不同品種白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的活性和含量差異分析

張思璐 湯冰璇 耿智德 呂宏斌 鐘毓 李思宇 朱梓蕓 夏龍飛

張思璐，湯冰璇，耿智德，等. 不同品種白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的活性和含量差異分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：179-183.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.024

（1.深圳保時健生物工程有限公司，廣東深圳 518116； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南昆明 650205； 3.云南天保樺生物資源開發(fā)有限公司，云南昆明 650106； 4.廣州曼蒂生物科技有限公司，廣東廣州 510000）

摘要：探究不同品種白蕓豆α-淀粉酶抑制劑（α-AI）的活性和含量差異，為α-AI專用型白蕓豆的品種選育和加工生產(chǎn)提供指導(dǎo)。以大白蕓豆（YWL1、YWL2）、中白蕓豆（Tbh1、Tbh2）、小白蕓豆（云白1、云白2）品種為材料，對其營養(yǎng)成分、α-AI的活性和含量進(jìn)行測定分析，并采用超濾膜進(jìn)行不同分子量α-AI1（6～20 ku）、α-AI2（21～40 ku）、α-AI3（41～60 ku）的分離，測定不同分子量α-AI的活性差異。結(jié)果表明，不同品種白蕓豆的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉和灰分含量差異明顯，含量分別為17.5%～26.9%、1.1%～2.3%、32.9%～43.5%、3.8%～4.6%。云白1蛋白質(zhì)含量最高（26.9%）；YWL2灰分含量最高（4.6%），Tbh2脂肪含量最高（2.3%）；α-AI的活性依次排序為YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2；α-AI的含量依次為云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2；將α-AI提取液進(jìn)行膜分離得到3種不同分子量結(jié)構(gòu)的α-AI1（6～20 ku）、α-AI2（21～40 ku）、α-AI3（41～60 ku），活性平均值分別為（2 315±313）、（1 1491±1 226）、（45 683±1 914） U/g，依次是α-AI3>α-AI2>α-AI1。綜合比較發(fā)現(xiàn)，YWL1具有較高的α-AI活性和含量，分別為23 156 U/g和7.04%，更適于α-AI的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：α-淀粉酶抑制劑；白蕓豆；品種篩選；膜分離

中圖分類號：S643.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0179-05

白蕓豆生物學(xué)名多花菜豆（Phaseolus coccineus Linn.），原產(chǎn)于南美洲，我國16世紀(jì)引種栽培［1］。目前云南白蕓豆的種植面積大、產(chǎn)量高、籽粒飽滿、品質(zhì)優(yōu)，暢銷海內(nèi)外，主要分布于大理、麗江、楚雄等 1 800 m 海拔以上的高寒冷涼山區(qū)［2］。該地區(qū)遠(yuǎn)離工業(yè)污染，很少使用農(nóng)藥及化肥，是天然的綠色、有機(jī)種植區(qū)，早在2000年，麗江等地的白蕓豆就已獲得國家AA級綠色食品認(rèn)證［3］。隨著白蕓豆?fàn)I養(yǎng)與保健作用研究深入，國內(nèi)外市場需求量逐年增加，出口數(shù)量也日益增大［4］，已成為云南高寒山區(qū)出口創(chuàng)匯和鄉(xiāng)村振興的優(yōu)勢特色農(nóng)產(chǎn)品。

白蕓豆藥食同源，營養(yǎng)價值豐富，具有高蛋白、低脂肪、高鉀、低鈉等特性，還含有多種有益的生物活性物質(zhì)［5］，是一種極具加工利用前景的優(yōu)質(zhì)資源。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者對白蕓豆開展了較為深入的研究，已經(jīng)從白蕓豆中分離出近百種化合物，其中，以α-淀粉酶抑制劑（α-AI）最受關(guān)注［6］，α-AI的商品名為“白蕓豆提取物”，國外又被稱為“starch blocker/淀粉阻斷劑”。因其能特異性抑制人體唾液和腸道內(nèi)α-淀粉酶活力［7］，阻礙或延緩食物中淀粉的水解和消化，起到控制體重［8］、調(diào)節(jié)餐后血糖［9］、改善腸道微生態(tài)等功效［10］，目前已廣泛應(yīng)用于壓片糖果、固體飲料、酸奶、代餐粉、低血糖生成指數(shù)（GI）主食等功能食品和保健品中，并且通過大量臨床研究證實，α-AI具有較高的安全性和功效性［11-13］，在肥胖、糖尿病等疾病治療中有著較高的研究價值和廣闊的市場前景。

