中國野生半夏的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究

摘"要： "第四紀氣候波動以及地理和環(huán)境隔離深刻地影響了現(xiàn)代植物的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布格局。該研究采用分子譜系地理學的研究方法對藥用植物半夏19個居群共212個個體的3個葉綠體片段psbK-psbI、atpF-atpH和trnL-F進行分析，探究半夏的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、地理分布格局模式及成因，并探討其居群歷史動態(tài)。結(jié)果表明：（1）半夏總單倍型多樣性Hd為0.882，總核苷酸多樣性π為1.23 × 10-3，在物種水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。（2）分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示，半夏遺傳變異主要發(fā)生在居群間，顯著的遺傳分化（FST =0.909，Plt;0.001）和較低的種群內(nèi)遺傳多樣性（HS =0.134）；種群間遺傳分化系數(shù)NST=0.913gt;GST =0.855（0.01lt;Plt;0.05），表明葉綠體單倍型具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。（3）中性檢驗結(jié)果顯示，Tajimas D值、Fu and Lis D值以及Fu and Lis F*值均為不顯著正值，F(xiàn)us Fs值為不顯著負值且失配分析曲線呈雙峰，表明半夏居群整體沒有經(jīng)歷過擴張事件。（4）單倍型地理分布顯示，西南地區(qū)和中-東部地區(qū)具有單倍型多樣性較高，并存在特有單倍型，故推測第四紀冰期時在這兩個區(qū)域存在冰期避難所。總之，通過3個葉綠體基因?qū)Σ煌瑓^(qū)域半夏的分析，闡明了其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布格局，為半夏優(yōu)良種源的分子篩選和保護提出了科學的建議和保護策略。

關(guān)鍵詞： 半夏， 地理分布格局， 遺傳多樣性， 遺傳結(jié)構(gòu)， 避難所

中圖分類號： "Q948

文獻標識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）04-0766-11

Genetic diversity and genetic structure of wild

Pinellia ternata （Araceae） in China

WU Min， WU Shiqi， PAN Feng， SHI Tian， ZHAO Cai

（ Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）， CollaborativeInnovation Center for Mountain Ecology amp; Agro-Bioengineering （CICMEAB）， College of Life Sciences/Instituteof Agro-bioengineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China ）

Abstract： "Due to global climate change （especially the repeated fluctuation of the Quaternary climate） and environmental isolation have a profound impact on the genetic diversity， genetic structure， geographical distribution pattern and population historical dynamics of modern plants. We used the research method of molecular pedigree geography to analyze the three non-coding chloroplast fragments psbK-psbI， atpF-atpH and trnL-F of 212 individuals from 19 populations in China of Pinellia ternata， a Araceae Pinellia perennial herb with high value of medicin， to explore the genetic diversity， genetic structure， geographical distribution pattern and its causes， and also explore the historical dynamics of its population. The results were as follows： （1） The total haplotype diversity （Hd） "of P. ternata was 0.882 and the total nucleotide diversity （π） was 1.23 × 10-3， which means high genetic diversity at the species level. （2） The results of molecular analysis of variance （AMOVA） showed that genetic variation of P. ternata occurred mainly in 89.27% of populations， with significant genetic differentiation （FST=0.909， Plt;0.001） and lower within population genetic diversity （HS=0.134）. The coefficient of genetic differentiation among populations was 0.855 and 0.913 respectively， NSTgt; GST（0.01lt;Plt;0.05） indicated that the chloroplast haplotypes had obvious molecular lineage and geographical structure. （3） The central test results showed that Tajimas D value， Fu and Lis D value and Fu and Lis F* value were insignificantly positive value. Fus Fs value was insignificantly negative value. And the mismatch analysis curve showed double peaks， indicating that the P. ternata populations had not experienced expansion events. （4） The geographical distribution of haplotype showed that the southwest and central eastern regions were characterized by higher haplotype diversity， and there were unique haplotype. For this reason， it is speculated that there were ice age shelters in these two regions during the Quaternary ice age. In a word， through the analysis of three chloroplast genes of P. ternata in different regions， we have clarified its genetic diversity， genetic structure and geographical distribution pattern. In addition， we have put forward scientific suggestions and protection strategies for molecular screening and protection of excellent provenances of P. ternata.

