靶向抑制miR-200c-3p的表達(dá)。

本研究EMT 過(guò)程中的關(guān)鍵分子選用Ecadherin、N-cadherin 和Vimentin，E-cadherin 是一種Ca2+依賴(lài)的、與細(xì)胞間黏附密切相關(guān)的跨膜糖蛋白，是典型的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin 是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的最重要的分子之一，當(dāng)E-cadherin的表達(dá)減少時(shí)，細(xì)胞間的黏附作用減弱，細(xì)胞極性發(fā)生改變，導(dǎo)致上皮樣細(xì)胞進(jìn)一步向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果也顯示，IPF 模型組細(xì)胞E-cadherin明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，且沉默LncRNA FEZF1-AS1可促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)。而N-cadherin 和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志物，N-cadherin 和Vimentin 對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及信號(hào)傳導(dǎo)均發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果證實(shí)，模型組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin 表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組細(xì)胞，敲除LncRNA FEZF1-AS1 基因可抑制Ncadherin、Vimentin 的表達(dá)，因此本研究證實(shí)LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中促進(jìn)EMT 的發(fā)生。

miR-200c-3p 是目前研究已證實(shí)的在IPF 的EMT 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p 在肺間質(zhì)纖維化患者及動(dòng)物模型中均顯著下調(diào)，miR-200c-3p 可抑制肺間質(zhì)纖維化EMT轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)肺成纖維細(xì)胞的纖維原活性[13]。miR-200c-3p 抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞異常的EMT，抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肺泡I 型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果也顯示，肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型中miR-200c-3p 的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組細(xì)胞。沉默LncRNA FEZF1-AS1 組細(xì)胞中miR-200c-3p 的表達(dá)明顯高于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 組細(xì)胞，表明肺間質(zhì)纖維化中LncRNA FEZF1-AS1 通過(guò)靶向抑制miR-200c-3p途徑介導(dǎo)疾病EMT 的發(fā)生與進(jìn)展。這也是本研究的創(chuàng)新之處，首次發(fā)現(xiàn)IPF 發(fā)病機(jī)制中LncRNA FEZF1-AS1 對(duì)miR-200c-3p 的靶向作用關(guān)系。

綜上所述，本研究證明LncRNA FEZF1-AS1 通過(guò)靶向抑制miR-200c-3p 促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT 過(guò)程，從而促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。本研究對(duì)IPF 進(jìn)展的分子機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，為其治療提供了潛在的靶點(diǎn)。