經(jīng)皮耳穴-迷走神經(jīng)刺激對(duì)2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能的影響

薛 嬌,馬鵬壘,丁玉美,王彩霞

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和全球老齡化人口的增加,老年糖尿病的人群越來(lái)越多,而糖尿病患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的概率為正常人群的3倍左右[1]。Jacobs等[2]研究發(fā)現(xiàn),迷走神經(jīng)刺激可以改善老年人的記憶力。耳甲區(qū)是人體體表分布迷走神經(jīng)的特有區(qū)域,刺激該區(qū)域可以通過(guò)激活迷走神經(jīng)的耳支,將信號(hào)上傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng),最終來(lái)調(diào)控呼吸循環(huán)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等外周器官[3]。相關(guān)研究顯示,經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激可改善輕度認(rèn)知障礙患者的整體認(rèn)知功能,其中情景記憶和執(zhí)行功能改善尤為明顯,機(jī)制可能與耳穴刺激海馬突觸可塑性有關(guān)[4-5]。本研究基于炎癥反應(yīng)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路探討了經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激對(duì)2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶以及認(rèn)知功能的影響,以為該方法的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠32只,5～6周齡,體重160～200 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(蒙)2020-0003。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(EFY20230005)。動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)條件下,溫度(25±2)℃、濕度(50±5)%,維持固定的光照-黑暗周期(12 h),供給充足的潔凈飲用水和大鼠專用飼料、墊料。

1.2試劑與儀器 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海嘉楚,R100458),ECL超敏發(fā)光試劑盒(Oriscience,PD202),BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶,PC0020),大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(北京索萊寶,SEKR0009),蛋白提取液(MDL,MDL91201),蛋白酶抑制劑(MDL,MD912893),PI3K抗體(BIOSS,bs-128R),Akt抗體(BIOSS,bs-0115R),β-actin抗體(BIOSS,bs-0061R);Morris水迷宮(中國(guó)軟隆科技),包埋機(jī)(德國(guó)Leica),韓氏穴位電刺激治療儀(南京濟(jì)生醫(yī)療),光學(xué)顯微鏡、透射電鏡(日本Hitachi),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)THERMO),電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIORAD),恒溫箱(上海新苗),精密電子天平(德國(guó)Sartorius),PowerPac Universal電泳儀、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad),脫色搖床(TS-100海門其林貝爾),酶標(biāo)儀(瑞士帝肯),刀片、咬骨鉗、組織剪(康洪醫(yī)療器械)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將32只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、耳緣非迷走神經(jīng)刺激組、耳穴迷走神經(jīng)刺激組。除空白組外,其余組大鼠均參照文獻(xiàn)[6]方法給予高糖高脂飲食6周后單次腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素制備2型糖尿病模型,注射3 d后測(cè)得大鼠尾靜脈隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模2周后,每天于應(yīng)激前1 h,耳穴迷走神經(jīng)刺激組在大鼠雙側(cè)耳甲腔進(jìn)行電刺激,耳緣非迷走神經(jīng)刺激組在大鼠雙側(cè)耳緣處進(jìn)行電刺激,刺激強(qiáng)度均為2 mA,頻率2 Hz/15 Hz,每次30 min,1次/d,持續(xù)3周;空白組和模型組不給予電刺激。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1空間學(xué)習(xí)記憶能力 末次刺激結(jié)束后,實(shí)施Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備直徑1.2 m水池、直徑10 cm平臺(tái),水溫保持(26+2)℃。實(shí)驗(yàn)的前4 d進(jìn)行隱匿平臺(tái)實(shí)驗(yàn),每天每只大鼠進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn),分別從不同象限入水,記錄找到平臺(tái)的時(shí)間,時(shí)限120 s,最終第4天的時(shí)間即為逃避潛伏期;隱匿平臺(tái)實(shí)驗(yàn)后24 h進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),即去掉平臺(tái),觀察2 min內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的總次數(shù)。

1.4.2海馬組織形態(tài) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉150 mg/kg后,斷頭開顱取出全腦,于冷凍臺(tái)上剝離海馬組織。一側(cè)置于4%甲醛溶液中固定,乙醇脫水后石蠟包埋后制成4 μm厚切片,最后干燥脫蠟進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.4.3海馬組織中TNF-α含量 剪取大鼠部分海馬組織,制作成勻漿,采用ELISA試劑盒,嚴(yán)格參照說(shuō)明書步驟測(cè)得海馬區(qū)TNF-α的含量。