Key words： Pinellia ternata， geographical distribution pattern， genetic diversity， genetic structure， glacial refugia

全球氣候變化，尤其第四紀以來的氣候波動和環(huán)境變化，深刻地影響了現(xiàn)代植物的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布格局（Harrison et al.， 2001; Hewitt， 1996， 2004; Bennett amp; Provan， 2008）。在歐洲和北美洲，植物譜系地理學的研究得到了廣泛的開展，揭示了植物現(xiàn)存種群的遺傳結(jié)構(gòu)和演化歷史進程 （Hickerson et al.， 2010; Qiu et al.， 2011; Liu et al.， 2012; Ye et al.， 2017）。冰期來臨時，廣泛發(fā)育的大陸冰川使得高緯度地區(qū)的喜溫植物退縮到南方，形成“冰期避難所”（Hewitt， 2004）；相反，間冰期或冰后期氣候變暖，冰川消退，避難所的植物遷移回到高緯度地區(qū)（Hewitt， 1996， 2004; Soltis et al.， 2006; Shafer et al.， 2010）。然而，全球氣候變化和環(huán)境波動對我國植物的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、譜系地理分布模式和種群動態(tài)歷史的影響迥異于歐洲和北美地區(qū)（Qiu et al.， 2011; Liu et al.， 2012; Meng et al.， 2015; Wang et al.， 2017），表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）中國境內(nèi)由于未受大規(guī)模冰川覆蓋，冰期到來時，氣溫降低，植物在分布區(qū)發(fā)生范圍性收縮，存在多個冰期避難所；（2）間冰期或冰后期，由于氣候變暖，存活于冰期避難所的個體發(fā)生范圍性擴張；（3）青藏高原隆起引起一系列山脈、河流隔離，季風引起的干濕交替、干旱、第四紀冰期-間冰期交替等是植物譜系地理格局形成的主要因素。但這些研究主要集中在青藏高原、西南、秦嶺及臨近地區(qū)，并且主要以木本植物為研究對象，而對其他區(qū)域，以及草本植物開展類似的研究相對較少。

植物葉綠體DNA （chloroplast DNA，cpDNA）為閉環(huán)雙鏈DNA，與核基因組DNA相比，葉綠體DNA具有分子量小、多拷貝和結(jié)構(gòu)簡單的特點且不同的cpDNA片段間很難發(fā)生重組行為，故在植物居群研究中的遺傳分化水平較高，基因流較低，能夠更明確地闡述物種的遺傳變異和譜系地理格局（Avise et al.， 1987；Avise， 1998， 2000；Sudhir et al.， 2016）。因此，越來越多的研究開始基于多個葉綠體基因開展植物的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理分布格局和種群歷史動態(tài)研究（趙玉芬，2022）。

半夏（Pinellia ternata）為天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）多年生草本植物，別名守田、地文等，民間又稱麻芋頭、天落星、無心菜等，是臨床常用中藥，生長在海拔2 500 m以下潮濕、溫暖、蔭蔽、疏松的砂質(zhì)土壤中，為東亞特有種。在我國除內(nèi)蒙古、青海、新疆和西藏外各省區(qū)均有野生半夏的分布（李玉先等，2004；杜鵑，2006；張君毅，2007；陳黎明等，2020）。由于地理距離的原因，種群和表型的分化隨著時間的推移而發(fā)生，導致其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)受到影響。同時由于廣泛的商業(yè)開發(fā)以及保護措施的缺乏，導致半夏野生資源的數(shù)量急劇下降，因此，應對其野生資源做好收集和遺傳背景分析等方面的工作。隨著半夏利用范圍的不斷擴展，有關(guān)研究也不斷豐富。然而，研究主要集中在化學成分、毒性以及藥理作用等方面（李哲等，2021）。少數(shù)學者對半夏的系統(tǒng)發(fā)育、親緣演化關(guān)系等方面進行了研究。例如，趙月梅和李筱玲（2016）利用matK+rbcL聯(lián)合序列分析半夏屬植物的系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系，表明matK+rbcL聯(lián)合序列可以作為DNA條形碼鑒別半夏屬物種；張君毅（2007）用ITS序列分析我國不同地區(qū)的半夏的序列差異及其與其地理分布和外部形態(tài)的相關(guān)性，并表明半夏rDNA變異與其地理分布相關(guān)，以及潘鳳等（2021）用ITS序列揭示半夏的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性；張景等（2021）利用篩選出的SSR引物分析不同居群間半夏的遺傳多樣性；鄭丹書等（2013）利用葉綠體非編碼區(qū)（psbK-psbI和atpF-atpH）對半夏及近緣種進行序列分析，得到較豐富的變異位點，但仍未基于多個葉綠體基因全面開展半夏遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)、譜系地理分布格局模式和種群歷史動態(tài)研究。半夏作為一個草本、廣布種，生態(tài)適應強，跨越了不同氣候帶和多個生物多樣性研究熱點區(qū)域，是探究草本植物和廣布種遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理分布模式和種群歷史動態(tài)研究的理想材料。本研究采用植物譜系地理學的研究方法，基于3個葉綠體基因psbK-psbI、atpF-atpH和trnL-F對華東、華中、西北、西南等地區(qū)的15個省，19個自然居群共212個野生材料進行分析，探究藥用植物半夏的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理分布模式和種群歷史動態(tài)，旨在揭示半夏不同居群間和居群內(nèi)的遺傳變異、單倍型地理分布格局，推斷其在第四紀冰期的避難所，并為半夏優(yōu)良種源的分子篩選和保護提出科學的建議和保護策略。本研究為半夏資源保護、利用和分子輔助育種提供重要參考和依據(jù)。同時，也為進一步探討中國植物區(qū)系演化及物種多樣性形成提供一定的理論基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1 實驗材料

