Neuritin野生型蛋白的制備及活性、穩(wěn)定性的檢測(cè)及分析

朱禮彥 孟平平 李煜 宋丹丹 孫嘉偉 汪海燕 朱金輝 魏韜藝 楊磊

摘要：目的 制備符合藥典結(jié)構(gòu)要求的無(wú)標(biāo)簽Neuritin野生型（wild type，WT）蛋白，并完成其存在形式、活性及穩(wěn)定性鑒定及分析。方法 利用基因重組技術(shù)構(gòu)建符合藥典結(jié)構(gòu)要求的Neuritin WT酵母重組子，利用SDS-PAGE還原電泳及Western blot對(duì)其進(jìn)行高表達(dá)篩選及鑒定；摸索建立無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT蛋白純化方法，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE還原電泳分子量鑒定、Western blot免疫原性鑒定、SEC-HPLC精細(xì)鑒定及宿主DNA、宿主蛋白殘留量檢測(cè)；利用SDS-PAGE非還原電泳完成存在形式的鑒定；通過(guò)參照藥典建立的重組Neuritin蛋白活性鑒定方法，檢測(cè)并分析Neuritin WT純化蛋白的活性，并觀察37℃下不同時(shí)間Neuritin WT純化蛋白的穩(wěn)定性。

結(jié)果 制備了純度高達(dá)98%以上的Neuritin WT純化蛋白，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為9.7 kDa，宿主DNA殘留量為0.009 4 ng/劑，宿主蛋白殘留量占比0.000 8%；經(jīng)檢測(cè)，該純化蛋白存在單體、二聚體2種形式?；钚澡b定結(jié)果表明該蛋白具有維持神經(jīng)元存活的生物學(xué)活性；且37 ℃下3 d內(nèi)降解率小于10%、7 d內(nèi)未到達(dá)半衰期（蛋白降解率小于35%）。

結(jié)論 成功制備了純度高達(dá)98%、雜質(zhì)含量及結(jié)構(gòu)符合藥典要求的無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT蛋白，分析了Neuritin WT蛋白的存在形式，并明確了該蛋白具有較好的生物學(xué)活性及穩(wěn)定性，為Neuritin進(jìn)一步功能、藥學(xué)研究及生物制品的研制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Neuritin野生型蛋白；純度；存在形式；神經(jīng)元存活；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R34文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Preparation and activity， stability detection and analysis of Neuritin wild-type protein

ZHU? Liyan1，MENG? Pingping1，LI? Yu1，SONG? Dandan2，SUN? Jiawei1，WANG? Haiyan2，ZHU? Jinhui1 ，WEI? Taoyi1，YANG? Lei2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China;

2 Department of Medicine， Hangzhou Normal University， Hangzhou，Zhejiang 310036，China）

Abstract：? Objective To prepare unlabeled Neuritin wild-type （WT） protein that meets the structural requirements of the pharmacopoeia， and complete its identification and analysis of its form， activity， and stability.Methods Neuritin WT yeast recombinants conforming to pharmacopoeia structure were constructed by gene recombination technology， and the high-expression strains was screened and identified by SDS-PAGE reduction electrophoresis and Western blot. The unlabeled Neuritin WT protein purification method was established. The purified proteins were identified by SDS-PAGE reduction electrophoresis for molecular weight， Western blot for immunogenicity， SEC-HPLC for fine identification， and host DNA and host protein residues for quality inspection. The existence form was identified by SDS-PAGE non-reduction electrophoresis. The activity of Neuritin WT purified protein was detected and analyzed by establishing a method for identifying the activity of recombinant Neuritin protein in accordance with the requirements of the pharmacopoeia， and the stability of Neuritin WT purified protein at different times at 37 ℃ was observed.Results Neuritin WT purified protein with a purity of more than 98% was prepared， the relative molecular weight of protein was 9.7 kDa， the residual amount of host DNA was 0.009 4 ng/agent and the residual amount of host protein accounted for 0.000 8%. The purified protein was detected in the form of monomer and dimer. The activity identification results indicate that the protein has biological activity to maintain neuronal survival; The degradation rate within 3 days at 37 ℃ is less than 10%， and the half-life is not reached within 7 days （the protein degradation rate is less than 35%）.Conclusion Neuritin WT unlabeled protein with purity up to 98%， impurity content and structure meeting pharmacopoeia requirements was successfully prepared. The existence form of Neuritin WT protein was analyzed， and it was confirmed that the protein has good biological activity and stability. Neuritin provides material basis for further functional， pharmaceutical and biological products development.

