基于脊髓背角自噬與凋亡探討推拿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的作用機制

陳玲女,盧棟明,王天翊,鄭玉嬌,梁英業(yè),楊 鵬,唐宏亮,龐 軍

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023;3. 防城港市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 防城港 538000)

神經(jīng)病理性疼痛是慢性疼痛常見原因之一,表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛等。據(jù)統(tǒng)計,2020年全球神經(jīng)病理性疼痛患病率高達10%[1]。該病發(fā)病率高,病理機制復(fù)雜,且常合并失眠、抑郁和焦慮等情感障礙,嚴重影響患者的健康[2-3]。神經(jīng)損傷和炎癥是神經(jīng)病理性疼痛多種生理和病理過程的基礎(chǔ),會導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增強,誘發(fā)疼痛形成[4]。炎癥在脊髓背角激活是神經(jīng)病理性疼痛形成的關(guān)鍵,如何控制炎癥對神經(jīng)病理性疼痛的影響是當下研究的熱點。近年研究表明,脊髓背角自噬與凋亡均參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展,并與炎癥密切相關(guān),促進脊髓背角細胞自噬,可以減少促炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的釋放,并能抑制細胞凋亡[5];促進抗凋亡因子Bcl-2的表達可降低Caspase-3水平,在抑制凋亡發(fā)生的同時伴隨著TNF-α的降低[6-7]。由此可見,促進自噬或抑制凋亡均可減輕炎癥反應(yīng),緩解神經(jīng)病理性疼痛,但二者之間存在相互拮抗、相互協(xié)同作用的關(guān)系[8],如何正確掌控二者的作用機制,明確二者在神經(jīng)病理性疼痛中的內(nèi)在聯(lián)系,有助于深入了解神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制和突破治療上的困境。推拿治療疼痛由來已久,可有效緩解疼痛,且無不良反應(yīng)[9-10]。課題組前期研究表明,推拿能通過激活自噬,促進IL-1β的清除,減輕疼痛[11];還可以通過抑制大鼠神經(jīng)元凋亡,緩解疼痛的發(fā)展[12]。本研究旨在通過觀察推拿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角自噬相關(guān)因子與凋亡相關(guān)因子表達的影響,進一步明確推拿對神經(jīng)病理性疼痛自噬與凋亡的協(xié)同調(diào)控作用,明確推拿發(fā)揮抑炎鎮(zhèn)痛作用的可能靶點。

1 實驗材料與方法

1.1動物 健康SPF級雌性SD大鼠30只,體重250～300 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004,使用許可證號:SYXK(桂)2019-0001。動物飼養(yǎng)于SPF級別動物房,室內(nèi)安靜整潔,溫度、光照和通風恒定適宜,墊料飼料飲用水正常供應(yīng),平均每4 d更換墊料1次,每天更換飲用水及飼料1次,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核并批準(倫理號:DW20230302-021)。

1.2試劑與儀器 兔抗大鼠Beclin1、LC3、Bcl-2、Caspase-3和β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),TNF-α ELISA試劑盒(廣西威諾科技有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYB RGreen PCR熒光試劑(南京諾維贊生物科技有限公司)。按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號:200710187403．1),von-Frey纖維絲(美國IITC公司),電泳儀(美國伯樂公司)。

1.3實驗方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、推拿組、假推拿組,每組6只。模型組、推拿組和假推拿組參照文獻[13]方法建立神經(jīng)病理性疼痛模型:大鼠禁食12 h后按體重給予3%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后固定,備皮消毒,沿著脊柱方向切開皮膚,分離筋膜肌肉,鉗斷L4～6脊椎左側(cè)的橫突,暴露L5脊神經(jīng),用可吸收性縫合線結(jié)扎。假手術(shù)組僅暴露L5脊神經(jīng)不結(jié)扎,正常組不進行手術(shù)。術(shù)后第1天開始,推拿組用布袋束縛大鼠后,采用按摩推拿手法模擬儀(設(shè)置刺激強度為4N),以點、撥、揉方法依次刺激膽經(jīng)上環(huán)跳、陽陵泉、懸鐘穴共18 min(每側(cè)9 min),1次/d,連續(xù)干預(yù)14 d;假推拿組用布袋束縛大鼠后,輕撫其后肢18 min(每側(cè)9 min),1次/d,連續(xù)干預(yù)14 d;正常組、假手術(shù)組、模型組大鼠不進行干預(yù),觀察14 d。