半夏材料于2015年至2020年采集和保存，覆蓋了貴州、浙江、甘肅和四川等15個省區(qū)，橫跨中國南北方，并呈現(xiàn)華東、華中、西北、西南等不同方位和區(qū)域自然分地理布區(qū)，共采集到19個自然居群共212個個體，位置信息采用全球定位系統(tǒng)測量（表1）。野外采集半夏的新鮮葉片后立即用硅膠干燥保存，用于總DNA提取。所采集的憑證標本存放于貴州大學生命科學學院植物標本室。

1.2 DNA提取及擴增測序

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）從硅膠干燥的葉片中提取半夏總DNA。引物參考已經(jīng)發(fā)表半夏的序列及相關(guān)報道（鄭丹書等，2013），篩選出3對葉綠體基因片段psbK-psbI、atpF-atpH和trnL-F，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。引物序列及PCR擴增程序見表2。PCR擴增反應體系均為25 μL，2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μL，包括ddH2O 8.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA模板2 μL。采用1％瓊脂糖凝膠電泳法檢測總DNA和PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束后將凝膠取出放置于凝膠成像儀中進行觀察結(jié)果，將符合標準的產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化及測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MEGA 7.0軟件（Sudhir et al.， 2016）對序列進行多序列的比對分析，校正錯誤堿基并對序列進行對位排序，并進行人工校正且除去兩端序列引物區(qū)域。利用PhyloSuite軟件（Zhang et al.， 2020）對所得序列進行拼接。運用DnaSP 6.0軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)量（Librado amp; Rozas， 2009），計算各居群單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）、Tajima’s D值、Fu and Li’s F*值、Fu and Li’s D值以及Fu’s Fs值，并進行失配分析以檢測是否經(jīng)歷擴張事件（Tajima，1989；Fu，1997）。利用PERMUTCpSSR 2.0計算總遺傳多樣性（HT）、居群內(nèi)平均遺傳多樣性（HS）及遺傳分化系數(shù)（GST和NST）， 并利用Network構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 （Bandelt"et al.， 1999）。利用Arlequin軟件包（Exoffier amp; Lischer，2010；路雪林，2018）中的分子方差分析（AMOVA）分析群體遺傳結(jié)構(gòu)以及檢測居群內(nèi)和居群間遺傳變異，并計算遺傳分化系數(shù)（FST）和基因流（Nm），進一步揭示居群的分化程度。用ArcGIS 10.2軟件繪制居群單倍型地理分布圖。

