甜菜夜蛾核型多角體病毒顆粒劑制備及其抗逆性能評(píng)價(jià)

胡素楠，戰(zhàn)映妤，陳泳汀，王淑涵，鄭桂玲，張保華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)新農(nóng)藥創(chuàng)制研究所，青島 266109)

農(nóng)藥在防治病蟲(chóng)草害、保障農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)等方面發(fā)揮著不可忽視的作用，已經(jīng)成為一種重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料[1]。但化學(xué)農(nóng)藥由于長(zhǎng)期使用，對(duì)土壤、空氣以及水源等環(huán)境生態(tài)造成不良影響，其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留也威脅到了食品安全[2]。生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)，對(duì)人畜安全高效，對(duì)生態(tài)環(huán)境影響較小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為病蟲(chóng)害綠色防控和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障之一[3]。

甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera exiguan ucleopolyhedrovirus，SeNPV)來(lái)源于致病的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，對(duì)甜菜夜蛾及相同科屬的大部分害蟲(chóng)具有專(zhuān)一活性和高致病力，屬于環(huán)境友好的生物殺蟲(chóng)劑[4]。甜菜夜蛾核型多角體病毒能夠有效控制甜菜夜蛾種群的數(shù)量增長(zhǎng)，尤其對(duì)抗性甜菜夜蛾有良好的防治效果，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和環(huán)保價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。核型多角體病毒主要由多角體蛋白和其包裹的病毒粒子構(gòu)成，在高溫和紫外照射條件下易變性失活，影響其殺蟲(chóng)性能[5]。

海藻酸鈉(sodium alginate)是一種來(lái)源廣泛、成本低廉的天然多糖大分子化合物，可與鈣離子等金屬陽(yáng)離子發(fā)生固化形成凝膠，具有良好的生物相容性，在環(huán)境中易被生物降解，同時(shí)對(duì)人畜無(wú)毒，因此常被用作載藥材料[6-7]，尤其是作為蛋白質(zhì)類(lèi)生物活性物質(zhì)、活體細(xì)胞、真菌或細(xì)菌等的載體或包埋材料[8-9]。

基于海藻酸鈉的良好生物降解性和生物相容性，本研究以海藻酸鈉為包埋材料，通過(guò)優(yōu)化載體濃度、進(jìn)樣速率等工藝條件，采用噴霧法制備了甜菜夜蛾核型多角體病毒顆粒劑，采用掃描電鏡等手段對(duì)其進(jìn)行了表征，并進(jìn)一步考察病毒顆粒劑的熱穩(wěn)定性、抗紫外性能和殺蟲(chóng)活性，從而為SeNPV 病毒制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

HH—1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇榮華儀器制造有限公司)，78 HW—1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)，HC—3018 高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)A1104 B 電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，BT—9300 ST 激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)，JEOL7500 F型掃描電子顯微鏡(日本電子公司)，F(xiàn)D—1A—50 冷凍干燥機(jī)(上海比郎儀器制造有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑

甜菜夜蛾核型多角體病毒(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院)，海藻酸鈉(AR，天津市博迪化工有限公司)，氯化鈣(AR，天津市巴斯夫化工有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)蟲(chóng)源

甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒海藻酸鈉顆粒劑制備與表征

病毒海藻酸鈉顆粒劑的制備 參考顏光耀等[10]的方法，先配制一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液，將1 mL SeNPV(濃度為1.5×106PIB/mL)緩緩滴加到海藻酸鈉溶液中，避光磁力攪拌1 h。然后將均勻混合的含病毒的海藻酸鈉溶液使用二流體噴嘴進(jìn)行霧化(噴嘴與液面相距20 cm)，按照一定的進(jìn)樣速率將霧化液噴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液中進(jìn)行凝聚。噴霧結(jié)束后，取部分病毒顆粒劑懸浮液，用激光粒度分布儀測(cè)量病毒顆粒劑的粒徑大小。并將剩余的顆粒劑懸浮液進(jìn)行抽濾，冷凍干燥，得到病毒海藻酸鈉顆粒劑固體試樣，將試樣置于4 ℃冰箱中保存待用。

制備工藝單因素試驗(yàn) 以海藻酸鈉質(zhì)量濃度和進(jìn)樣速率為制備條件，進(jìn)行制備工藝優(yōu)化，海藻酸鈉濃度設(shè)為0.5%、1.0%、1.5%，進(jìn)樣速率分別為11、13、15 mL/min，其他條件保持一致，按照上述方法步驟制備病毒顆粒劑。

1.2.2 病毒海藻酸鈉顆粒劑的形貌表征

取干燥至恒重的顆粒劑試樣少許，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀(guān)察顆粒劑形貌。

