探究新國(guó)標(biāo)中環(huán)己基氨基磺酸鹽的氣相色譜測(cè)定法的變化

1.前言

環(huán)己基氨基磺酸鈉，又名甜蜜素，是一種在食品領(lǐng)域得到廣泛使用的非營(yíng)養(yǎng)型合成甜味劑。人體攝入的環(huán)己基氨基磺酸鈉一旦超標(biāo)，將會(huì)刺激腸胃，對(duì)肝臟和腎臟造成負(fù)擔(dān)，增加患肥胖癥、代謝綜合癥等疾病風(fēng)險(xiǎn)，影響身體健康，所以，英、日和美等40多個(gè)國(guó)家禁用環(huán)己基氨基磺酸鈉。在我國(guó)，GB 2760-2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)環(huán)己基氨基磺酸鈉和環(huán)己基氨基磺酸鈣的限量使用有明確的規(guī)定（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)），但是超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，科學(xué)高效的檢測(cè)食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的含量尤為重要。本文主要探討食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的氣相色譜測(cè)定法在新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)變化。

2.氣相色譜法概述

氣相色譜法以惰性氣體作為流動(dòng)載體，是根據(jù)氣化后的被測(cè)物各組分與色譜柱固定相的不同相互作用而實(shí)現(xiàn)各組分有效分離的色譜技術(shù)。氣相色譜法一般包含三個(gè)步驟：分離、定性和定量。首先是被測(cè)樣品中被測(cè)組分的分離：檢驗(yàn)員將被測(cè)樣品進(jìn)行前處理得到上機(jī)試樣，設(shè)置好氣相色譜儀的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，開(kāi)始?xì)庀嗌V實(shí)驗(yàn)；上機(jī)試樣通過(guò)進(jìn)樣器進(jìn)樣后，被氣化，然后進(jìn)入色譜柱；由于試樣中各組分在色譜柱的固定相中的保留時(shí)間不同，從而實(shí)現(xiàn)了各組分的分離；分離的各組分通過(guò)色譜柱終端的檢測(cè)器轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的電子信號(hào)，即氣相色譜圖，實(shí)驗(yàn)員因此實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品目標(biāo)組分的化學(xué)檢測(cè)。其次是根據(jù)氣相色譜圖對(duì)被測(cè)樣品是否含有目標(biāo)組分進(jìn)行定性分析：實(shí)驗(yàn)員將一定濃度的目標(biāo)組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行相同的前處理得到標(biāo)樣；然后在相同實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件下進(jìn)行氣相色譜實(shí)驗(yàn)，得到目標(biāo)組分的氣相色譜圖及其保留時(shí)間；將試樣和標(biāo)液的氣相色譜圖進(jìn)行比較分析，如果試樣的氣相色譜圖中存在與目標(biāo)組分保留時(shí)間相同的色譜峰，則實(shí)驗(yàn)證明被測(cè)樣品中含有目標(biāo)組分，如果不存在與目標(biāo)組分保留時(shí)間相同的色譜峰，則實(shí)驗(yàn)證明被測(cè)樣品中未檢測(cè)出目標(biāo)組分。最后是根據(jù)氣相色譜圖對(duì)被測(cè)樣品中含有的目標(biāo)組分進(jìn)行定量分析：實(shí)驗(yàn)員將目標(biāo)組分的梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)行相同的前處理和氣相色譜實(shí)驗(yàn)，依次得到不同濃度目標(biāo)組分的色譜峰面積；以外標(biāo)法定量分析，將目標(biāo)組分的濃度作為橫坐標(biāo)，目標(biāo)組分的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將試樣的氣相色譜圖中目標(biāo)組分的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到試樣中目標(biāo)組分的濃度，最后根據(jù)計(jì)算可得出被測(cè)樣品中目標(biāo)組分的含量。氣相色譜法具有重現(xiàn)性好、回收率高、檢測(cè)限較低且線性范圍合適等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的檢測(cè)。