Key words： Neuritin wild-type protein;purity;existence form;neuron survival;stability

Neuritin是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和可塑性中發(fā)揮重要功能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［1-2］，能夠促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)、成熟［3-5］和神經(jīng)元遷移［6］，維持神經(jīng)元存活［2］。研究發(fā)現(xiàn)Neuritin可能參與糖尿病周圍神經(jīng)病變［7-9］及創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)再生和修復(fù)過(guò)程［10］、并改善抑郁［11-12］和阿爾茨海默癥造成的認(rèn)知障礙［13-15］。我們開展了一系列Neuritin功能機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)外源性Neuritin可以促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，進(jìn)而改善脊髓損傷［16］，以上研究提示，Neuritin在神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，有望成為治療神經(jīng)損傷的靶點(diǎn)藥物。

本課題組前期用于開展Neuritin功能機(jī)制研究的Neuritin蛋白，均為利用基因工程技術(shù)制備的帶有His標(biāo)簽的重組蛋白［17］。標(biāo)簽的存在既便于目的蛋白的表達(dá)純化，又利于區(qū)別于內(nèi)源性蛋白，實(shí)現(xiàn)示蹤技術(shù)的應(yīng)用，因此，帶有標(biāo)簽的重組蛋白被廣泛用于蛋白功能與機(jī)制的基礎(chǔ)研究。但對(duì)于生物制劑的制備而言，標(biāo)簽的存在不僅會(huì)影響蛋白天然結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)研究造成阻礙。更重要的是，《中國(guó)藥典》規(guī)定重組蛋白類生物制品中不得帶有融合標(biāo)簽［18］。因此，前期制備的帶有His標(biāo)簽的Neuritin蛋白不符合重組蛋白生物制劑的結(jié)構(gòu)要求，必須制備符合中國(guó)藥典要求的高純度、有活性的Neuritin 野生型（wild type，WT）蛋白，方可進(jìn)行系列的藥學(xué)研究。

本研究重新構(gòu)建了符合藥典結(jié)構(gòu)要求的Neuritin WT酵母表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)獲得的無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT蛋白進(jìn)行純化，分別對(duì)純化蛋白的純度、免疫原性、宿主DNA及宿主蛋白殘留量進(jìn)行檢定，鑒定并分析其存在形式、生物學(xué)活性及穩(wěn)定性，為Neuritin蛋白進(jìn)一步的功能及藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

AKTA Start、XK26/20層析柱、疏水層析填料介質(zhì)Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（高取代（high sub， HS））購(gòu)自GE公司，彩色預(yù)染蛋白marker 26616購(gòu)自賽默飛公司，兔抗Neuritin抗體由華安公司制備，山羊抗兔IgG購(gòu)自中杉金橋公司，高效液相色譜儀與分子尺寸排阻色譜柱購(gòu)自Waters公司；畢赤酵母殘留DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湖州申科生物科技有限公司；畢赤酵母宿主蛋白殘留Elisa試劑盒購(gòu)自Cygnus公司，BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司，CCK-8試劑盒購(gòu)于碧云天公司。

1.2 Neuritin WT酵母重組子的構(gòu)建及鑒定

以本課題組前期構(gòu)建的pPIC9K-his-Neuritin重組質(zhì)粒為模板，使用PCR技術(shù)構(gòu)建pPIC9K-Neuritin WT重組質(zhì)粒，引物上游序列：5′-GAGGCTGAAGCTGCCGGTAAGTGTGATGCT-3′，下游序列：5′-ACACTTACCGGCAGCTTCAGCCTCTCTTTT-3′。將重組質(zhì)粒線性化后通過(guò)電轉(zhuǎn)技術(shù)與畢赤酵母GS115同源重組，利用含有G418的YPD平板對(duì)酵母重組子進(jìn)行抗性篩選，利用PCR技術(shù)對(duì)酵母重組子進(jìn)行基因型鑒定，詳細(xì)操作見參考文獻(xiàn)［17］。