1.2.3 病毒海藻酸鈉顆粒劑的生物活性測(cè)定

采用飼料混毒法測(cè)定病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的生物活性。分別取病毒含量一致的病毒懸浮液和病毒顆粒劑懸浮液，取0.2 mL 用一次性注射器均勻滴加到飼料上，晾干，使表面沒(méi)有明顯的水漬。挑取大小均勻的3 齡甜菜夜蛾幼蟲(chóng)15 頭，輕輕地放在裝有混毒飼料的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱(溫度為25 ℃，濕度為65%)中觀(guān)察培養(yǎng)，每24 h 觀(guān)察記錄幼蟲(chóng)的病死數(shù)量，并記錄病蟲(chóng)死蟲(chóng)的形態(tài)特征，觀(guān)察7 d 或直至幼蟲(chóng)全部死亡。每個(gè)處理重復(fù)3 次，計(jì)算平均死亡率。

1.2.4 病毒海藻酸顆粒劑的抗紫外線(xiàn)性能測(cè)定

稱(chēng)取0.02 g 病毒海藻酸鈉顆粒劑，用蒸餾水配制成2 mL 的溶液，3 次重復(fù)。分別于紫外分析儀(30 W，波長(zhǎng)范圍在200～300 nm，255 nm 處最強(qiáng)) 中照射1、2 h。處理完成后，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配? mL 與上述處理含有相同病毒量的SeNPV 溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水作為空白對(duì)照，在紫外線(xiàn)條件下處理相同時(shí)間。將紫外處理過(guò)的蒸餾水、SeNPV、病毒顆粒劑溶液采用飼料混毒法測(cè)定對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的生物活性，記錄7 d 的死亡率。

1.2.5 病毒海藻酸鈉顆粒劑的耐熱性能測(cè)定

將SeNPV 和病毒顆粒劑分別用蒸餾水配制成病毒含量相同的懸浮液，取2 mL 分裝于10 mL 離心管中，水浴加熱并測(cè)量溫度。加熱處理分成2 組：溫度設(shè)置為25、35、45 ℃，處理時(shí)間為6 h，處理后的病毒溶液冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱冷藏保存。采用飼料混毒法測(cè)定處理的病毒和病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的生物活性，記錄7 d 的死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒海藻酸鈉顆粒劑制備

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)顆粒劑性能及對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)死亡率的影響

已有研究表明，載體用量會(huì)影響顆粒劑的形態(tài)、產(chǎn)率和粒徑等性能[11-12]，表1 是選用不同用量的海藻酸鈉所制備的病毒顆粒劑的產(chǎn)率和粒徑。其中當(dāng)海藻酸鈉用量為1%時(shí)，顆粒劑產(chǎn)率最高，達(dá)到79.43%，海藻酸鈉用量為0.5%時(shí)，所得顆粒劑的中位徑(D50)最小，但海藻酸鈉含量為1%、1.5%的中位徑(D50)差異不顯著。表明海藻酸鈉含量較低時(shí)，形成的顆粒劑不能完整包埋病毒，導(dǎo)致顆粒劑粒徑偏小和顆粒劑的產(chǎn)率偏低，但海藻酸鈉含量過(guò)高時(shí)，黏度增大，霧化效果差，也影響了顆粒劑的產(chǎn)率。

表1 不同海藻酸鈉用量制備的顆粒劑的產(chǎn)率及中位徑

由圖1 不同病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的致死曲線(xiàn)趨勢(shì)可以看出，所制備的海藻酸鈉病毒顆粒劑的感染力及致病力與SeNPV 病毒差異不顯著，說(shuō)明包埋病毒不會(huì)影響SeNPV 病毒的感染力及致病力。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)致死能力的影響

圖2為不同用量海藻酸鈉制備的病毒顆粒劑的掃描電鏡圖和粒徑分布，由圖2 中A～C 圖可以看出，所制備的病毒顆粒劑均呈不規(guī)則形狀，其中海藻酸鈉用量為1%時(shí)，外觀(guān)相對(duì)飽滿(mǎn)，表面光滑，形狀較為規(guī)則。圖2 D 顯示的是不同海藻酸鈉用量對(duì)病毒顆粒劑的粒度的影響，可以看出，0.5%的海藻酸鈉用量制備的顆粒劑粒度分布不如其他海藻酸鈉用量制備的顆粒劑集中，結(jié)合顆粒劑產(chǎn)率，確定1%的海藻酸鈉作為病毒顆粒劑制備的載體用量。

圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)病毒顆粒劑的形貌和粒徑的影響

2.1.2 進(jìn)樣速率對(duì)顆粒劑性能及對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)死亡率的影響