3.新國(guó)標(biāo)中氣相色譜測(cè)定法的主要變化

國(guó)家衛(wèi)健委和市場(chǎng)監(jiān)管總局于2023年9月6日發(fā)布了GB 5009.97-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的測(cè)定》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“新國(guó)標(biāo)”），該標(biāo)準(zhǔn)代替 GB 5009.97-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基礦酸鈉的測(cè)定》，于2024年3月6日正式實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)中被測(cè)物由環(huán)己基氨基礦酸鈉改為環(huán)己基氨基磺酸鹽。新國(guó)標(biāo)仍把氣相色譜法作為測(cè)定環(huán)己基氨基磺酸鹽的第一法，與GB 5009.97-2016相比，氣相色譜法主要修改了適用范圍、前處理方法和儀器條件及參數(shù)。

3.1適用范圍

新國(guó)標(biāo)規(guī)定氣相色譜法適用于食品（蒸餾酒 、發(fā)酵酒 、配制酒、料酒及其他含乙醇的食品除外）中環(huán)己基氨基礦酸鹽的測(cè)定。從適用范圍的表述上，新標(biāo)準(zhǔn)明確強(qiáng)調(diào)了氣相色譜法不適用的具體范圍，即不適用于所有含乙醇的食品中的環(huán)己基氨基磺酸鹽的測(cè)定。相比于GB 5009.97-2016中規(guī)定的氣相色譜法不適用于白酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定，新標(biāo)準(zhǔn)中氣相色譜法不適用的具體范圍擴(kuò)大了許多，實(shí)驗(yàn)員需要特別注意。

3.2前處理方法

3.2.1試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及其配制

新國(guó)標(biāo)使用的試劑：正Kq2xb2sb6Py6N0+Q0PMiaH02wdgGVBgk7JWSSB7e/YU=庚烷[CH3（CH2）5CH3]（色譜純），石油醚（沸程為30℃-60℃），硫酸（H2SO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%-98.0%，密度1.84g/mL），亞硝酸鈉（NaNO2），淀粉酶（酶活力 >1500U/g），無(wú)水乙醇（CH3CH2OH）。新國(guó)標(biāo)改變了試劑的使用，破乳化試劑由無(wú)水乙醇替代和氯化鈉，取消了蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀和硫酸鋅，取消了氫氧化鈉試劑，增加了淀粉酶試劑。亞硝酸鈉溶液（50g/L）和硫酸溶液（200g/L）的配制無(wú)變化。

新國(guó)標(biāo)仍選用環(huán)己基氨基礦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（C6H12NSO3Na）作為標(biāo)準(zhǔn)品。但是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溶度變大了，環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液由5.00 mg/mL改成了6 mg/mL，環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)中間液由1.00 mg/mL改成了1200 μg/mL。環(huán)己基氨基礦酸鈉折算為環(huán)己基氨基礦酸的換算系數(shù)由0.8909改成了0.8907。

3.2.2儀器與設(shè)備

新國(guó)標(biāo)使用的儀器與設(shè)備：氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID））、分析天平（感量1mg、0.1mg）、渦旋混合器、高速離心機(jī)、超聲波發(fā)生器、粉碎機(jī)、研磨機(jī)、勻漿機(jī)、恒溫水浴裝置。新國(guó)標(biāo)增加了研磨機(jī)和勻漿機(jī)儀器的使用，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速要求提高了，實(shí)驗(yàn)中使用的最大轉(zhuǎn)速由原來(lái)的3000 r/min改成了9000 r/min。

3.2.3試樣的制備和提取

新國(guó)標(biāo)對(duì)試樣的制備有諸多改變，提高了對(duì)試樣勻質(zhì)的要求。主要表現(xiàn)為：含二氧化碳的液體試樣采用超聲法替代加熱法除去氣泡；對(duì)非均勻的液態(tài)、半液體試樣增加了勻漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行混勻，提高了試樣的均勻性；針對(duì)巧克力、巧克力制品、奶酪、黃油等試樣，明確要求在-18℃冷凍后，用粉碎機(jī)粉碎并攪拌均勻；而在固態(tài)試樣制備時(shí)新增了研磨機(jī)粉碎。