2"結(jié)果與分析

2.1 序列變異和單倍型多樣性

psbK-psbI+atpF-atpH+trnL-F聯(lián)合序列成功測序212個個體， 比對校正后的序列長度為1 947bp，包含11個變異位點，G+C含量為31.80%。將這3個序列片段提交至GeneBank，序列號分別為OL310546-OL310559、OL310532-OL310545和OL310560-OL310573。如表3所示，只有西南地區(qū)的云南昭通（C6）、貴州貴陽（C14）、四川綿陽（C17）和華東部的安徽池州（C7）以及浙江義烏（C13）具有多個單倍型，其余居群都只有1種單倍型。運用DnaSP軟件得出半夏總單倍型多樣性Hd為0.882 0，總核苷酸多樣性π為1.23 × 10-3；其中，云南昭通（C6）和四川綿陽（C17）的單倍型多樣性最高（0.533 3），其次是安徽池州（C7）以及浙江義烏（C13）?？傮w來看，西南地區(qū)和華東地區(qū)的居群遺傳多樣性水平較高。

2.2 單倍型分布

用DnaSP軟件對psbK-psbI+atpF-atpH+trnL-F聯(lián)合序列進行了單倍型檢測（不考慮插入和缺失），共得14個單倍型（H1-H14）（圖1）。其中，單倍型H10的個體數(shù)為53個，出現(xiàn)的頻率最高，H2和H10分布范圍最廣，單倍型H10在湖北宜昌（C2）、貴州黔東南（C3）、甘肅天水（C4）、云南昭通（C6）及安徽池州（C7）均有分布；單倍型H2分布在浙江義烏（C13）、陜西商洛（C15）、河北石家莊（C16）、四川綿陽（C17）和江西上饒（C19）。除單倍型H1、H2、H10和H11存在多個居群中以外，其余單倍型均為特有單倍型。單倍型H3只分布在浙江義烏（C13）；單倍型H4和H5只分布在貴州貴陽（C14）；單倍型H6只分布在四川綿陽（C17）；遼寧丹東（C1）僅存在特有單倍型H7；山東青島（C10）僅有特有單倍型H8；單倍型H9僅存在寧夏固原（C18）；單倍型H12僅分布在安徽池州（C7）；江蘇南通（C8）僅存在特有單倍型H13；貴州開陽（C9）只有特有單倍型H14。而安徽池州（C7）擁有最多的單倍型種類（H10、H11和H12）。根據(jù)半夏葉綠體基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，以H10為中心分別衍生出其他單倍型，推測H10為祖先單倍型（圖2）。

2.3 失配分析與中性檢驗

使用DnaSP軟件對其序列進行中性檢驗和失配分析，中性檢驗不顯著。中性檢驗得出較為保守的Tajimas D統(tǒng)計值為0.678 83 （Pgt;0.10）；Fu and Lis D值為1.380 07 （0.05lt;Plt;0.10）；Fu and Lis F*值為1.344 21 （Pgt;0.10）；Fus Fs值為-1.304，Tajimas D為正值，表明半夏群體可能經(jīng)歷瓶頸效應。失配分布圖呈現(xiàn)為雙峰，期望值與觀測值相悖，違背種群擴張模型，中性檢驗結(jié)果也沒有檢測到種群擴張信號，這說明群體歷史平穩(wěn)，整體沒有經(jīng)歷過擴張事件（圖3）。

2.4 遺傳多樣性與群體遺傳結(jié)構(gòu)

利用PERMUT進行遺傳多樣性分析，其總遺傳多樣性HT為0.882，種群內(nèi)平均遺傳多樣性HS餅狀圖表示每個居群中單倍型的頻率。

為0.134；種群間遺傳分化系數(shù)GST為0.855、NST為0.913。種群間遺傳分化系數(shù)均為NSTgt;GST（0.01lt;Plt;0.05），表明在群體水平上，在同一群體中出現(xiàn)親緣關(guān)系相近的不同單倍型， 葉綠體單倍型具有明顯的分子譜系地理結(jié)構(gòu)。

分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示遺傳變異主要發(fā)生在居群間，在19個半夏居群中，居群間遺傳變異占總變異的89.27%，而僅有10.73%的變異來自居群內(nèi)（表4）。遺傳分化系數(shù)FST為0.909 （Plt;0.001），1 000次重復的顯著性檢驗，F(xiàn)STgt;0.25，說明半夏群體之間的遺傳分化程度已經(jīng)達到顯著水平，存在明顯的隔離。假設(shè)該片段變異處于漂變-遷移平衡， 則基于FST值估算出物種水平上居群間的平均基因流值（Nm）為0.02，說明半夏居群間基因流較小。

