腸復(fù)方對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的干預(yù)作用

張榮棋,馮淬靈,戴 中,張銀麗

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院,北京 100044)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病,病變主要涉及直腸和結(jié)腸,呈連續(xù)性彌漫性分布,臨床癥狀常見反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便,重癥患者可發(fā)生中毒性巨結(jié)腸、直腸結(jié)腸癌變、消化道出血、腸穿孔等并發(fā)癥,危及患者生命。我國UC的患病率約為11.6/10萬[1],且近年來呈現(xiàn)爆發(fā)性增長趨勢。本病病因和發(fā)病機制不清,病程長、易反復(fù),暫無根治方法,常用藥物包括美沙拉秦、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、生物制劑等[2]。中醫(yī)藥治療UC有悠久的歷史,積累了大量經(jīng)典方劑,如芍藥湯、白頭翁湯、參苓白術(shù)散、駐車丸等[3]。腸復(fù)方是北京大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科治療UC的協(xié)定處方,對美沙拉秦治療失敗的UC患者仍有效,能夠緩解活動期UC患者的臨床癥狀,促進鏡下黏膜修復(fù),但腸復(fù)方治療UC的機制尚不明確,故本研究通過觀察腸復(fù)方對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)急性UC小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)及結(jié)腸組織炎癥程度的影響,以期為腸復(fù)方的臨床應(yīng)用及機制研究提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠40只,6～8周齡,體重(20±2)g,由北京華阜康生物科技公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0008。小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗室,飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級,溫度26 ℃,濕度(40±5)%,通風(fēng)條件良好,12 h光照/黑暗交替,自由飲食、飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗方案已獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2022PHE035),實驗操作流程嚴(yán)格按照實驗動物管理規(guī)定進行。

1.2實驗藥物 腸復(fù)方組成:黃芪15 g、赤芍15 g、白芍15 g、白頭翁15 g、馬齒莧15 g、黃連6 g、白花蛇舌草15 g、炒槐花15 g、茜草15 g、金銀花15 g、地榆炭15 g,上述劑量為60 kg成年人1 d藥量,顆粒劑購自北京康仁堂,稱取顆粒重量約為41.15 g。美沙拉秦緩釋顆粒,上海愛的發(fā)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20143164,規(guī)格:500 mg×10袋/盒,60 kg成人1 d藥量為4 g。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[4]中標(biāo)準(zhǔn)體重小鼠(20 g)與成人(60 kg)給藥劑量換算公式,可以確定小鼠的腸復(fù)方顆粒給藥量約為0.17 g/d,美沙拉秦給藥量約為0.016 g/d,根據(jù)小鼠標(biāo)準(zhǔn)灌胃量0.1 mL/10 g,可計算腸復(fù)方給藥濃度約為0.85 g/mL,美沙拉秦給藥濃度約為0.08 g/mL。實驗時,用蒸餾水溶解中藥顆粒,制備所需藥物濃度;美沙拉秦緩釋顆粒用研磨缽研磨過篩后稱取所需量,用蒸餾水配置成混懸液。上述配置好的藥液儲存于4 ℃冰箱,使用前恢復(fù)至室溫、搖晃均勻。

1.3主要試劑 DSS(分子量36～50 kDa,AbMole,貨號:M9443-50g);糞便隱血定性檢測試劑盒(鄰聯(lián)甲苯胺法,Leagene,貨號:TC0511-300T);通用型組織固定液(主要成分為4%多聚甲醛,Servicebio,貨號:G1101-3ML);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(Servicebio,貨號:G1076-500ML);小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(Servicebio,貨號分別為GEM0004、GEM0001、GEM0008、GEM0002);Actin、閉合蛋白-1(Claudin-1)、閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、HRP-山羊抗小鼠、HRP-山羊抗兔(Servicebio,貨號分別為GB12001、GB112543、GB111402、GB23301、GB23303);TBST緩沖液(Servicebio,貨號:G2150-1L)。

1.4主要器材 電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,ME203E/02],高速組織研磨儀(Servicebio,KZ-II),臺式高速冷凍離心機(大龍,D3024R),渦旋混合器(Servicebio,MX-F),酶標(biāo)檢測儀(BioTeK,Epoch),多功能型搖床(水平+鐘擺+3D)(Servicebio,DS-3D100),電泳電源(可編程)(Servicebio,SPW-6S),抗體孵育盒(Servicebio,G9055-4),化學(xué)發(fā)光儀(CLINX,6100)。