新國(guó)標(biāo)對(duì)于試樣提取的規(guī)定發(fā)生了顯著變化，既優(yōu)化了試驗(yàn)方法，又提高了檢測(cè)效率。首先，各種類(lèi)型樣品的取樣量減少了，并且還進(jìn)行了統(tǒng)一，全部規(guī)定為稱(chēng)取試樣2g。其次，對(duì)試樣的分類(lèi)提取發(fā)生了變化。新國(guó)標(biāo)將試樣提取分為四類(lèi)：巧克力、奶油、奶酪、乳粉、調(diào)味面制品、油腐乳、油豆豉、肉及肉制品、水產(chǎn)品罐頭等含較高油脂試樣；果凍、糖果、米粉、淀粉制品等試樣；其他固體、半固體試樣和液體試樣。最后，優(yōu)化了試樣提取的實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)于上述列舉的含較高油脂試樣，仍采用石油醚提取2次，與GB 5009.97-2016的不同之處在于，加入20mL石油醚提取時(shí)，增加了渦旋5min；超聲時(shí)間延長(zhǎng)至10min，離心條件改成了5000 r/min 離心3 min；提取完成后棄去石油醚層，60℃±2℃水浴揮去殘留石油醚，殘?jiān)铀疁p少至20mL（特別強(qiáng)調(diào)：巧克力、奶油、奶酪、乳粉等試樣需在水浴鍋中60℃±2℃加熱20min），增加渦旋5min，超聲提取時(shí)間延長(zhǎng)至30min，混勻后放至室溫備用；取消了后續(xù)沉淀、過(guò)濾、定容三個(gè)步驟。針對(duì)果凍、糖果、米粉、淀粉制品等試樣，新國(guó)標(biāo)提出了新的提取方法：稱(chēng)取 2g試樣（精確至0.001g）于離心管中，加入20mL水（米粉、淀粉制品等試樣需再加入0.2g淀粉酶），混合均勻后，60℃±2℃水浴加熱20min，渦旋5min，超聲提取10min，混勻后放至室溫備用。對(duì)于其他固體、半固體試樣：稱(chēng)取2g試樣（精確至0.001g）于離心管中，加入20mL水，渦旋5min，超聲提取30min，混勻后放至室溫備用。對(duì)于液體試樣：稱(chēng)取2g試樣（精確至0. 001g）于離心管中，加水至20mL，渦旋5min，超聲提取10min，混勻后放至室溫備用，與GB 5009.97-2016相比，增加了渦旋和超聲提取，取消了定容。

3.2.4 衍生化

衍生化是環(huán)己基氨基磺酸鹽檢測(cè)前處理實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，新國(guó)標(biāo)調(diào)整了衍生化實(shí)驗(yàn)的方法和步驟：取消了移液這一步驟，直接將裝有試樣提取液的離心管置于冰浴，冰浴時(shí)間由5min改成了10min，依次加入的正庚烷由5mL改成了10mL，亞硝酸鈉溶液（50g/L）由2.5mL改成了5mL，硫酸溶液（200g/L）由2.5mL改成了5mL，混勻，于冰浴中放置30min，其間振搖3-5次，取消了氯化鈉的加入，取出后渦旋，渦旋時(shí)間由1min改成3min，再進(jìn)行低溫離心，明確規(guī)定于4℃條件下離心，離心條件由3000r/min離心10min改成9000r/min離心3min。GB 5009.97-2016中要求統(tǒng)一加入氯化鈉來(lái)破乳化，但新國(guó)標(biāo)中規(guī)定：如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可緩慢滴加無(wú)水乙醇，同時(shí)輕搖離心管，直至破乳，于4℃條件下9000r/min離心3min。最后，取上清液過(guò)有機(jī)相微孔濾膜（0.45μm孔徑），供上機(jī)測(cè)定。

3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備及衍生化

新國(guó)標(biāo)中標(biāo)準(zhǔn)系列工作液制備了7個(gè)濃度梯度，分別準(zhǔn)確移取0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.5mL、5.0mL環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（1200μg/mL）于離心管中，用水稀釋至20mL，按上述3.2.4步驟衍生化。此時(shí)正庚烷中待測(cè)物的濃度分別相當(dāng)于 6μg/mL、12μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL、300μg/mL、600μg/mL，臨用現(xiàn)配。與GB 5009.97-2016相比，濃度梯度由6個(gè)增加至7個(gè)；標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度由衍生化之前待測(cè)物的制備濃度改成了衍生化之后正庚烷中待測(cè)物的濃度；濃度覆蓋范圍由10μg/mL至500μg/mL拓展成6μg/mL至600μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的最小濃度梯度6μg/mL，正好對(duì)應(yīng)取樣量為2g時(shí)本方法的的定量限0.03g/kg。