3"討論與結(jié)論

3.1 遺傳多樣性

居群遺傳多樣性與其生存環(huán)境緊密相關(guān)。居群或物種生存環(huán)境的許多因素直接或間接地影響遺傳多樣性（蔣福娟，2017；洪霞等，2021）。一般而言，廣布種比狹域種具有更高的遺傳多樣性 （Hamrick，1992）。半夏分布范圍廣，不同地理環(huán)境下存在不同的遺傳和形態(tài)變異。我們在調(diào)查采樣時，也觀察到不同生態(tài)型的半夏，在植株大小、葉形和佛焰苞都有不同表現(xiàn)，這與我們的實驗數(shù)據(jù)所推測的結(jié)果吻合。通過對半夏19個天然群體212個個體的3個cpDNA片段進行分析，結(jié)果揭示半夏總單倍型多樣性為Hd=0.882 0，核苷酸多樣性為π=1.23 × 10-3，高于Petit等 （2005）報道的170個物種葉綠體遺傳變異的平均值0.67。張景等（2021）采用SSR分子標記研究17個半夏居群發(fā)現(xiàn)其Nei基因多樣性指數(shù)（h）平均為1.03，潘鳳等（2021）采用ITS序列分析20個半夏居群得到單倍型多樣性Hd為0.859 6。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，均表明半夏在物種水平上具較高的遺傳多樣性。產(chǎn)生這一結(jié)果，一方面是自然環(huán)境的選擇作用。研究發(fā)現(xiàn)物種的分布范圍與遺傳多樣性緊密相關(guān)，不同分布區(qū)或生境地形地貌復雜、氣候變化多樣，生境的差別導致存在一定的地理隔離，使居群在形態(tài)、生理、遺傳、生態(tài)習性等方面出現(xiàn)較大的分化（王愛華等，2011；潘鳳等，2021）。另一方面可能是基因突變，研究發(fā)現(xiàn)半夏兼具有性和無性兩種繁育系統(tǒng)，無性生殖占優(yōu)勢，其原因是半夏雄配子高度不育（王祖秀等，2000）。而在有性生殖較為困難的植物中基因突變是導致物種遺傳變異的主要因素（王愛華等，2011），這一特點可能使其居群間具有較高的遺傳多樣性。同時，半夏具有復雜的基因庫，在漫長的歷史進化過程和世代交替中可能積累了豐富的葉綠體遺傳變異，這為基因突變提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 地理分布格局和種群歷史動態(tài)

植物種群的地理分布格局模式和遺傳結(jié)構(gòu)受到地質(zhì)歷史氣候變化、生境異質(zhì)性以及種子基因交流程度等諸多因素的影響（劉家奇等，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)半夏具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)（NST=0.913gt;GST=0.855， 0.01lt;Plt;0.05），居群間存在顯著的遺傳分化（FST=0.909，Plt;0.001），說明居群間基因交流不頻繁，存在顯著的地理隔離或環(huán)境異質(zhì)性?；贔ST值估算出物種水平上居群間的平均基因流Nm=0.02，當Nm lt;1時，基因流不足以抵制居群內(nèi)因遺傳漂變而引起的居群分化 （Slatkin， 1985）。因此，我們推斷地理隔離（或者環(huán)境異質(zhì)性）和遺傳漂變是導致半夏居群間遺傳分化的主要因素。半夏居群間基因流低，主要有以下兩個原因。（1）與半夏的繁育方式（種子繁殖、塊莖繁殖和珠芽繁殖）有關(guān)（張曉蕓等，2019）。其中，珠芽對半夏的繁殖非常重要，珠芽的大小和數(shù)量與半夏塊莖的產(chǎn)量密切相關(guān)（Zhang et al.， 2013）。半夏的珠芽、子塊莖和果實均在母株附近，缺乏有效的傳播方式，是開拓性較差的物種（顧得興和郭巧生，1990），導致居群間基因流低，居群間的遺傳分化較高。（2）由于地理隔離和環(huán)境因素的影響使得半夏生境出現(xiàn)片段化，致使不同居群或不同區(qū)域半夏群體間基因交流被隔斷或減弱。中性檢驗結(jié)果Tajimas D和Fus Fs均不顯著，表明半夏種群符合中性進化模型。失配分布圖呈現(xiàn)為雙峰，期望值與觀測值相悖，表明半夏沒有經(jīng)歷近期大范圍擴張，這與潘鳳等 （2021） 認為半夏發(fā)生過擴張的結(jié)果相反，這可能與葉綠體DNA的遺傳方式有關(guān)，葉綠體DNA遺傳屬于母系遺傳，基因流大部分是通過種子來傳播（Hu amp; Li， 2002），而核基因為雙親遺傳，種子流和花粉流對居群間基因流均有貢獻。相比花粉傳播，種子傳播有一定限制，導致結(jié)果不一致。