1.3 Neuritin WT酵母重組子的鑒定及高表達(dá)篩選

1.3.1 Neuritin WT酵母重組子的發(fā)酵

挑取Neuritin WT酵母重組子置于BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃，220 r·min-1搖菌至OD600為2。收集菌液，4 500 r·min-1離心10min，留沉淀，使用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體。30℃，220 r·min-1搖菌，每隔24h補(bǔ)加1%甲醇。72h后收集菌液，4℃，4 000 r·min-1離心15 min，留上清。

1.3.2 Neuritin WT酵母重組子發(fā)酵液預(yù)處理

發(fā)酵液經(jīng)6 000 r·min-1，15min離心處理，取上清；純水沖洗平板過(guò)濾器，將0.45μm孔徑水系濾膜放置于夾具中，擰緊螺絲，調(diào)節(jié)支架使平板保持水平，進(jìn)料口連接蠕動(dòng)泵，出料口用容器盛裝，過(guò)濾前后料液容器均冰上放置，保持低溫，打開蠕動(dòng)泵電源，將酵母發(fā)酵上清以40mL·min-1速度過(guò)濾至澄清。

1.3.3 Neuritin WT酵母重組子發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE還原電泳鑒定

樣品按照5∶1比例加入5×變性還原型loading buffer，置于100℃加熱器中加熱10 min，使蛋白充分變性。使用4%～20%梯度膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，160 V，50min。將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)快速染色液中，于搖床上室溫染色，60 r·min-1，30～60min。將凝膠置于純水中，于60 r·min-1搖床上室溫脫色，直至膠上條帶清晰，使用凝膠成像儀中拍照保存。

1.3.4 Neuritin WT酵母重組子發(fā)酵產(chǎn)物的Western blot鑒定

電泳結(jié)束后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，15 V，30 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；將膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入兔抗Neuritin抗體（1∶500稀釋）4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次，加入HRP山羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋）室溫孵育2h，TBST緩沖液洗滌3次，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光儀拍照并儲(chǔ)存。

1.4 Neuritin WT酵母發(fā)酵液的疏水層析純化

連接AKTA和Unicorn系統(tǒng)，使用0.5 mol·L-1氫氧化鈉沖洗層析柱，約3個(gè)柱體積（bed volume， BV）；使用純水沖洗層析柱，約3BV，完成柱再生；以含0.1 mol·L-1檸檬酸的0.2 mol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH=4.73）作為基礎(chǔ)緩沖液，使用含有0.25 mol·L-1硫酸銨的基礎(chǔ)緩沖液，柱平衡約3BV；在預(yù)處理后的發(fā)酵上清中緩慢分次加入0.25 mol·L-1硫酸銨，攪拌至完全溶解，于4℃下靜置1h，作為純化上樣液，將純化上樣液，通過(guò)上樣泵流入層析柱中；待上樣完畢后，再次使用含有0.25 mol·L-1硫酸銨的基礎(chǔ)緩沖液，柱平衡約3BV；使用基礎(chǔ)緩沖液上樣約3BV，完成第一步洗雜；將基礎(chǔ)緩沖液電導(dǎo)率稀釋至為0.34 ms·cm-1（約稀釋十倍），上樣約3BV，完成第二步洗雜；使用純水洗脫目的蛋白，根據(jù)A280紫外吸光度收集目的蛋白（以上操作流速均為5mL·min-1）。

1.5 Neuritin WT純化蛋白的蛋白含量測(cè)定

BCA試劑盒測(cè)定純化產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量。

1.6 Neuritin WT純化蛋白的Western blot分析

方法同1.3.2。

1.7 Neuritin WT純化蛋白的SEC-HPLC純度檢測(cè)

疏水層析純化產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，置于進(jìn)樣瓶中；流動(dòng)相為磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉配置100mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH=7）；流速0.86 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量10μL；洗脫方式為等度洗脫，通過(guò)觀察色譜圖出峰情況對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定。