1.5實驗方法 使用隨機數(shù)字表將小鼠隨機分為空白組、模型組、腸復(fù)方組、美沙拉秦組,每組10只。實驗第1～7天,模型組、腸復(fù)方組、美沙拉秦組小鼠自由飲用蒸餾水配置的3%DSS溶液,空白組小鼠自由飲用蒸餾水,期間至多3 d更換1次飲用水,以確保水質(zhì)潔凈。于實驗第8天撤除3%DSS溶液,恢復(fù)蒸餾水自由飲用。實驗第8～14天,腸復(fù)方組給予0.85 g/mL的腸復(fù)方顆粒溶液灌胃,美沙拉秦組給予0.08 g/mL的美沙拉秦緩釋顆?；鞈乙汗辔?空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃,均1次/d,連續(xù)7 d。

1.6樣本采集與處理 實驗第14天灌胃后,禁食不禁水24 h,于第15天將所有小鼠以CO2安樂死。處置小鼠后迅速解剖,取出從肛門到盲腸末端的結(jié)腸和直腸段,測量長度后,于結(jié)腸遠(yuǎn)端剪取0.5 cm置于4%多聚甲醛溶液中固定以進行后續(xù)組織病理分析,剩余結(jié)腸組織通過取樣管收集并儲存于液氮中,用于后續(xù)ELISA及Western blot檢測。

1.7檢測指標(biāo)及方法

1.7.1DAI 從實驗第1天開始,參照Cooper等[5]的方法,每天觀察小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)稀疏程度、色澤、飲食狀態(tài)、大便形態(tài)和肉眼血便情況,測量體重,以糞便隱血定性檢測試劑盒(鄰聯(lián)甲苯胺法)檢測糞便隱血情況,并計算DAI。DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3,得分范圍0～4分,0分代表正常,4分代表炎癥最大活動度。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(DAI)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.7.2結(jié)腸長度 取出小鼠肛門到盲腸末端的結(jié)腸和直腸段,于坐標(biāo)紙上拉直(但不拉伸)后測量長度。

1.7.3結(jié)腸組織病理評分 從固定液中取出各組小鼠結(jié)腸組織樣本,常規(guī)石蠟包理切片,行HE染色,由病理學(xué)專家于顯微鏡下盲法評估炎癥細(xì)胞浸潤程度及上皮組織損傷情況,參考Obermeier等[6]的評分標(biāo)準(zhǔn)(見表2),以兩項分?jǐn)?shù)之和為組織病理評分。

表2 潰瘍性結(jié)腸炎組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

1.7.4結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平 取適量結(jié)腸組織,置于勻漿器進行勻漿,離心,取上清液,按照 ELISA 試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀,在450 nm波長處以空白對照孔調(diào)零后測各孔吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出樣本濃度。

1.7.5結(jié)腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:取適量結(jié)腸組織,剪碎后置于勻漿管中,加入蛋白酶抑制劑、裂解液后于冰上進行充分勻漿、裂解,離心后收集上清,獲取總蛋白溶液;將蛋白溶液與還原型蛋白上樣緩沖液混合,經(jīng)沸水浴變性后,配置分離膠,上樣電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,倒掉封閉液后加入配置好的一抗稀釋液(Actin、ZO-1、Claudin-1稀釋比分別為1∶2 000,1∶1 000,1∶3 000),于4 ℃孵育搖床過夜,回收一抗,TBST緩沖液快速洗脫3次,每次5min,將二抗用TBST按照1∶5 000的比例進行稀釋后加入孵育槽中,搖床慢搖,室溫孵育30 min,TBST緩沖液快速洗脫3次,每次5 min,將洗脫并吸干水分的PVDF膜進行化學(xué)發(fā)光,曝光完成之后,保存原始圖為TIFF格式,用AIWBwellTM分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,計算指標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值,即蛋白相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,計量資料如果符合正態(tài)分布且方差齊,兩兩比較采用t檢驗,多組之間比較使用標(biāo)準(zhǔn)單因素方差分析、Tukey的多重比較;數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊,比較使用Brown-Forsythe和Welch單因素方差分析、Dunnett的T3多重比較;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的使用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 整個實驗過程,空白組小鼠飲食、飲水正常,體重呈增長趨勢,活動狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,毛色潔凈光澤,無腹瀉和血便,便隱血實驗為陰性。實驗第2天,各造模組部分小鼠便隱血試驗陽性;實驗第3天,各造模組部分小鼠大便變軟;實驗第4天,各造模組小鼠體重普遍較前下降,便隱血試驗普遍陽性;實驗第7天,小鼠普遍出現(xiàn)飲食飲水減少,精神不佳,毛發(fā)光澤變差且脫毛增加,活動度降低,排稀便且粘肛門,可見肉眼血便等;實驗第8～14天,腸復(fù)方組和美沙拉秦組小鼠上述癥狀均較模型組減輕。