單倍型地理分布顯示，存在多個相對分離的分布區(qū)，各分布區(qū)都存在各自特有單倍型和主要單倍型。研究表明，一般位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖的中間位置、頻率較高、地理分布廣泛的單倍型更為古老 （Freeland et al.， 2012；莫忠妹等，2022）。本研究中單倍型H10頻率較高、地理分布廣泛，位于網(wǎng)絡(luò)中心位置，推測其為最古老的單倍型。其中，安徽池州（C7）不僅擁有較高的單倍型多樣性，還擁有最多的單倍型種類，這與半夏起源于華東地區(qū)，沿長江向周圍擴散的結(jié)論相吻合（李恒，1996）。19個居群中有14個居群都只有一種單倍型，這可能與群體內(nèi)變異程度以及生殖方式有極大關(guān)系，對于主要以營養(yǎng)生殖的半夏來說，很可能在一個群體內(nèi)只有一個基因型，即只有一個無性系。冰期避難所通常指冰期尤其是歷史進程中的末次盛冰期，氣候和地勢條件產(chǎn)生巨大變動，導致生物物種進行地理位置上大規(guī)模的轉(zhuǎn)移后為植物提供生存領(lǐng)域 （Haffer， 1969；趙晶晶等，2021）。從冰川避難所理論得知，遺傳多樣性高、古老單倍型和地方性單倍型較多的地區(qū)可能是該物種在冰期時的潛在避難所（Favre et al.， 2010）。由于西南地區(qū)的云南昭通（C6）、貴州貴陽（C14）、四川綿陽（C17）以及華東地區(qū)的安徽池州（C7）、浙江義烏（C13）均具有較高的遺傳多樣性，并含有古老的單倍型和特有單倍型。因此，半夏在第四紀冰期時存在至少兩個以上的冰期避難所。我們推測半夏在第四紀冰期時可能在中東部和西南地區(qū)存在其冰期避難所，與本課題組對薤白的研究結(jié)果一致（莫忠妹等，2019；石甜等，2021），這可能與它們的分布和習性相似有關(guān)。

本研究開展半夏遺傳多樣性，譜系地理模式和種群歷史動態(tài)分析，采樣覆蓋了貴州、浙江、甘肅和四川等15個省區(qū)，橫跨中國南北方，并呈現(xiàn)華東、華中、西北、西南等不同方位和區(qū)域自然地理分布，呈現(xiàn)了該植物在中國的整個地理分布情況。盡管我們沒有收集到日本和朝韓半島的材料，但我們的研究結(jié)論與本課題組曾對與半夏地理分布相似的薤白、大葉柴胡草本植物譜系地理和遺傳多樣性的研究和前人對分布橫夸中國西南地區(qū)和中東部銀杏（Ginkgo biloba）（Wei et al.， 2008; 樊曉霞，2014）、楓香樹（Liquidambar formosana）（孫榮喜，2017）譜系地理模式的研究結(jié)論有相似性和一致性，因此，我們的實驗樣品采樣點的選擇是可行的，得出的結(jié)論是可靠的。

3.3 藥用植物半夏的優(yōu)良種源分子篩選與保護策略[BT）]