1.8 Neuritin WT純化蛋白的SDS-PAGE非還原電泳分析

樣品中按照5∶1比例加入5×變性非還原型loading buffer，并置于100℃加熱器中加熱10 min，使蛋白充分變性。用4%～20%梯度膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，160 V，50min。將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)快速染色液中，于搖床上室溫染色，60 r·min-1，30～60min。將凝膠置于純水中，于60 r·min-1搖床上室溫脫色，直至膠上條帶清晰，使用凝膠成像儀中拍照保存。

1.9 Neuritin WT蛋白相關(guān)雜質(zhì)的檢測(cè)

使用畢赤酵母殘留DNA檢測(cè)試劑盒和畢赤酵母宿主蛋白殘留ELISA試劑盒，分別檢測(cè)純化產(chǎn)物中的宿主殘留DNA和宿主殘留蛋白。

1.10 Neuritin WT蛋白對(duì)HT22細(xì)胞存活影響的檢測(cè)

使用CCK-8法測(cè)定Neuritin WT蛋白對(duì)HT22細(xì)胞存活的影響，具體操作見參考文獻(xiàn)［19］。

1.11 Neuritin WT蛋白的熱穩(wěn)定性分析

將2μg Neuritin WT純化蛋白置于37℃水浴鍋中，于0、1、3、5、7 d取出等體積蛋白，通過(guò)SDS-PAGE還原電泳（實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.3），觀察Neuritin WT純化蛋白降解情況。

2 結(jié)果

2.1 Neuritin WT酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

pPIC9K-Neuritin WT重組穿梭質(zhì)粒PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示，在9 558 bp左右出現(xiàn)特異性條帶（圖1），與預(yù)期分子量一致，表明Neuritin WT成功插入pPIC9K質(zhì)粒。

2.2 Neuritin WT酵母重組子的高表達(dá)篩選

Neuritin WT酵母重組子發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE還原電泳鑒定結(jié)果表明：陽(yáng)性重組子均在10 kDa處出現(xiàn)條帶，與Neuritin WT蛋白理論分子量相符；且Western blot特異性鑒定結(jié)果表明均為Neuritin蛋白。比較各陽(yáng)性重組子表達(dá)量的差異，綜合篩選2號(hào)菌株為高表達(dá)Neuritin WT蛋白的菌株（圖2）。

2.3 Neuritin WT蛋白純化工藝的建立

Neuritin WT蛋白純化工藝的確立過(guò)程見圖3，針對(duì)不同層析介質(zhì)，摸索了其結(jié)合條件、洗雜條件、洗脫條件，最終明確Neuritin WT蛋白的疏水層析純化工藝的條件：Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（HS）作為層析填料，0.25 mol·L-1硫酸銨作為結(jié)合條件，基礎(chǔ)緩沖液和10%基礎(chǔ)緩沖液作為洗雜條件，純水作為洗脫條件。Neuritin WT蛋白的純化結(jié)果見圖4，峰3為目的蛋白洗脫峰，峰1和峰2為雜質(zhì)峰。

2.4 Neuritin WT純化蛋白的分子量鑒定

利用SDS-PAGE還原電泳對(duì)Neuritin WT純化產(chǎn)物進(jìn)行分子量鑒定，結(jié)果顯示僅10 kDa處出現(xiàn)一處條帶，條帶位置與預(yù)期分子量相符（圖5），且灰度值掃描初步分析純度在99%以上。

2.5 Neuritin WT純化蛋白的免疫原性鑒定

Neuritin WT純化產(chǎn)物免疫原性鑒定結(jié)果顯示，在約10 kDa處可見特異性結(jié)合條帶，與預(yù)期值相符（圖6），表明該純化產(chǎn)物為Neuritin蛋白。

2.6 Neuritin WT純化蛋白的存在形式鑒定

Neuritin WT純化產(chǎn)物SDS-PAGE非還原電泳結(jié)果顯示，在10 kDa、15 kDa位置出現(xiàn)兩處條帶（圖7），結(jié)合SDS-PAGE還原電泳結(jié)果（圖5），我們判斷10 kDa處為Neuritin蛋白單體形式，15 kDa處為Neuritin蛋白二聚體形式。

