NETosis 與糖尿病足潰瘍相關(guān)性研究進(jìn)展

何於成 李開燕 周丁鵬 曾昭洋

糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，難愈、復(fù)發(fā)率高，同時有極高的致死和致殘率。中性粒細(xì)胞（PMN）是抵御病原體入侵人體的第一道防線，其釋放的中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（NETs）具有捕獲和消滅病原體的作用。NETs 的產(chǎn)生和釋放稱為NETosis，被認(rèn)為是PMN 的一種獨(dú)特類型的細(xì)胞死亡，參與了DFU 難愈合的發(fā)病機(jī)制[1，2]。研究表明，DFU 中過多或持續(xù)存在NETosis 會延遲創(chuàng)面愈合[3]。本研究通過NETosis 對DFU 愈合障礙的發(fā)病機(jī)制及作為潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在為實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療提供更充足的客觀依據(jù)。

1 NETosis 的特征

NETs 的直徑為15～17nm，來源于伴有組蛋白的核組分，并與殺微生物的球狀蛋白復(fù)合，例如彈性蛋白酶、組織蛋白酶G 和髓過氧化物酶（MPO）[4，5]。NETs在細(xì)胞外空間中釋放，其染色質(zhì)網(wǎng)捕獲微生物，限制它們的擴(kuò)散并濃縮PMN 因子，從而增強(qiáng)殺微生物效果[6]，該過程被稱為NETosis，是PMN 的一種獨(dú)特類型的細(xì)胞死亡[7]。NETosis 主要分為以下兩種形式[8]：①煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶依賴性途徑是促炎物質(zhì)激活NADPH 氧化酶而產(chǎn)生活性氧（ROS），其在NETs 的形成中起重要作用。由于激活NADPH 氧化酶是這個過程的關(guān)鍵步驟，因此被稱為依賴NADPH 的NETosis。②NADPH 非依賴性途徑是鈣離子載體離子霉素、A23187、pH 升高等都可以誘導(dǎo)，其不依賴NADPH的NETosis。影響糖尿病足創(chuàng)面愈合的主要是依賴NADPH 的NETosis[9]。

NETosis 的途徑之一是由NADPH 氧化酶產(chǎn)生ROS。ROS 促進(jìn)PMN 釋放中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）和MPO，使NE 從嗜天青顆粒移位到胞漿中，并由此進(jìn)入細(xì)胞核；在此NE 開始降解組蛋白，解開染色質(zhì)并釋放DNA。ROS 還激活蛋白-精氨酸脫亞胺酶4（PAD4），將組蛋白上的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，進(jìn)一步支持染色質(zhì)解濃縮和DNA 擴(kuò)增，導(dǎo)致核膜破壞,染色質(zhì)被釋放到胞質(zhì)溶漿中被各種顆粒和胞質(zhì)蛋白修飾[10]。NETs 最終釋放到細(xì)胞外空間中的確切機(jī)制尚未被描述，但已經(jīng)提出了質(zhì)膜的主動和程序化分解（與由于DNA 擴(kuò)增導(dǎo)致的被動膜破裂相反）[11]。NADPH 合成對于維持ROS 爆發(fā)是必不可少的。在PMN 中，NADPH 由戊糖磷酸途徑的氧化分支（oxPPP）中的葡萄糖6-磷酸產(chǎn)生。事實(shí)上，葡萄糖6-磷酸脫氫酶（oxPPP 的第一種酶）缺陷患者表現(xiàn)出低水平的NADPH 和ROS，并且對細(xì)菌感染的易感性高得多[12]。