1.4檢測指標及方法

1.4.1機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應(yīng)潛伏期 術(shù)前及術(shù)后第1,3,7,14 d干預(yù)后,用von-Frey纖維絲按刺激強度由小至大垂直刺激大鼠左后足底心,每個強度重復(fù)刺激5次,間隔時間為3 s,5次中出現(xiàn)3次及以上的縮足或舔爪反應(yīng)記為陽性,實驗重復(fù)3次,取平均值作為最終的機械性刺激縮足閾值。于機械性刺激縮足閾值測定后適應(yīng)1 h測定熱痛縮足反應(yīng)潛伏期,熱板痛覺測試儀設(shè)為55 ℃,將大鼠放置于測試儀的封閉且透明玻璃盒內(nèi)并啟動計時器,當大鼠出現(xiàn)快速抬足、頻繁舔足等現(xiàn)象時停止計時并做記錄,每只共測定3次,每次間隔2 min,取平均值作為最終的熱痛縮足反應(yīng)潛伏期。

1.4.2血清TNF-α水平 術(shù)后第14天干預(yù)結(jié)束后,麻醉各組大鼠,采腹主動脈血,運用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α水平。

1.4.3脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況 取-80 ℃保存的各組大鼠L4～6脊髓背角組織,采用Western blot技術(shù)檢測:采用BCA法蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)濃度用PBS稀釋液進行配平,按比例加入蛋白上樣緩沖液并充分混勻后100 ℃金屬浴10 min;將膠板、配置好的電泳液放入電泳槽,垂直向上拔出梳子,加入3 μL Marker標記物后根據(jù)測定的蛋白濃度,每孔加入30 μg蛋白質(zhì),120 V恒壓電泳,直到溴酚藍跑到凝膠底部;將切好的電泳凝膠與PVDF膜對齊放入轉(zhuǎn)膜槽中轉(zhuǎn)膜,300 mA轉(zhuǎn)60 min;室溫封閉PVDF膜15 min,用1×TBST溶液洗滌3次,每次10 min,再放入稀釋好的一抗溶液中4 ℃孵育過夜;洗滌3次后,將膜于二抗(HRP山羊抗兔IgG,1∶5 000)溶液中室溫孵育1 h;均勻滴加ECL試劑后,顯影儀掃描PVDF膜,并用Image J軟件分析條帶的光密度。參考目標蛋白條帶的光密度值和內(nèi)參(β-actin)計算出每個目標蛋白的相對表達量。

1.4.4脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA表達情況 取-80 ℃保存的各組大鼠L4～6脊髓背角組織,采用RT-qPCR法檢測:提取RNA并測定濃度和純度,反轉(zhuǎn)錄成cDNA;以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)GenBank的基因序列設(shè)計引物(引物序列見表1),由捷尼斯生物科技有限公司合成并純化。PCR擴增反應(yīng)的總體積為20 μL,包括2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 8.2 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s(40個循環(huán)),溶解曲線95 ℃ 15 s、65 ℃ 1 min、97 ℃。采用2-ΔΔCT法計算Beclin1、Bcl-2 mRNA的相對表達量。

表1 目的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應(yīng)潛伏期比較 術(shù)前各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應(yīng)潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);術(shù)后第1天、第3天,模型組、推拿組、假推拿組大鼠機械性刺激縮足閾值均明顯低于同期正常組、假手術(shù)組(P均<0.05),熱痛縮足反應(yīng)潛伏期均明顯短于同期正常組、假手術(shù)組(P均<0.05),模型組、推拿組、假推拿組之間機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應(yīng)潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);術(shù)后第7天、第14天,推拿組大鼠機械性刺激縮足閾值均明顯高于同期模型組和假推拿組(P均<0.05),熱痛縮足反應(yīng)潛伏期均明顯長于同期模型組和假推拿組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應(yīng)潛伏期