由于白蕓豆中α-AI含量普遍較低，提取率僅有3%～5%［14］，致使其生產(chǎn)成本高，市場價格昂貴。此外，α-AI的活性反映了抑制α-淀粉酶將淀粉水解為還原糖的能力，是重要的評價指標(biāo)，其活性的高低直接影響產(chǎn)品的功效作用和市場售價。因此，在研究α-AI提取技術(shù)［15］、理化特性［16］、功效應(yīng)用的同時［17］，也應(yīng)重點考慮不同品種白蕓豆間α-AI的活性和含量，這將對白蕓豆品種選育和α-AI加工生產(chǎn)起到重要指導(dǎo)意義。但迄今為止，有關(guān)高α-AI含量和高活性的白蕓豆品種研究未見報道；現(xiàn)階段研究主要側(cè)重于不同品種間蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和膳食纖維等營養(yǎng)成分的差異對比［18］。此外，α-AI具有α和β 2種亞基［19］，以不同分子量結(jié)構(gòu)的亞基α-AI1（α/β）、二聚體α-AI2（α+β）和四聚體α-AI3（2α+2β）存在［20-22］，但目前不同品種白蕓豆中各分子量α-AI占比尚不清晰，尚待進(jìn)一步研究。

近年來，隨著白蕓豆在健康中國和鄉(xiāng)村振興中作用凸顯，引起了政府、相關(guān)科研院所和企業(yè)的高度重視，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作為國內(nèi)最早研究白蕓豆的單位之一，已開展了大量相關(guān)研究［23-25］。課題組前期已進(jìn)行優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗白蕓豆品種選育和種植推廣示范基地建設(shè)。本研究在上述工作基礎(chǔ)上，以主栽6種白蕓豆為材料，對其營養(yǎng)成分、α-AI含量和活性進(jìn)行測定分析，并采用超濾膜進(jìn)行不同分子量α-AI的分離和活性差異研究，以期為α-AI專用型白蕓豆的品種篩選和加工生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大白蕓豆（YWL1、YWL2）、中白蕓豆（Tbh1、Tbh2）、小白蕓豆（云白1、云白2）品種共6個，2022年5月10日播種于云南省昆明市盤龍區(qū)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗基地，且均于2022年10月27日采集；胰α-淀粉酶，購自美國Sigma-Aldrich公司；可溶性淀粉，購自天津市化學(xué)試劑三廠；硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

ME55型電子分析天平，梅特勒-托利多；722可見分光光度計，上海光譜奧普勒儀器有限公司；FW4000A型高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；SK9201型超聲波處理器，北京千百葉電子科技有限公司；RE-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海科興儀器有限公司；HC-3618R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BONA-GM-18型有機(jī)膜分離試驗機(jī)，0.2 μm微濾膜，截留分子量60、40、20、5 ku的PES膜元件各1支，山東博納生物科技集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗方法

試驗于2022年11月至2023年2月，于云南天保樺生物資源開發(fā)有限公司實驗室完成。

1.3.1 α-AI的提取

參照遲永楠等的方法［26］，稱取清洗干燥后的白蕓豆300 g，粉碎過80目篩，豆粉與去離子水按照1 g ∶[KG-*3]8 mL比例，攪拌均勻放入超聲波處理器中，在超聲功率50 W、50 ℃條件下浸提 90 min 后，取出于4 ℃、5 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，沉淀物按上述工藝再提取1次，合并上清液，采用0.2 μm微濾膜過濾后，先采用截留分子量60 ku的超濾膜超濾，濾出液再用截留分子量 5 ku 的超濾膜超濾，收集截留液，旋轉(zhuǎn)濃縮后干燥即得α-AI。不同品種白蕓豆α-AI含量的計算如下：