1.1 NETosis 與巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬NETs，然后在溶酶體中降解。雖然這種降解本身不會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，但在脂多糖（LPS）存在下，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）[13]。當(dāng)NETs 從吞噬體移位到胞質(zhì)溶膠時，DNA 可以被DNA 傳感器環(huán)GMP-AMP 合酶（cGAS）識別，其誘導(dǎo)體外和體內(nèi)I 型干擾素的產(chǎn)生。cGAS/STING 途徑的刺激依賴于DNA 相關(guān)的NE，并且NE 活性的抑制可減少一半干擾素的產(chǎn)生[14]。也有研究表明[15]，巨噬細(xì)胞在NETs 降解后表現(xiàn)出表型依賴性反應(yīng)，作用數(shù)小時后，M2 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，而M1 巨噬細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞死亡和核去凝。M1 巨噬細(xì)胞的核去凝聚作用以PAD4 依賴性方式發(fā)生，并導(dǎo)致細(xì)胞外DNA 的局部釋放。此后，M1 巨噬細(xì)胞以半胱天冬酶激活的DNA 酶降解自身的DNA，導(dǎo)致細(xì)胞外DNA 在24h 內(nèi)清除。

1.2 NETosis 與血小板血小板是主要的外源性PMN 調(diào)節(jié)因子。病原體或細(xì)菌激活的血小板可以有效地誘導(dǎo)NETs 形成，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥。血小板誘導(dǎo)NETs 的形成需要P-選擇素（其在活化時在血小板表面上調(diào)）和P-選擇素糖蛋白配體I（PSGL-1）（其在PMN 上表達(dá)）之間的相互作用[16]。血小板上P-選擇素和GPIbα/Mac-1 之間的相互作用也可調(diào)節(jié)NETosis[17]。除P-選擇素外，血小板還同時釋放可溶性因子，以聚集和維持NETs 的形成[17]。事實(shí)上，過度的血小板活化決定了白細(xì)胞的過度聚集和炎癥的誘導(dǎo)，并促進(jìn)NETs 的釋放。在感染的初始階段，NETs 對于誘捕細(xì)菌和防止細(xì)菌在血液中傳播至關(guān)重要[18]。但NETs 也促進(jìn)血小板聚集、凝血酶活化和纖維蛋白凝塊形成，進(jìn)而導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），最終損害組織氧合并導(dǎo)致患者死亡[19]。

在DFU 愈合中炎癥階段極為關(guān)鍵。過量的ROS 使機(jī)體內(nèi)氧化還原失衡[20]，嚴(yán)重影響創(chuàng)面周圍神經(jīng)血供與作用機(jī)制[21]，還會使促炎性因子進(jìn)一步表達(dá)[22]。同時巨噬細(xì)胞M1 也會釋放大量促炎性因子，導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)使創(chuàng)面停滯在炎性階段，從而遷延不愈[23]。

2 高糖狀態(tài)對NETosis 的影響

高濃度的葡萄糖促進(jìn)ROS 介導(dǎo)的NF-κB活化，其進(jìn)一步增加晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）的表達(dá)[24]。進(jìn)一步證實(shí)，高血糖狀態(tài)及相關(guān)代謝損傷可使PMN 引發(fā)NETs 表達(dá)，同時減少吞噬作用。在高血糖條件下培養(yǎng)的PMN，它的代謝紊亂可使PMN 中超氧化物增加和促炎性病癥的激活，并且垂死的PMN 可釋放大囊泡，進(jìn)而使鄰近的PMN 致力于NETosis。與吞噬作用相比，高血糖癥還可能誘導(dǎo)促進(jìn)NETosis 的下游[25]?？傊哐强芍苯踊蜷g接通過AGE-RAGE 二級機(jī)制誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過激活NADPH 氧化酶導(dǎo)致自噬和自發(fā)性NETosis，同時減少吞噬作用[25]。