2.2DAI 開始造模后,除空白組外,各造模組小鼠的DAI持續(xù)升高,于實驗第7天達(dá)到峰值,且均明顯高于空白組(P均<0.05),各造模組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。停止造模、開始灌胃后,各造模組小鼠的DAI均逐漸下降。于實驗第14天,模型組DAI明顯高于空白組(P<0.05);腸復(fù)方組、美沙拉秦組DAI均明顯低于模型組(P均<0.05),且與空白組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),腸復(fù)方組與美沙拉秦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 實驗過程中空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠疾病活動指數(shù)DAI評分

圖2 空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠實驗第7天、第14天疾病活動指數(shù)DAI評分

2.3結(jié)腸長度 各造模組小鼠結(jié)腸長度均明顯短于空白組(P均<0.05);腸復(fù)方組與美沙拉秦組小鼠結(jié)腸長度均明顯長于模型組(P均<0.05),腸復(fù)方組與美沙拉秦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸外觀及長度

2.4結(jié)腸組織病理形態(tài)及病理評分 空白組小鼠結(jié)腸黏膜上皮連續(xù)完整,排列規(guī)則,隱窩結(jié)構(gòu)正常,未見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,無病理損傷表現(xiàn)。模型組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,杯狀細(xì)胞、隱窩結(jié)構(gòu)大面積缺失,炎性細(xì)胞浸潤明顯,病理評分明顯高于空白組(P<0.05)。與模型組比較,腸復(fù)方組及美沙拉秦組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷較輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,病理評分明顯降低(P均<0.05),腸復(fù)方組與美沙拉秦組病理評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織HE染色病理形態(tài)及病理評分

2.5結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平 與空白組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6水平均明顯升高(P均<0.05),IL-4、IL-10水平均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,腸復(fù)方組和美沙拉秦組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05),IL-4、IL-10水平升高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);腸復(fù)方組和美沙拉秦組TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平

2.6結(jié)腸組織中ZO-1和Claudin-1蛋白表達(dá)情況 模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1和Claudin-1蛋白相對表達(dá)量與空白組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);腸復(fù)方組和美沙拉秦組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達(dá)量較模型組升高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),且腸復(fù)方組和美沙拉秦組ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 空白組和急性潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC的發(fā)病機制涉及遺傳易感性、環(huán)境因素、腸道菌群紊亂、免疫反應(yīng)失調(diào)、上皮屏障缺陷等,其中免疫反應(yīng)失調(diào)與炎癥因子調(diào)控異常密切相關(guān),是UC發(fā)病的重要機制之一。炎癥因子包括促炎因子及抗炎因子,主要由免疫細(xì)胞合成,健康狀態(tài)下腸黏膜中促炎因子和抗炎因子處于平衡的穩(wěn)態(tài),病理狀態(tài)下由于調(diào)控炎癥因子的信號通路功能失常,導(dǎo)致腸黏膜促炎因子和抗炎因子之間的平衡被打破,進而出現(xiàn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。TNF-α是一種關(guān)鍵的促炎因子,其可促進中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增生、成熟和活化,進而刺激單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子,從而引起級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致腸道的炎癥損傷[8]。IL-6與TNF-α關(guān)系密切,亦是重要的促炎因子,二者激活路徑相似、互相調(diào)節(jié),共同參與UC腸道炎癥與免疫調(diào)節(jié)過程[9]。IL-4與IL-10作為Th2細(xì)胞分泌的抗炎因子,可通過抑制TNF-α等多種促炎因子的合成、參與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化等途徑緩解UC腸道炎癥程度[10-11]。