2.7 Neuritin WT純化蛋白的精細(xì)鑒定

SEC-HPLC對(duì)Neuritin WT純化產(chǎn)物精細(xì)鑒定結(jié)果顯示，色譜圖中共出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，出峰時(shí)間分別為8.397min（峰1）和9.613min（峰2）。峰1對(duì)應(yīng)15 kDa，峰2對(duì)應(yīng)10 kDa；結(jié)合圖6的結(jié)果，確定峰1為Neuritin蛋白二聚體形式，峰2為Neuritin蛋白單體形式（圖8），對(duì)兩峰面積進(jìn)行歸一化計(jì)算，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物純度為98%。

2.8 Neuritin WT純化蛋白中宿主DNA殘留量檢測(cè)結(jié)果

以畢赤酵母宿主殘留DNA檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9），將濃度為0.6mg·mL-1的Neuritin WT蛋白稀釋10倍，qPCR測(cè)得樣品Ct平均值為31.74，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得宿主DNA殘留量為0.0047 ng·mL-1（表1），按照每劑安瓶中加入2mL蛋白原液，則安瓶中宿主DNA的殘留含量為0.0094 ng·劑-1，符合2020版的《中國(guó)藥典》小于10 ng·劑-1的要求。

2.9 Neuritin WT純化蛋白中宿主蛋白殘留量檢測(cè)結(jié)果

以畢赤酵母宿主殘留蛋白檢測(cè)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)OD450-650值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖10。將濃度為0.6mg·mL-1的Neuritin WT蛋白稀釋20倍，測(cè)得宿主蛋白OD450-650值為0.2152、0.2162、0.2154，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中可得宿主蛋白殘留含量為4.86、4.92、4.87 ng·mL-1，占總蛋白含量的0.0008%，符合2020版《中國(guó)藥典》小于0.5%的要求，詳見表2。

2.10 Neuritin WT純化蛋白的活性分析

不同濃度的Neuritin WT純化蛋白作用HT22細(xì)胞，細(xì)胞存活結(jié)果顯示，Neuritin WT濃度從15.625 ng·mL-1起開始發(fā)揮其維持神經(jīng)元存活的作用，在濃度達(dá)到1 000 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率最高；且在有效作用濃度內(nèi)，Neuritin WT純化蛋白濃度與HT22細(xì)胞存活存在劑量效應(yīng)關(guān)系（圖11）。

2.11 Neuritin WT純化蛋白的穩(wěn)定性檢測(cè)

Neuritin WT純化蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白在37℃下，3 d內(nèi)，蛋白降解率不到10%；5 d時(shí)，蛋白降解率16%左右；7 d時(shí)，蛋白降解率34%左右（圖12）。

3 討論

本研究首先構(gòu)建了無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT酵母表達(dá)系統(tǒng)，建立了區(qū)別于標(biāo)簽蛋白的Neuritin WT蛋白純化方法，獲得了純度達(dá)到98%的Neuritin WT純化蛋白，經(jīng)鑒定，該蛋白具有活性，37℃ 7 d內(nèi)蛋白降解率小于50%，且雜質(zhì)含量符合藥典對(duì)生物制劑的要求。本研究為Neuritin的結(jié)構(gòu)及藥學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

純化是無(wú)標(biāo)簽重組蛋白制備過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在完成無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建后，本課題組通過(guò)ExPASY ProtScale，首先對(duì)Neuritin活性片段的理化性質(zhì)進(jìn)行理論預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示Neuritin消光系數(shù)小于1.5，屬于較穩(wěn)定蛋白，且其結(jié)構(gòu)中疏水區(qū)大于親水區(qū)［20］，這提示我們可以根據(jù)Neuritin WT蛋白與其他雜質(zhì)疏水性的差異進(jìn)行分離純化。因此，本研究選擇疏水層析作為Neuritin WT蛋白的首選純化方法。