3 NETosis 與DFU

最近，許多研究表明過量NETosis 已被證明與DFU 愈合密切相關(guān)。傷口感染也可使PMN 活化和NETs 釋放[26，27]。有研究發(fā)現(xiàn)[28]，當(dāng)NETs 出現(xiàn)于皮膚傷口時，在野生型（WT）小鼠皮膚傷口中產(chǎn)生大量NETs，但在Padi 4-/-（小鼠的PAD4 由PADi4 基因編碼）小鼠中未觀察到。并且與WT 小鼠相比，Padi 4-/-小鼠的傷口愈合加速，并且不受糖尿病的影響。脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）可破壞NETs，加速糖尿病和血糖正常WT 小鼠的傷口愈合。因此，NETs 嚴(yán)重影響傷口愈合，特別是在糖尿病中，PMN 對NETosis 更敏感。抑制NETosis 或切割NETs 可能會改善傷口愈合，并減少糖尿病中NETs驅(qū)動的慢性炎癥。使用蛋白組學(xué)，NETs 被發(fā)現(xiàn)在非愈合人類DFU 中升高。此外，由于DFU 與全身炎癥相關(guān)，因此在DFU 患者的血流中評估NETosis生物標(biāo)志物與不具有DFU 的匹配糖尿病患者相比。NETs 成分包括彈性蛋白酶、組蛋白、PMN 明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和蛋白酶3，被發(fā)現(xiàn)在DFU患者的血液中升高[3]。同時，與正常血糖對照小鼠（LepRm+/db）相比，缺乏瘦素受體（LepRdb/db）的糖尿病小鼠中傷口愈合顯著延遲，伴隨著高NETs 水平。此外，dsDNA、PAD4 和瓜氨酸化組蛋白H3 在體外佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）誘導(dǎo)的NETosis 模型中均顯著升高[29]。

近年NETosis 與DFU 之間的聯(lián)系已成為眾多學(xué)者研究熱點(diǎn)。Yang 等[30]在糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)NOD 樣受體蛋 白3（NLRP3）、半胱天冬 酶1（Caspase-1）和消皮素D（GSDMD）的基因敲除阻止NETs 釋放并阻礙傷口愈合。Lee 等[31]用PMA 刺激PMN 以誘導(dǎo)NETosis，然后與DNaseI 孵育。他們將PMN 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NETs 確實(shí)激活了NLRP3 炎性小體并增加了IL-1β，而在用DNaseI 處理的樣本中沒有發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)。最后，當(dāng)給糖尿病大鼠注射DNaseI 時，發(fā)現(xiàn)NETs 降解改善了傷口愈合。Lee 等[32]發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素激動劑促進(jìn)NETosis 和增加NETosis 誘導(dǎo)延遲傷口愈合。Stavrou 等[33]報(bào)道，凝血因子Ⅻ（F Ⅻ）在活化后由PMN 分泌，其上調(diào)αMb2 整聯(lián)蛋白并增加αMb2 的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致組蛋白瓜氨酸化和NETs 形成，延遲傷口愈合。血管生成在皮膚創(chuàng)傷愈合中起重要作用，Yang 等[2]最新發(fā)現(xiàn)從糖尿病患者外周血中分離的PMN 加劇NETosis 反應(yīng)。NET 成分在糖尿病患者未愈合創(chuàng)面中富集。糖尿病傷口環(huán)境促使PMN 形成NETs，NETs 通過內(nèi)皮細(xì)胞中的Toll 樣受體9（TLR-9）誘導(dǎo)p21 激活激酶（PAK2）活化。然后PAK2 磷酸化細(xì)胞內(nèi)蛋白NF2/Merlin（神經(jīng)纖維蛋白2 基因/編碼抑癌蛋白）來抑制Hippo/Yes 相關(guān)蛋白（Hippo-YAP）途徑。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）與SMAD2 結(jié)合，從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核中以促進(jìn)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT），最終阻礙血管生成并延遲糖尿病傷口愈合。

4 NETosis 作為DFU 潛在治療靶點(diǎn)

隨著DFU 愈合延遲與NETosis 之間相關(guān)性研究的不斷深入，NETosis 成為了治療DFU 的新型靶點(diǎn)，通過抑制或減少NETosis 引起的慢性炎性反應(yīng)從而促進(jìn)DFU 愈合。

