益氣固表丸對慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型線粒體中SIRT5表達(dá)的影響

蒙 婷,徐 丹,米葉斯?fàn)枴べI買提艾力,荊 晶,李風(fēng)森1,

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2. 新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000;3. 新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)臨床研究基地,新疆 烏魯木齊 830000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來大量研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能異常也是導(dǎo)致COPD的機(jī)制之一,調(diào)控線粒體功能成為研究COPD的一個(gè)重要方向[1]。SIRT5主要位于線粒體中,是通過去乙酰化抗氧化劑、線粒體維持和能量代謝蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),有較明顯的去琥珀?；饔肹2-3]。而SIRT5調(diào)控的琥珀酰化與線粒體功能密切相關(guān),琥珀?；瘏⑴c線粒體功能障礙是許多疾病的一個(gè)共同因素[4-6]。益氣固表丸是在六君子湯的基礎(chǔ)上加減化裁而來,具有健脾益肺、化痰止咳的功效,是治療COPD的有效藥物,起效機(jī)制與氧化還原過程、細(xì)胞能量凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程、細(xì)胞成分組成有關(guān)[7]。但益氣固表丸是否可以影響線粒體發(fā)生琥珀?；瘡亩纳艭OPD線粒體功能障礙尚不明確,故本研究通過SIRT5調(diào)控COPD細(xì)胞模型發(fā)生琥珀酰化,探究了益氣固表丸對COPD細(xì)胞線粒體琥珀?；挠绊?進(jìn)一步從分子生物學(xué)方面為COPD的臨床治療思路及用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞及藥物 人支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE 購自中橋新舟;益氣固表丸由黨參、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風(fēng)組成,益氣固表丸含藥血清為前期大鼠實(shí)驗(yàn)制備的凍存血清。

1.2試劑及儀器 KM培養(yǎng)基(Hyclone,USA);胎牛血清(FBS,Hyclone,USA);青鏈雙抗(上海生工);二甲基亞砜(DMSO,USA)、Lipofectamine?RNAi MAX Reagent、Trizol(Thermo,USA);SYBRGreen PCR試劑盒(Thermo,F-415XL,USA);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,K1622,USA);線粒體膜電位試劑盒(abcam,C2003S,中國);ATP ELISA試劑盒(abcam,S0026,中國);96孔培養(yǎng)板及6孔培養(yǎng)板(Costar,USA);酶標(biāo)檢測儀(Thermo, MK3,USA);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,Scientific8000,USA);低溫冷凍離心機(jī)(Sigma,3K15,USA);Real-time檢測儀(ABI-7500,USA);渦旋混合器(Scientific Industries);RT-6100 酶標(biāo)儀(雷杜,rt6100,中國);熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX7,日本)。

1.3COPD細(xì)胞模型建立 在37 ℃、5%CO2條件下,將16HBE細(xì)胞接種于含有FBS和青鏈雙抗的KM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選用紅云紅河煙草集團(tuán)的紅河牌香煙(每支香煙焦油含量11 mg,煙氣煙堿含量 1 mg,煙氣一氧化碳含量13 mg),點(diǎn)燃后將過濾嘴端接注射器,將600 mL煙霧注入含25 mL的玻璃瓶中,即為100%香煙煙霧提取物(CSE)原液。CSE在實(shí)驗(yàn)前30 min制備,經(jīng)過濾除菌后,用KM培養(yǎng)基稀釋為1.25%,2.5%,5%,10%,20%的濃度分別處理1×105個(gè)/mL 16HBE細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h。每個(gè)濃度細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間,每孔加入20μLMTT(5 mg/mL),37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min,用連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(波長492 nm)測定各孔的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞抑制率[(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值)×100%],選取CES的最佳干預(yù)濃度和時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染、RT-qPCR篩選SIRT5最佳敲降靶序 將COPD細(xì)胞分為COPD組、COPD+siRNA 空轉(zhuǎn)組、COPD+siRNA119組、COPD+siRNA 120組、COPD+siRNA 141組。每組調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,通過Lipofectamine?RNAi MAX Reagent 轉(zhuǎn)染siRNA SIRT5,用Trizol提取細(xì)胞線粒體總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR,以GAPDH作為內(nèi)參基因。SIRT5引物序列:上游為5’-GGAGCAAGGAGCCCAACGCCGGGCA-3’,下游為5’-CCACAAGAGGTACATCGAGTTTTAA-3’;GAPDH引物序列:上游為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,下游為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。用2-ΔΔCT方法分析SIRT5mRNA相對表達(dá)量。并利用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,選取轉(zhuǎn)染編號最佳的siRNA120用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞分組干預(yù) 實(shí)驗(yàn)設(shè)6組:正常組16HBE細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);COPD組COPD造模細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);COPD+siRNA空轉(zhuǎn)組取COPD細(xì)胞,siRNA空轉(zhuǎn)染后培養(yǎng);COPD+siRNA SIRT5組取COPD細(xì)胞,采用最佳的siRNA120轉(zhuǎn)染后培養(yǎng);COPD+益氣固表丸組取COPD細(xì)胞,加入20%益氣固表丸含藥血清培養(yǎng);COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組取COPD細(xì)胞,采用最佳的siRNA120轉(zhuǎn)染后,加入益氣固表丸含藥血清培養(yǎng)。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1細(xì)胞形態(tài) 在電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形狀、透亮度、折光性及密度。