上皮屏障缺陷亦是UC的重要發(fā)病機制之一。緊密連接蛋白是腸道黏膜的重要組成,由不同的咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)及閉合小環(huán)蛋白(ZOs)組成,將相鄰上皮細(xì)胞緊密連接,對維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性起重要調(diào)控作用[12]。腸上皮屏障完整存在的情況下,只有少數(shù)管腔抗原能夠進入固有層,此時黏膜能夠耐受并阻止炎性反應(yīng)的產(chǎn)生;但當(dāng)緊密連接蛋白的調(diào)控異常,上皮屏障發(fā)生缺陷,更多的管腔抗原進入固有層,使局部免疫細(xì)胞受到足量刺激時,就會導(dǎo)致腸道炎癥[9,13]。

近年來大量研究表明,中醫(yī)藥可通過修復(fù)腸道黏膜機械屏障、調(diào)控腸道微生物菌群、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等途徑改善UC臨床癥狀,促進黏膜愈合,改善生活質(zhì)量,降低復(fù)發(fā)率等[14]。本團隊根據(jù)UC活動期反復(fù)發(fā)作腹痛、腹瀉伴黏液血便的臨床特點,認(rèn)為其主要病機為濕熱蒸壅,氣滯毒聚于腸腑,阻遏氣機,久而化熱,灼傷腸絡(luò),腐而成瘍,熱毒熾盛,下痢膿血。本實驗所用腸復(fù)方是由芍藥湯、白頭翁湯、槐花散等治療“痢疾”“便血”的經(jīng)典方劑化裁而成,UC活動期應(yīng)當(dāng)以除腸中實邪為第一要務(wù),故以黃連、白頭翁、馬齒莧、白花蛇舌草、金銀花清除腸中濕熱毒邪;再以白芍、赤芍、茜草、地榆炭涼血止痢,黃芪健脾益氣;諸藥合用以清熱解毒、涼血止痢、健脾益氣,共同調(diào)和腸道氣血,正所謂“調(diào)氣則后重自除,行血則便膿自愈”?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃連、馬齒莧、白花蛇舌草具有抗炎作用,可通過多種信號通路下調(diào)TNF-α、IL-6等促炎因子及IL-10等抗炎因子表達(dá)[15];黃芪、白芍亦能通過調(diào)節(jié)腸道免疫功能以減輕炎癥損傷,還可以上調(diào)Occludin、Claudin-1、ZO-1等蛋白表達(dá),促進腸黏膜屏障修復(fù)[16-17];茜草、地榆炭能調(diào)節(jié)免疫功能,減輕局部炎癥反應(yīng)[18-19]。

本實驗通過3%DSS自由飲用建立小鼠急性UC,該模型與人類UC類似,除了體重減輕、腹瀉及便血等典型癥狀外,結(jié)腸組織病理也常見UC病變特點,如遠(yuǎn)端病變較近端重、黏膜損傷較表淺等。此外,結(jié)腸長度也可以作為衡量結(jié)腸宏觀炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo),炎癥程度高時,結(jié)腸長度縮短[20]。本研究中模型組小鼠體重減輕,伴有腹瀉、便血,DAI明顯升高,結(jié)腸明顯縮短,結(jié)腸上皮組織損傷嚴(yán)重、炎性細(xì)胞廣泛浸潤,結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6水平升高,IL-4、IL-10水平降低,證實DSS可成功誘導(dǎo)急性UC;腸復(fù)方可改善DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠的癥狀,降低結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6水平,減輕結(jié)腸組織炎癥程度,且其效果不劣于美沙拉秦。此外,本研究腸復(fù)方組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達(dá)量相比模型組有升高趨勢,推測腸復(fù)方可能通過上調(diào)結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá),從而對黏膜屏障起到保護作用,但需要進一步驗證。

綜上所述,腸復(fù)方可調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá),改善UC小鼠的癥狀,減輕結(jié)腸組織炎癥反應(yīng),同時可能對結(jié)腸組織黏膜屏障有一定保護作用,且其作用不劣于美沙拉秦,為臨床治療UC提供了額外的選擇,也為腸復(fù)方作用機制的進一步研究提供了參考,但腸復(fù)方具體通過何種信號通路對炎癥因子進行調(diào)控仍不明確,需要更深層次的研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。