Das 等[34]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PKCβⅡ抑制劑Ruboxistaurin 可以抑制GSDMD，有效消除NETosis，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙并防止NETs 過度形成。Liu等[35]研究了富含亮氨酸的α2-糖蛋白1（LRG1）在正常傷口和糖尿病傷口愈合中的作用。在機(jī)制上，LRGl 通過TGF-βⅠ型受體激酶ALK5 以Akt依賴性方式介導(dǎo)NETosis。研究表明，來自骨髓細(xì)胞的LRG1 是正常傷口愈合所需的，但在糖尿病中過量的LRG1 表達(dá)是致病性的，并易導(dǎo)致慢性傷口形成。針對LRG1 抑制過度NETosis 以加速DFU 愈合是一個有吸引力的策略。Yang 等[29]首次發(fā)現(xiàn)用硫化氫（H2S）處理可以抑制NETosis 和NETs 釋放，從而改善糖尿病傷口愈合，其機(jī)制與抑制ROS 誘導(dǎo)的MAPK、ERK1/2 和p38 活化有關(guān)。Huang 等[36]鑒定了乳脂球表皮生長因子Ⅷ（MFG-E8）介導(dǎo)的糖尿病傷口損傷的保護(hù)機(jī)制包括：①抑制活化的NLRP 3炎性體靶向IL-1β/IL-18 合成；②減弱由炎性細(xì)胞因子IL-1β/IL-18 誘導(dǎo)的NETs 從PMN 的釋放；③可能通過整合素β3 和限制性P2 X7 受體來控制NETs引發(fā)的NLRP3 炎性體活化；④傷口中血管生成的增強(qiáng)。MFG-E8 誘導(dǎo)傷口炎癥的消退，減少NETS積累，改善血管生成，并加速傷口閉合，支持外源性MFG-E8 施用對糖尿病傷口治療具有可能的治療潛力。Basyreva 等[37]使用適量的維生素D3/ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFA）的攝入抑制了健康受試者和2 型糖尿病患者的全血樣品中PMA，從而減少NETs 形成和細(xì)胞死亡。Hallberg 等[38]在研究中表明硫氰酸鹽（SCN-）和硒氰酸鹽（SeCN-）的使用可能會導(dǎo)致NETs 釋放和HOCl 產(chǎn)生的減少，以最大限度地減少宿主細(xì)胞的損傷，同時可殺死細(xì)菌。這些濃度的氮氧化物是無毒的，并且在體內(nèi)容易實(shí)現(xiàn)。它們發(fā)揮抗炎和自由基清除作用的能力可能是有利的，特別是在慢性炎性疾病中，其在PMN 和其他免疫細(xì)胞的浸潤以及許多破壞性途徑中激活。Kaur 等[39]報(bào)道了含TDFA（一種由蘇氨酸、天冬氨酸和鳥氨酸組成的三肽，是第二代不可逆抑制劑，它修飾了PAD4 酶的活性位點(diǎn)殘基）的海藻酸鹽-GelMa 支架的開發(fā)，用于治療糖尿病傷口。由于TDFA 的存在，所開發(fā)的支架能夠更好地使細(xì)胞粘附、鋪展和增殖。體外PMN-支架相互作用結(jié)果表明NETosis 減少。Menegazzo 等[40]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療降低了NETs 組分的濃度，其對PKCNADPH 氧化酶途徑的抑制作用相關(guān)。二甲雙胍抑制NETosis 是一種新的藥理學(xué)作用，其可以潛在地改善糖尿病中的免疫炎癥。同時另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[41]當(dāng)患者接受大環(huán)內(nèi)酯類克拉霉素治療時，通過上調(diào)NETs 上的LL-37 恢復(fù)抗菌能力。同時，由于真皮成纖維細(xì)胞活化和分化，觀察到傷口愈合改善。這些發(fā)現(xiàn)表明NETs 在傷口愈合中的直接積極生理作用，超過了它們的防御性抗菌作用。

5 小結(jié)與展望

由PMN 釋放的NETs 可以捕獲或殺死多種病原體。根據(jù)當(dāng)前研究，自噬驅(qū)動的NETosis，既可以是有益的，也可以是有害的。在許多疾病中，NETs的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致組織損傷并加速疾病惡化，自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的NETosis 揭示了NETs 的負(fù)面作用，因此它們成為了慢性炎癥的效應(yīng)物。在DFU 中NETosis 的過度表達(dá)會損害傷口愈合。因此有效調(diào)節(jié)失控的NETosis 為DFU 的治療展現(xiàn)了新的前景和曙光，在未來可能很有希望研究出更加有效的治療方案。