1.6.2線粒體膜電位 將各組細(xì)胞按1×106個(gè)/mL的濃度重懸于培養(yǎng)基中;加入配置好的JC-1染液;在細(xì)胞培養(yǎng)箱中按37 ℃、5%CO2的條件孵育10～30 min;用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,再離心收集,重復(fù)2次,以洗滌細(xì)胞;在激發(fā)波長488～505 nm、發(fā)射波長515～575 nm條件下,采用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號的強(qiáng)度。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi),產(chǎn)生紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí),J為單體不聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi),產(chǎn)生綠色熒光。使用Image J計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.6.3細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量 細(xì)胞按1×106個(gè)/mL重懸于培養(yǎng)基中,加入配置好的10 μmol/L DCFH-DA工作液, 37 ℃孵育30～60 min;1 000×g離心5～10 min收集細(xì)胞,用PBS 洗滌1～2次,離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測;將收集好的細(xì)胞用PBS重懸,在激發(fā)波長485～500 nm、發(fā)射波長525 nm條件下進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.6.4細(xì)胞中ATP含量 ATP反應(yīng)液用10 mL含2 mmol/L EDTA的0.1 mol/L pH7.75 Tris-醋酸緩沖液稀釋;在細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔含100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液),每孔加入0.1 mL ATP釋放因子,室溫中反應(yīng)5 min;吸取0.1 mL細(xì)胞溶解物,加入到另一塊細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中,置于自動(dòng)多孔熒光檢測儀中,用自動(dòng)加樣器,每孔加入20 μL ATP反應(yīng)液,酶標(biāo)儀于636 nm處測各樣本吸光度值。

1.6.5細(xì)胞中SIRT5表達(dá)情況 按照1.4中方法檢測并計(jì)算各組細(xì)胞中SIRT5 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1顯微鏡下細(xì)胞形態(tài) 正常組細(xì)胞折光性好,細(xì)胞膜邊界清晰,形態(tài)展開;COPD組和COPD+siRNA空轉(zhuǎn)組細(xì)胞皺縮變圓,細(xì)胞密度低,細(xì)胞狀態(tài)差; COPD+siRNA SIRT5組細(xì)胞狀態(tài)更差,細(xì)胞大量皺縮變圓,折光性變差,細(xì)胞膜邊界不完整,無展開形態(tài);COPD+益氣固表丸組 、COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組細(xì)胞狀態(tài)明顯改善,細(xì)胞透光性變強(qiáng)。見圖1。

圖1 正常組和慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型各組細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.2顯微鏡下線粒體膜電位情況 與正常組比較,COPD各組紅色熒光減弱,綠色熒光增強(qiáng),表明線粒體膜電位下降,線粒體出現(xiàn)功能障礙;與COPD組比較,COPD+益氣固表丸組 、COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組紅色熒光增強(qiáng),綠色熒光減弱。見圖2。

圖2 正常組和慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型各組電鏡下線粒體膜電位熒光情況(×400)

2.3線粒體膜電位及線粒體中ROS含量 與COPD組比較,COPD+siRNA SIRT5組線粒體膜電位明顯降低(P<0.05),ROS含量明顯升高(P<0.05);與COPD組和COPD+siRNA SIRT5組比較,COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組線粒體膜電位均明顯升高(P均<0.05),ROS含量均明顯降低(P均<0.05)。見圖3。

圖3 正常組和慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型各組線粒體膜電位及線粒體中ROS含量

2.4細(xì)胞中ATP含量 COPD各組ATP含量均明顯低于正常組(P均<0.05),且COPD+siRNA SIRT5組ATP含量明顯低于COPD組(P<0.05); COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組ATP含量均明顯高于COPD組和COPD+siRNA SIRT5組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 正常組和慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型各組細(xì)胞中ATP含量

2.5細(xì)胞中SIRT5 mRNA相對表達(dá)量 COPD各組SIRT5 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05),且COPD+siRNA SIRT5組SIRT5 mRNA相對表達(dá)量明顯低于COPD組(P<0.05);COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組SIRT5 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于COPD+siRNA SIRT5組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 正常組和慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞模型各組細(xì)胞中SIRT5 mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