半夏塊莖入藥，有燥濕化痰、降逆止嘔、清痞散結(jié)之功能，是最常用的中藥材之一，在臨床上多用于抗腫瘤、抗生育、抗痙攣、調(diào)血脂、祛痰、消腫和治療冠心?。ǘ啪?， 2006; 王愛華等，2012）。近年來，隨著農(nóng)田化肥、化學農(nóng)藥（如除草劑）的過度使用和資源的無序采挖，農(nóng)田、荒山荒地不斷被開墾利用，半夏野生生長環(huán)境遭到破壞，致使半夏野生資源日趨枯竭。另外，國內(nèi)外對半夏的需求量與日俱增，尤其是全球升溫，肺疾增多，商品市場需求量日益增加。因此，選育優(yōu)良種源或培育新品種成為半夏生產(chǎn)發(fā)展的緊迫現(xiàn)實需求。此外，由于連作障礙導致病蟲害嚴重、產(chǎn)品質(zhì)量降低、產(chǎn)量下降、價格升高、新品種數(shù)量少（或無）等問題（安艷等，2018）。目前生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)極少數(shù)塊莖為紅色的半夏品種具有高產(chǎn)、高抗性等特點，但是卻沒有一套完整的選育方法（張景等，2021）。研究表明半夏懼怕陽光直射，適度遮陰可促進其生長發(fā)育，而過度遮陰則會使植株長勢差，甚至死亡（常琴，2022）。在高溫（≥32 ℃）或溫度過低的冬季均會引起半夏倒苗或休眠，進而影響半夏產(chǎn)量（張明等，2004）。因此選育方向為耐強光高溫、耐低溫陰濕、耐連茬等，旨在提取半夏資源中的優(yōu)異新種質(zhì)。選育樣本通過生物學特性對比、抗性鑒定、產(chǎn)量分析、繁殖特性研究等不同指標篩選出了優(yōu)良株系，再通過資源圃基礎(chǔ)材料的田間表現(xiàn)，以生長勢、單株葉片數(shù)、抗病性、珠芽著生位置及能力、塊莖形狀及生產(chǎn)力等幾個主要指標為目標值的篩選，選出優(yōu)良目標株系。常琴（2022）將半夏產(chǎn)量性狀與細胞學特征關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)基因組小的半夏種質(zhì)似乎更利于株芽形成及地下塊莖增殖。本研究從分子水平上發(fā)現(xiàn)云南昭通（C6）、貴州貴陽（C14）、四川綿陽（C17）以及華東地區(qū)的安徽池州（C7）、浙江義烏（C13）均具有較高的遺傳多樣性，屬于野生優(yōu)良種源分布地。

除了對半夏選育優(yōu)良品種或培育新品種外，還應對其野生資源采取保護措施，對上述遺傳多樣性較高的地區(qū)采取就地保護或遷地保護。半夏由于分布廣，野生數(shù)量少，應該主要采用遷地保護為主，如建立藥用植物半夏種質(zhì)資源圃（庫）等，重點保護具有較高遺傳多樣性的居群。對擁有獨特的單倍型的居群，如遼寧丹東（C1）、安徽池州（C7）、江蘇南通（C8）、貴州開陽（C9）、山東青島（C10）、浙江義烏（C13）、貴州貴陽（C14）、四川綿陽（C17）、寧夏固原（C18）等也應給予優(yōu)先保護。同時，在制定遷地保護策略時，擁有特殊性狀的個體也應當盡量納入保護范圍。

參考文獻：

AN Y， YANG D， LI X， et al.， 2018. Study on the obstacle effect and physiological mechanism of Pinellia ternate continuous cropping ［J］. J NW Agric， 27（7）：1017-1022. "［安艷， 楊丹， 李鑫， 等， 2018. 半夏連作障礙效應及生理機制研究 ［J］. 西北農(nóng)業(yè)學報， 27（7）： 1017-1022.］

AVISE JC， ARNOLD J， BALL RM， et al.， 1987. Intraspecific phylogeography; the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics ［J］. Ann Rev Ecol Syst， 18（1）： 489-522.

AVISE JC， 1998. The history and purview of phylogeography： a personal reflection ［J］. Mol Ecol， 7（4）： 371-379.

AVISE JC， 2000. Phylogeography： The history and formation of species ［M］. Cambridge， Massachusetts， London， England： Harvard University Press： 1-464．

BANDELT HJ， FORSETER P， ROHL A， 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies ［J］. Mol Biol Evol， 16（1）： 37-48.

BENNETT KD， PROVAN J， 2008. What do we mean by ‘refugia’ ［J］. Quat Sci Rev， 27： 2449-2455.