表2為不同進(jìn)樣速率制備的病毒顆粒劑的產(chǎn)率及中位徑(D50)的大小，隨著進(jìn)樣速率的增加，D50略微增大，但進(jìn)樣速率為13 mL/min 時(shí)，顆粒劑的產(chǎn)率最高，達(dá)到77.24%。

表2 不同進(jìn)樣速率制備的顆粒劑的產(chǎn)率和中位徑

圖3為不同進(jìn)樣速率制備的病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)致死率的影響，由圖3 可知，海藻酸鈉病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的致死率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，且與未加工成顆粒劑的病毒致死率的趨勢(shì)接近一致，說(shuō)明進(jìn)料速率沒(méi)有降低顆粒劑中病毒的殺蟲(chóng)活性。

圖3 不同進(jìn)料速率制備的病毒顆粒劑對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)致死率的影響

圖4為不同進(jìn)料速率制備的病毒顆粒劑的外觀(guān)形貌和粒徑分布。由圖4A～4 C 可以看出，不同進(jìn)料速率對(duì)病毒顆粒劑的形貌影響不大，所制備的顆粒劑均呈現(xiàn)不規(guī)則多面形狀，其中進(jìn)料速率為13 mL/min時(shí)，形貌較為規(guī)則。圖4 D 病毒顆粒劑的粒度分布顯示進(jìn)料速率對(duì)顆粒劑的粒徑和分布影響不顯著，粒徑分布較集中，D50在130 μm 左右，綜合病毒顆粒劑的產(chǎn)率，確定進(jìn)料速率為13 mL/min。

圖4 進(jìn)料速率對(duì)病毒顆粒劑的形貌和粒徑的影響

基于以上對(duì)病毒顆粒劑制備中海藻酸鈉用量、進(jìn)料速率等的優(yōu)化篩選，確定海藻酸鈉用量為1%，進(jìn)樣速率為13 mL/min。在此基礎(chǔ)上制備病毒顆粒劑(病毒含量1.0×106PBI/g)，并以甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)為對(duì)象，測(cè)定病毒顆粒劑的殺蟲(chóng)活性，具體結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可以看出，海藻酸鈉病毒顆粒劑的殺蟲(chóng)活性隨時(shí)間的趨勢(shì)圖與未加工的病毒的殺蟲(chóng)活性接近，說(shuō)明病毒經(jīng)包埋后沒(méi)有降低甜菜夜蛾核型多角體病毒的殺蟲(chóng)活性。

圖5 病毒顆粒劑化對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)致死率的影響

2.2 病毒顆粒劑的抗紫外輻射和耐熱性能

昆蟲(chóng)病毒對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較差，尤其對(duì)紫外線(xiàn)和高熱比較敏感，容易失活[13]。因此，本文考察了病毒顆粒劑化對(duì)其抗紫外和耐熱性能的影響，具體結(jié)果如圖6。從圖6 A 中可以看出，紫外處理1、2 h后的SeNPV 的死亡率分別為40.25%、33.33%；病毒顆粒劑的死亡率分別為59.83%、46.67%，顆粒劑化的SeNPV 對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的致死率均高于未包埋的SeNPV，說(shuō)明病毒顆粒劑化后對(duì)紫外線(xiàn)有一定的抵抗能力，可以降低紫外線(xiàn)對(duì)SeNPV 的殺滅作用。圖6 B 是不同處理溫度對(duì)病毒和病毒顆粒劑殺蟲(chóng)活力的影響。由圖中可以分析，35 ℃處理下甜菜夜蛾幼蟲(chóng)累積死亡率明顯高于25、45 ℃的處理，但在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，能增強(qiáng)病毒的活性。同時(shí)可以看到，相對(duì)于未包埋的昆蟲(chóng)病毒，病毒包埋后可以減輕溫度對(duì)病毒活力的影響，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)保持較高的致死率。

圖6 病毒顆粒劑化對(duì)其抗紫外輻射(A)和耐熱性能(B)的影響

3 結(jié)論

甜菜夜蛾核型多角體病毒是一類(lèi)具有環(huán)境友好、毒力專(zhuān)一性強(qiáng)的昆蟲(chóng)病毒類(lèi)生物農(nóng)藥，本研究以海藻酸鈉為包埋材料，結(jié)合對(duì)海藻酸鈉濃度、進(jìn)料量等工藝條件的優(yōu)化，利用噴霧法制備了病毒顆粒劑，所得的病毒顆粒劑形狀不規(guī)則，產(chǎn)品產(chǎn)率達(dá)到79.4%，病毒含量1.0×106PBI/g，D50在130μm 左右，且病毒顆粒劑具有良好的熱穩(wěn)定性和抗紫外性能。研究結(jié)果為甜菜夜蛾核型多角體病毒制劑的研究和應(yīng)用提供了思路。