含量=（mα/m豆）×100%。（1）

式中：mα為α-AI質(zhì)量（干基），g；m豆為白蕓豆粉質(zhì)量（干基），g。

1.3.2 不同分子量α-AI的膜分離

根據(jù)目前的研究報道，α-AI具有α和β 2種亞基，可形成α-AI1（α/β亞基，α分子量為7.8～15.5 ku，β分子量為14.0～18.6 ku）、α-AI2（α+β的二聚體，分子量約22.0～28.8 ku）和α-AI3（2α+2β的四聚體，分子量約50 ku）的3種結(jié)構(gòu)［19-22］，基于不同結(jié)構(gòu)間α-AI分子量的差異，可采用不同分子量有機(jī)膜進(jìn)行分離。具體分離方法如下：將“1.3.1”節(jié)中α-AI提取液依次通過截留分子質(zhì)量為60、40、20、5 ku的超濾膜分離，收集各段截留液，分別進(jìn)行濃縮、凍干，即可得到α-AI3（41～60 ku）、α-AI2（21～40 ku）、α-AI1（6～20 ku），并分別計算其質(zhì)量比例：

質(zhì)量比例=（mn/m總） × 100%。（2）

式中：mn為不同分子量α-AI的質(zhì)量，g；m總為α-AI的總質(zhì)量，g。

1.3.3 營養(yǎng)成分的測定

采用國標(biāo)方法測定樣品蛋白質(zhì)（GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》）、[JP2]淀粉（GB 5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測定》）、脂肪（GB 5009.6—[JP]2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》）、灰分（GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》）。

1.3.4 α-AI活性的測定

淀粉與碘結(jié)合后顯藍(lán)色，并且在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度和淀粉濃度呈線性正相關(guān)，以淀粉溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到回歸方程為：y=0.044 0x+0.003 2，r2=0.999 2，見圖1。根據(jù)加入α-AI前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值，即可計算出α-AI的活性，具體檢測步驟按照中國醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CCCMHPIE 1.26—2018《植物提取物 白蕓豆提取物》中α-AI活性測定。α-AI活性的定義為1 g的α-AI，于37 ℃、pH=6.0條件下，1 min內(nèi)抑制α-淀粉酶將淀粉鏈切斷成麥芽糖的微摩爾量，即為α-AI的活性，以U/g表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)成分的對比分析

由表1可知，不同品種間白蕓豆的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉和灰分含量存在明顯差異。6種白蕓豆的蛋白質(zhì)含量由高到低依次為云白1>YWL1>云白2>Tbh1>YWL2>Tbh2，且均有較高的蛋白質(zhì)含量，在 17.5%～26.9%范圍，遠(yuǎn)高于小麥、大米、蕎麥和燕麥，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)原料；同時，6種白蕓豆的脂肪含量均相對較低，在1.1%～2.3%范圍，表明白蕓豆具有高蛋白和低脂肪的特性，非常有益于飲食健康。不同品種白蕓豆的淀粉和灰分含量分別為32.9%～43.5%、3.8%～4.6%。其中，云白1的蛋白質(zhì)含量最高，淀粉含量最低，分別為26.9%和32.9%；Tbh2的脂肪和淀粉最高，分別為2.3%和43.5%，YWL2的灰分含量最高，達(dá)4.6%。

2.2 α-AI活性的對比分析

α-AI的活性反映了抑制α-淀粉酶將淀粉水解為還原糖的能力，是重要的評價指標(biāo)。由圖2可知，供試6種白蕓豆的α-AI活性值在8 673～23 156 U/g 范圍，不同品種間α-AI活性存在較大差異，[JP3]籽粒較大的大白蕓豆活性較高，α-AI活性從高到低依次為YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2，其中，YWL1的α-AI活性高達(dá)23 156 U/g，顯著高于其他品種，是最低活性云白2的2.7倍，具有較高的活性。