2.2各組大鼠血清TNF-α水平比較 模型組和假推拿組血清TNF-α水平均明顯高于正常組和假手術(shù)組(P均<0.05);推拿組血清TNF-α水平明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05),假推拿組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠血清 TNF-α水平

2.3各組大鼠脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況比較 與正常組和假手術(shù)組比較,模型組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,推拿組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),假推拿組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2 、Caspase-3蛋白相對表達量變化均不明顯(P均>0.05)。推拿組Beclin1、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯高于假推拿組(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量明顯低于假推拿組(P<0.05),推拿組與假推拿組LC3Ⅱ蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖3及圖4。

圖3 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達條帶

圖4 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量

2.4各組大鼠脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 正常組和假手術(shù)組Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。模型組Beclin1 mRNA相對表達量均明顯低于正常組和假手術(shù)組(P均<0.05);Bcl-2 mRNA相對表達量明顯低于正常組(P均<0.05),但與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。推拿組Beclin1 mRNA相對表達量明顯高于模型組和假推拿組(P<0.05),模型組與假推拿組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。推拿組和假推拿組Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05),推拿組與假推組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛病理生理機制十分復(fù)雜,涉及多種細胞分子、因子以及信號通路等[14]。當神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時,神經(jīng)損傷會導(dǎo)致細胞釋放包括炎癥因子在內(nèi)的各種介質(zhì),其中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子會引起炎癥級聯(lián)反應(yīng),通過調(diào)控各種離子通道的活性,放大并降低神經(jīng)元興奮的閾值,增加痛覺敏感性,誘發(fā)并促進疼痛的發(fā)生[15]。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生,激活后可引起炎性細胞聚集和炎性細胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等的釋放,進而介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)[16],是啟動和維持神經(jīng)性疼痛狀態(tài)的關(guān)鍵性病理因素之一,在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持方面起著重要作用[17-18]。TNF-α還對細胞的激活、增殖和程序性死亡的啟動及維持具有重要作用,其可以促進Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達,抑制Bcl-2的表達,促進細胞凋亡[19];另外其過度表達時會抑制細胞自噬作用,產(chǎn)生炎性產(chǎn)物,促進細胞凋亡[20],但自噬與凋亡也可以影響TNF-α的產(chǎn)生與分泌,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng),所以促進自噬可以抑制TNF-α而起到抗凋亡的作用。

自噬與凋亡均是細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式,自噬和凋亡存在共用的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白,聯(lián)系密切而復(fù)雜,在不同的條件下,自噬與細胞凋亡之間會產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用,但二者之間的協(xié)調(diào)與轉(zhuǎn)換機制目前仍未明確[21]。神經(jīng)病理性疼痛與神經(jīng)細胞自噬和凋亡密切相關(guān),疼痛發(fā)生后,神經(jīng)細胞會出現(xiàn)一系列病理反應(yīng),其中細胞產(chǎn)生的促炎因子引起炎癥反應(yīng),并激活自噬與凋亡,而自噬激活后可以反過來通過抑制促炎因子的分泌發(fā)揮抑制炎癥的作用[22-23]。既往研究報道,上調(diào)自噬相關(guān)因子Bcline1和LC3B表達和降低 IL-1β、TNF-α水平可明顯減輕神經(jīng)病理性疼痛,說明自噬對神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持有重要作用,自噬被激活后可通過自噬小體吞噬損傷的細胞器,清除有害的炎性因子,減少炎癥因子的釋放,從而緩解疼痛反應(yīng)[24-26]。Hu等[27]研究證實,通過減少脊髓神經(jīng)元凋亡可以減少TNF-α的產(chǎn)生以及下調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達,可以抑制炎癥反應(yīng)和緩解神經(jīng)病理性疼痛,證明神經(jīng)元發(fā)生凋亡在神經(jīng)病理性疼痛中起重要作用。馮濤等[28]研究報道,雷帕霉素可誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元自噬,抑制細胞凋亡,提示在促進神經(jīng)病理性疼痛自噬的同時,對凋亡產(chǎn)生了抑制作用,表明在神經(jīng)病理性疼痛中自噬與凋亡之間存在相互拮抗的關(guān)系。