影響疏水層析純化效果的主要因素有介質(zhì)類型、鹽種類及鹽離子強(qiáng)度等。疏水層析實(shí)驗(yàn)中最常用的介質(zhì)是瓊脂糖層析介質(zhì)（Phenyl Sepharose），因此選用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（HS）作為層析介質(zhì)；緩沖液中鹽離子的強(qiáng)度對(duì)目的蛋白的結(jié)合和洗脫具有重要影響，SO42-可以提高蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性，使其溶解度下降，增強(qiáng)蛋白和固定相的疏水作用，因此我們選擇0.25 mol·L-1硫酸銨作為結(jié)合條件；鹽離子強(qiáng)度對(duì)疏水作用的影響體現(xiàn)在鹽濃度越高，蛋白疏水性越強(qiáng)，越不易洗脫。因此，當(dāng)鹽濃度逐漸降低時(shí)，疏水性不同的物質(zhì)會(huì)先后與介質(zhì)分離，在以基礎(chǔ)緩沖液和10%基礎(chǔ)緩沖液作為洗雜條件時(shí)，Neuritin WT蛋白中的雜質(zhì)被解吸，而在以純水作為洗脫條件時(shí)，目的蛋白被成功洗脫，初步純度鑒定結(jié)果顯示，純度在99%以上（圖5）。最終我們建立了以0.25 mol·L-1硫酸銨作為結(jié)合條件，基礎(chǔ)緩沖液和10%基礎(chǔ)緩沖液作為洗雜條件，純水作為洗脫條件的Neuritin WT蛋白的疏水層析純化工藝。

通過(guò)以上純化工藝獲得的純化產(chǎn)物，其免疫原性鑒定結(jié)果顯示，條帶單一，確定為Neuritin蛋白。接下來(lái)，我們對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行存在形式鑒定，SDS-PAGE非還原電泳結(jié)果顯示，在10 kDa及15 kDa處出現(xiàn)條帶（圖7），而經(jīng)還原后，僅10 kDa一條帶（圖5），說(shuō)明它們均為Neuritin蛋白，只是存在形式不同；結(jié)合分子量的理論推測(cè)，基本認(rèn)定它們分別為二聚體和單體兩種存在形式。純化產(chǎn)物進(jìn)一步SEC-HPLC的精細(xì)鑒定顯示，色譜圖中出現(xiàn)10 kDa和15 kDa兩個(gè)色譜峰（圖8），與存在形式鑒定結(jié)果一致，即Neuritin單體和二聚體。兩峰相對(duì)峰面積計(jì)算結(jié)果顯示，純化產(chǎn)物純度達(dá)到98%。

按照藥典要求，隨后我們對(duì)Neuritin WT純化蛋白中的雜質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該純化蛋白中，宿主DNA殘留量及宿主蛋白殘留量均符合藥典要求。

最后，我們對(duì)Neuritin WT純化蛋白分別進(jìn)行了活性及穩(wěn)定性鑒定，利用本課題組前期建立的一種分析重組人Neuritin蛋白生物學(xué)活性的方法［19］，通過(guò)檢測(cè)Neuritin對(duì)HT22細(xì)胞存活的維持作用，鑒定并分析Neuritin WT純化蛋白的活性，探討了Neuritin WT純化蛋白與HT22細(xì)胞的存活率之間的量效關(guān)系，確定了Neuritin WT純化蛋白的活性及有效濃度范圍，證明本研究制備的Neuritin WT純化蛋白具有較好的生物學(xué)活性。

蛋白質(zhì)在生理溫度（37℃）下的穩(wěn)定性對(duì)其在體內(nèi)發(fā)揮活性功能至關(guān)重要，Neuritin WT純化蛋白的熱穩(wěn)定性鑒定結(jié)果顯示，該蛋白于37℃，3 d內(nèi)降解率小于10%，說(shuō)明該蛋白三天內(nèi)很穩(wěn)定；7 d時(shí)蛋白降解不到35%，未到達(dá)其半衰期（＜50%）。該結(jié)果為Neuritin蛋白在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的功能研究，提供了重要的用藥劑量和用藥時(shí)間的依據(jù)。

綜上所述，本研究制備的無(wú)標(biāo)簽Neuritin WT蛋白，經(jīng)鑒定，該蛋白的純度及雜質(zhì)含量均符合藥典要求，具有較好的生物學(xué)活性，且37℃下7天內(nèi)基本穩(wěn)定。該蛋白不僅適用于開展系列的藥學(xué)研究，也為其深入的功能研究以及生物制劑的研制提供了重要的物質(zhì)條件。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）