2.3 α-AI含量的對比分析

白蕓豆中α-AI的含量決定了生產(chǎn)成本，是原料評價的關(guān)鍵指標(biāo)。不同品種白蕓豆的α-AI含量測定結(jié)果見圖3。

由圖3可知，供試6種白蕓豆的α-AI含量差異明顯，從高到低依次排列為云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2， α-AI含量分別為7.25%、7.04%、6.12%、4.83%、4.63%和3.27%。其中，云白1和YWL1的α-AI含量均超過7%，兩者間無顯著性差異（P>0.05），均顯著高于其他品種，較目前大多研究報道的3%～5%有更高的含量，結(jié)合“2.2”節(jié)中α-AI活性測定結(jié)果，YWL1具有更高的α-AI活性，因此YWL1更適于用作α-AI生產(chǎn)的原料品種。

2.4 α-AI膜分離結(jié)果

α-AI提取液經(jīng)不同分子量超濾膜分離后，得到不同分子量的α-AI1（6～20 ku）、α-AI2（21～40 ku）、α-AI3（41～60 ku），6種不同品種白蕓豆的α-AI膜分離結(jié)果見表2。

由表2可知，不同分子量的α-AI活性存在明顯差異，[JP3]四聚體結(jié)構(gòu)的α-AI3活性遠(yuǎn)高于二聚體 α-AI2和單聚體α-AI1，活性由高到低依次為α-AI3>α-AI2>α-AI1。6種不同品種白蕓豆的α-AI1、α-AI2和α-AI3活性分別為1 868～2 731、9 836～13 286、42 186～48 258 U/g范圍，平均值分別為（2 315±313）、（11 491±1 226）、（45 683±1 914） U/g，相同分子量下的活性差異不大。但由于6種白蕓豆中α-AI1、α-AI2和α-AI3的質(zhì)量比例存在明顯差異，導(dǎo)致不同品種間α-AI活性大相逕庭。其中，YWL1的四聚體的比例較高，總活性高達(dá)23 156 U/g，優(yōu)于其他品種，該結(jié)果與Yang等的研究報道［27-28］相一致：Yang等認(rèn)為α-AI2在結(jié)構(gòu)上較α-AI3少了2個拓展環(huán)，分別含有15個殘基與6個殘基的拓展環(huán)，單獨的糖鏈與蛋白鏈對 α-淀粉酶無抑制活力，僅有兩者結(jié)合在一起時才具有抑制活力［27］。Kasahara等認(rèn)為具有α-AI3（α2β2）是一種四聚體糖蛋白，對α-淀粉酶具有更強(qiáng)的抑制效果［28］。

3 結(jié)論

本研究以主栽6種白蕓豆品種為材料，對其營養(yǎng)成分、α-AI含量和活性進(jìn)行測定分析，并采用超濾膜進(jìn)行不同分子量α-AI的分離和活性差異對比，研究結(jié)果表明：（1）不同品種白蕓豆的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉和灰分含量差異明顯，含量分別為17.5%～26.9%、1.1%～2.3%、32.9%～43.5%、3.8%～4.6%。其中云白1蛋白質(zhì)含量最高，YWL2灰分含量最高，Tbh2脂肪含量最高。（2）6種白蕓豆的α-AI活性和含量均存于較大差異，其中α-AI活性值在8 673～23 156 U/g范圍，從高到低依次為YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2；α-AI含量依次為云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2。（3）6種白蕓豆的α-AI經(jīng)膜分離后，得到不同分子量α-AI1、α-AI2、α-AI3的活性平均值分別為（2 315±313）、（11 491±1 226）、（45 683±1 914） U/g，α-AI3>α-AI2>α-AI1。綜合比較發(fā)現(xiàn)，YWL1具有較高α-AI活性和含量，分別為 23 156 U/g 和7.04%，優(yōu)于其他品種，更適于α-AI的生產(chǎn)。本研究為α-AI專用型白蕓豆的品種篩選和栽培技術(shù)提供數(shù)據(jù)參考，同時也給予α-AI加工應(yīng)用的相關(guān)企業(yè)提供理論指導(dǎo)。

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基金項目：云南省重大科技專項計劃（編號：202102AE090025）；國際（對外）科技合作基地項目（編號：GHJD-2020025）。

作者簡介：張思璐（1987—），女，湖南株洲人，碩士，工程師，主要從事功能性食品研究與應(yīng)用。E-mail：echo.zhang@wonderlab.top。

通信作者：耿智德，碩士，副研究員，主要從事白蕓豆遺傳與育種。E-mail：gengzd2002@163.com。