1.4.4海馬組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況 取凍存大腦海馬組織,制作成勻漿,收集上清液,運(yùn)用Western blot法測(cè)定總蛋白的濃度,根據(jù)測(cè)定的濃度制備電泳凝膠;使用三明治夾心法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,結(jié)束后用5%的脫脂奶粉液在室溫下進(jìn)行封閉1.5 h,結(jié)束后放入TBST洗3次;稀釋一抗,置于4 ℃孵育,搖床過(guò)夜,結(jié)束后置于TBST洗膜3次;次日稀釋二抗,置于室溫孵育,搖床2 h,TBST洗膜3次;用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料均呈正態(tài)分布,多組比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與空白組比較,模型組和耳緣非迷走神經(jīng)刺激組大鼠逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)(P均<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯減少(P均<0.05);與模型組和耳緣非迷走神經(jīng)刺激組比較,耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠水迷宮逃避潛伏期明顯縮短(P均<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和2型糖尿病各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.2各組大鼠海馬組織病理形態(tài)比較 空白組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞分布排列有序,胞核形態(tài)大小適中;模型組、耳緣非迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織細(xì)胞明顯減少,排列紊亂,部分細(xì)胞形態(tài)遭到破壞,胞核消失,胞體皺縮;耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織細(xì)胞排列基本正常,形態(tài)相對(duì)完整,局部可見少量的胞核發(fā)生固縮。見圖1。

圖1 空白組和2型糖尿病各組大鼠海馬組織形態(tài)(HE染色,×200)

2.3各組大鼠海馬組織中TNF-α含量比較 模型組大鼠海馬組織中TNF-α含量明顯高于正常組(P<0.05);耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織中TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05);耳緣非迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織中TNF-α含量較模型組降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 空白組和2型糖尿病各組大鼠海馬組織中TNF-α含量

2.4各組大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況比較 模型組大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05);耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05),耳緣非迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和2型糖尿病各組大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況比較

3 討 論

糖尿病對(duì)于大腦認(rèn)知功能方面有著潛在的不良影響,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。目前研究認(rèn)為,糖尿病與認(rèn)知功能障礙之間關(guān)聯(lián)的可能機(jī)制包括糖脂代謝紊亂、中樞炎癥、神經(jīng)元凋亡、血腦屏障受損和神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等[7]。因此,防止糖尿病患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙要從兩者之間的機(jī)制著手,探索最佳的干預(yù)方法。

頸部迷走神經(jīng)刺激術(shù)是治療癲癇和難治性抑郁癥的一種有效措施[8],但放置電刺激器需要暴露頸部的迷走神經(jīng),屬于有創(chuàng)操作,感染風(fēng)險(xiǎn)較高,不易被患者所接納。近年來(lái)大量研究證實(shí),經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激作為一種融合中西醫(yī)優(yōu)勢(shì)的治療技術(shù),其作用效果幾乎與傳統(tǒng)的頸部迷走神經(jīng)刺激術(shù)相同,且操作簡(jiǎn)便,不需要有創(chuàng)操作[3,9]。耳甲區(qū)又稱內(nèi)臟代表區(qū),經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激的部位是以耳穴“心”為主的位置,即迷走神經(jīng)耳支,通過(guò)激活迷走神經(jīng)耳支可以把信息傳遞到孤束核,進(jìn)而投射到腦區(qū),發(fā)揮中樞抗炎效應(yīng)[10];且可以促使耳甲區(qū)的迷走神經(jīng)傳入通路更快地到達(dá)中樞,發(fā)出更多的傳出性神經(jīng)沖動(dòng),進(jìn)而直接或間接激活抗炎途徑,減少炎癥因子的釋放,最終抑制中樞的炎癥反應(yīng)來(lái)改善認(rèn)知功能[11],但經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激對(duì)糖尿病認(rèn)知功能的影響及作用機(jī)制尚不清楚。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估動(dòng)物模型空間學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的主要方法[12]。本實(shí)驗(yàn)中大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)2型糖尿病大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙;耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠的逃避潛伏期和平臺(tái)穿越次數(shù)均較模型組明顯改善,說(shuō)明經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激可以有效改善2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

糖尿病的高糖狀態(tài)可通過(guò)多種途徑激活全身的炎癥反應(yīng),中樞炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)炎性因子的釋放,損傷神經(jīng)細(xì)胞,進(jìn)而影響認(rèn)知功能[13]。TNF-α是一種具有穩(wěn)態(tài)、免疫和炎癥作用的多效性細(xì)胞因子,是第一個(gè)被認(rèn)為參與2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的促炎細(xì)胞因子,其表達(dá)異?？赡苡绊懘竽X突觸可塑性[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織中TNF-α含量明顯升高,耳穴迷走神經(jīng)刺激組大鼠海馬組織中TNF-α含量較模型組明顯降低,表明經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)改善認(rèn)知功能。

PI3K/Akt信號(hào)通路是一種胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,Akt是P13K的下游蛋白,Akt被激活后可以調(diào)控多種通路,影響體內(nèi)糖代謝、神經(jīng)細(xì)胞的活化狀態(tài)[15];激活PI3K/Akt信號(hào)通路,可以抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耳穴迷走神經(jīng)刺激組海馬組織中PI3K、Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量均較模型組明顯升高,說(shuō)明經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激可能通過(guò)上調(diào)PI3K、Akt的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

綜上所述,經(jīng)皮耳穴迷走神經(jīng)刺激可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng),激活PI3K/Akt信號(hào)通路保護(hù)海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞而改善2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知功能,為該方法的臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。