Beclin1、Bcl-2是自噬與凋亡交互作用的重要調(diào)節(jié)子[29]。Beclin1是自噬體成核的關(guān)鍵調(diào)控因子之一,是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵靶點[30]?？沟蛲龅鞍譈cl-2能夠直接或間接地抑制Cyt C的釋放,是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白,Beclin1可借由BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合進行交互,當交互作用發(fā)生時會抑制細胞自噬的發(fā)生;二者結(jié)合的破壞可以促進自噬,抑制細胞凋亡[31]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生后,疼痛及炎癥反應(yīng)與Beclin1、Bcl-2的表達密切相關(guān)。

中醫(yī)認為神經(jīng)病理性疼痛是由于內(nèi)傷外感等所致的“痹證”“筋傷”?！鹅`樞·經(jīng)脈》記載:“膽足少陽之脈……是主骨所生病者,頭痛頷痛,目銳痛,缺盆中腫痛……諸節(jié)皆痛。”足少陽膽經(jīng)循行周身筋肉骨節(jié),若少陽膽經(jīng)經(jīng)絡(luò)不通,氣血阻滯會導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)所過之處發(fā)生疼痛。同時《靈樞·根結(jié)》有“少陽為樞”的說法,認為通利少陽經(jīng)可以使周身經(jīng)絡(luò)氣血通暢調(diào)達。推拿治療疼痛由來已久,推拿通過各種手法良性刺激患者的痛處以及作用于相關(guān)臟腑經(jīng)絡(luò)腧穴,可以疏經(jīng)通絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛和理筋整復(fù)。推拿少陽膽經(jīng)可以促進氣血調(diào)和、經(jīng)絡(luò)暢通,以達到治療痹證疼痛的作用[11,32]?！夺樉募滓医?jīng)》中言“腰脅相引痛急,髀筋脛,腰痛不可屈伸,痹不仁,環(huán)跳主之,筋急,陽陵泉主之”。環(huán)跳穴是足少陽膽經(jīng)與足太陽膀胱經(jīng)的交會點,主“筋病”的同時還主“骨病”;陽陵泉為筋會,是足少陽膽經(jīng)與周身筋脈的交會點,有強經(jīng)絡(luò)、壯骨節(jié)之功效,主治下肢痿痹、麻木,膝腫痛等;懸鐘為髓會,主治頸項僵痛、胸脅疼痛、腰膝腿痛等。故選擇環(huán)跳、陽陵泉、懸鐘3個穴位對大鼠進行推拿手法干預(yù)。

本實驗中模型組與正常組比較,大鼠術(shù)后痛閾降低,血清TNF-α水平和脊髓組織中Caspase-3蛋白相對表達量均明顯增高,脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯降低,這說明發(fā)生神經(jīng)損傷后,促炎因子TNF-α釋放增加,激活炎癥反應(yīng)進而誘發(fā)疼痛,且自噬受到抑制,凋亡增加。推拿組大鼠干預(yù)第7天、第14天的機械性刺激縮足閾值均明顯高于同期模型組,熱痛縮足反應(yīng)潛伏期均明顯長于同期模型組,且血清TNF-α水平和脊髓組織中Caspase-3蛋白相對表達量均明顯低于模型組,脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于模型組,說明推拿可減輕神經(jīng)病理性疼痛,其可能是通過上調(diào)Beclin1和Bcl-2的表達、下調(diào)Caspase-3的表達,從而激活自噬,抑制凋亡,進而減少促炎因子的釋放,減輕炎癥反應(yīng)而緩解疼痛。但本研究尚未能完整地揭示推拿對Beclin1和Bcl-2的具體作用機制,在研究的深度和廣度上尚有不足,未來需進一步完善相關(guān)研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。