3.3儀器條件及參數(shù)

新國(guó)標(biāo)規(guī)定的色譜柱由內(nèi)涂5%苯基甲基聚硅氧烷的弱極性石英毛細(xì)管柱（30m×0.53mm×1μm）改成了內(nèi)涂50%苯基-50%甲基聚硅氧烷的中等極性毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm）。柱溫升溫程序：初溫由55℃改成了50℃，保持3min，10℃/min升溫至90℃改成了10℃/min升溫至70℃，保持0.5min，最后由20℃/min升溫至200℃改成了30℃/min升溫至220℃，保持3min。進(jìn)樣口溫度（230℃）、進(jìn)樣量（1μL）、進(jìn)樣方式（分流進(jìn)樣）、分流比（1：5）和檢測(cè)器（氫火焰離子化檢測(cè)器（FID，溫度260℃）均未發(fā)生改變。載氣：高純氮?dú)?，流速?2.0mL/min改成了2.0mL/min。氫氣：流速由30mL/min改成了32mL/min?？諝猓毫魉儆?30mL/min改成了300mL/min。

4.結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液經(jīng)過(guò)衍生化實(shí)驗(yàn)處理，依次注入氣相色譜儀中測(cè)得氣相色譜圖譜，從而測(cè)得對(duì)應(yīng)衍生物的峰面積，以環(huán)己基氨基礦酸的濃度為橫坐標(biāo)，以衍生物環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰面積之和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣溶液經(jīng)過(guò)衍生化實(shí)驗(yàn)處理，注入氣相色譜儀中，測(cè)得氣相色譜圖譜，首先根據(jù)保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行定性，然后將目標(biāo)兩峰面積之和作為測(cè)定面積計(jì)算，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣溶液中待測(cè)物的濃度。若試樣中目標(biāo)兩峰面積之和超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，應(yīng)用正庚烷稀釋后再進(jìn)樣分析。

試樣中環(huán)己基氨基磺酸含量按式（1）計(jì)算。X代表試樣中環(huán)己基氨基礦酸的含量，單位為克每千克（g/kg）；p代表由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)溶液中環(huán)己基氨基礦酸的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）。V代表加入正庚烷體積，單位為毫升（mL）；m代表試樣質(zhì)量，單位為克（g）；f代表稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

式（1）

在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。當(dāng)取樣量為2g時(shí)，本方法檢出限為0.01g/kg，定量限為0.03g/kg。與GB 5009.97-2016相比，待測(cè)溶液中環(huán)己基氨基礦酸的質(zhì)量濃度單位由mg/mL改成了μg/mL；計(jì)算代入的體積V由試樣最終定容體積改成了正庚烷體積；增加了稀釋倍數(shù)f；精密度要求由10%改成了15%，有所放寬。

結(jié)論

標(biāo)準(zhǔn)的變更需要針對(duì)變化了的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行相應(yīng)的方法驗(yàn)證，從而佐證該實(shí)驗(yàn)室可以科學(xué)準(zhǔn)確的采用新的標(biāo)準(zhǔn)方法開(kāi)展相關(guān)檢驗(yàn)檢測(cè)活動(dòng)。食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的氣相色譜測(cè)定法在新國(guó)標(biāo)GB 5009.97-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的測(cè)定》中修改了適用范圍、前處理方法以及儀器條件和參數(shù)，進(jìn)一步明確了標(biāo)準(zhǔn)方法的適用范圍，提高了樣品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的提取率，優(yōu)化了待測(cè)物目標(biāo)峰（環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰）的保留時(shí)間和峰形，使得環(huán)己基氨基磺酸的檢測(cè)效率更高，檢測(cè)結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確。

作者簡(jiǎn)介

文海瓊（1989-），女，質(zhì)量工程師（中級(jí)），碩士研究生；研究方向：質(zhì)量檢測(cè)與質(zhì)量管理。