西醫(yī)對于緩解COPD的臨床癥狀、延長急性發(fā)作的間隔期、縮短發(fā)作時(shí)間及減少發(fā)作次數(shù)的治療手段有限。隨著中醫(yī)治療優(yōu)勢的不斷顯現(xiàn),中藥在COPD的臨床治療中發(fā)揮了重要作用。中醫(yī)“治病必求于本”,本虛是決定COPD發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵因素?！峨y經(jīng)·六十九難》提示“虛則補(bǔ)其母”,脾為肺之母,脾主運(yùn)化,其功能正常,才能化生精、氣、血、津液給人體提供足夠的養(yǎng)料,人體組織才能得到充分的營養(yǎng)。多數(shù)研究者運(yùn)用培土生金的方法治療COPD穩(wěn)定期取得了良好的療效,可以進(jìn)一步改善患者的呼吸癥狀及全身癥狀[8-10]。張少華等[7]研究發(fā)現(xiàn),具有脾虛特征的COPD 患者外周血有核細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧含量異常,線粒體膜電位在肺脾氣虛組最低,細(xì)胞內(nèi)活性氧含量在肺脾氣虛組最高,提示COPD 患者線粒體功能障礙與脾虛關(guān)系密切。益氣固表丸主要作用是健脾益肺,根據(jù)上述研究推測益氣固表丸可能改善COPD患者線粒體功能障礙。SIRT5是Sirtuin家族7個(gè)成員之一,是負(fù)向調(diào)控賴氨酸琥珀酰化修飾的一種去琥珀?；竅11]。有研究發(fā)現(xiàn),SIRT5可以將超氧化物歧化酶1(SOD1)賴氨酸123位點(diǎn)上的琥珀?；撊?降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量,說明琥珀?；种屏薙OD酶活性并影響其功能,通過上調(diào)SOD1的酶活性,可促進(jìn)ROS的清除[12]。Sadhukhan等[13]報(bào)道,SIRT5敲除小鼠在禁食和運(yùn)動(dòng)條件下心臟出現(xiàn)脂肪酸代謝受損和ATP生成減少。Guedouari等[14]發(fā)現(xiàn)在能量缺失狀態(tài)下,線粒體伸長以逃避自噬降解,SIRT5缺失抑制了線粒體延伸,導(dǎo)致線粒體吞噬增加,表明SIRT5能保護(hù)線粒體在能量缺失狀態(tài)下不發(fā)生斷裂和降解。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn),SIRT5可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)和Bcl-2,減弱順鉑誘導(dǎo)的人腎HK-2細(xì)胞凋亡和線粒體損傷。

香煙煙霧是導(dǎo)致COPD發(fā)生及疾病進(jìn)展的主要原因之一,可以干擾線粒體能量的產(chǎn)生,造成上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,引發(fā)氣道頑固性炎癥反應(yīng)[16-17]。長期暴露于CSE的呼吸道上皮細(xì)胞的觀察結(jié)果顯示,CSE在線粒體形態(tài)學(xué)上引起了類似的畸變[18],這些形態(tài)學(xué)改變與線粒體功能障礙之間有潛在的聯(lián)系,包括ATP含量降低、線粒體膜電位下降、ROS含量升高[19]。本研究使用CSE誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞損傷,結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)功能障礙,能量合成和轉(zhuǎn)化功能的下降導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)及密度的改變,同時(shí)線粒體膜電位、ATP含量及SIRT5 mRNA相對表達(dá)量下降,ROS含量升高;COPD+益氣固表丸組與COPD組相比,細(xì)胞形態(tài)明顯改善,線粒體膜電位、ATP含量、SIRT5 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高,ROS含量明顯降低,證明益氣固表丸可上調(diào)SIRT5表達(dá),能夠改善細(xì)胞膜電位及線粒體功能障礙。另外與COPD+siRNA SIRT5組比較, COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組線粒體膜電位、ATP含量、SIRT5 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高,ROS含量明顯降低。因此推測益氣固表丸可能參與調(diào)控與SIRT5表達(dá)相關(guān)的某些重要通路或關(guān)鍵酶的活性,對SIRT5的表達(dá)起作用,也可能具有與SIRT5同樣的功能,參與調(diào)控琥珀?；揎?從而改善線粒體功能障礙。

綜上所述, SIRT5表達(dá)量與COPD線粒體功能障礙有關(guān),其表達(dá)減少會(huì)加重COPD線粒體功能障礙,益氣固表丸可以通過上調(diào)SIRT5的表達(dá)而改善COPD線粒體功能障礙;在SIRT5缺失的情況下,益氣固表丸可能通過其他作用靶點(diǎn)影響SIRT5的表達(dá)調(diào)控COPD線粒體功能,SIRT5調(diào)控的琥珀?；赡苁且鏆夤瘫硗柚委烠OPD的新的作用靶點(diǎn),有待進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。