CHANG Q， 2022. Genetic diversity analysis and excellent germplasm selection of Pinellia ternate ［D］. Guiyang： Guizhou University. "［常琴， 2022. 半夏遺傳多樣性分析與優(yōu)異種質(zhì)篩選 ［D］. 貴陽： 貴州大學.］

CHEN LM， HE ZG， HAN RL， 2020. Advances in germplasm resources of Pinellia ternata ［J］. Heilongjiang Agric Sci， （2）： 131-135. "［陳黎明， 何志貴， 韓蕊蓮， 2020. 半夏種質(zhì)資源研究進展 ［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學， （2）： 131-135.］

DU J， 2006. Comparative study on comprehensive characters of Pinellia ternata in different populations ［D］. Beijing： Capital Normal University： 1-79. "［杜娟， 2006. 不同居群半夏綜合性狀的比較研究 ［D］. 北京： 首都師范大學： 1-79.］

EXOFFIER L， LISCHER HEL， 2010. Arlequin suite ver 3.5： a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows ［J］. Mol Ecol Notes，10（3）： 564-567.

FAN XX， 2014. The research on the variety of genetic structure of Ginkgo biloba based on cpDNA hypolytypes ［J］. Nat Sci J Harbin Norm Univ， 30（4）： 104-107. "［樊曉霞， 2014. 基于葉綠體DNA單倍型的銀杏遺傳多樣性格局研究 ［J］. 哈爾濱師范大學自然科學學報， 30（4）： 104-107.］

FAVRE A， YUAN YM， KUPFER P， et al.， 2010. Phylogeny of subtribe Gentianinae （Gentianaceae）： biogeographic inferences despite limitations in temporal calibration points ［J］. Taxon， 59（6）： 1701-1711.

FREELAND JR， KIRK H， PETERSEN SD， 2012. Phylogeography ［M］. 2nd ed. New Jersey： John Wiley amp; Sons Inc.， Wiley-Blackwell： 225-269.

FU YX， 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth， hitchhiking and background selection ［J］. Genetics， 147（2）： 915-925.

GU DX， GUO QS， 1990.A study on the biological characteristics of Pinellia ternata populations ［J］. J Nanjing Agric Univ， 13（2）： 11-16. "［顧得興， 郭巧生， 1990. 半夏群體生物學特性的研究 ［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學學報， 13（2）： 11-16.］

HAFFER J， 1969. Speciation in amazonian forest birds ［J］. Science， 165（3889）： 131-137.

HARRISON S， YU G， TAKAHARA H， et al.， 2001. Palaeovegetation. Diversity of temperate plants in east Asia ［J］. Nature， 413（6852）： 129-130.

HAMRICK JL， 1992. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species ［J］. New For， 6（1/2/3/4）： 95-124.

HEWITT GM， 1996. Some genetic consequences of ice ages， and their role in divergence and speciation ［J］. Biol J Linn Soc， 58（3）： 247-276.

HEWITT GM， 2004. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary ［J］. Philos Trans R Soc B， 359（1442）： 183-195.

HICKERSON MJ， CARSTENS BC， CAVENDER-BARES J， et al.， 2010. Phylogeographys past， present and future： 10 years after ［J］. Mol Phylogenet Evol， 54： 291-301.

HONG X，CHEN XS， WANG JY， et al.， 2021. Sequence characteristics and genetic diversity analysis of chloroplast gene trnH-psbA in taro germplasm ［J］. J Zhejiang Agric Sci， 62 （11）： 2274-2276. "［洪霞， 陳孝賞， 王嬌陽， 等， 2021. 芋種質(zhì)葉綠體基因 trnH-psbA 序列特征及遺傳多樣性分析 ［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學， 62 （11）： 2274-2276.］

HU XS， LI B， 2002. Seed and pollen flow and cline discordance among genes with different modes of inheritance ［J］. Heredity， 88（3）： 212-217.

HU[ZK（] YC， MA H， ZHU JZ， et al.， 2021. Analysis of genetic diversity of ancient Lycium barbarum trees based on chloroplast gene ［J/OL］. Mol Plant Breed： 1-14 ［2023-06-18］. https：//ifgfy2b08d79e045e4fd4hqw0x55pxwqov6q

cqficg.res.gxlib.org.cn/kcms/detail/46.1068.S.20211011.1803.008.html. "［胡永超， 馬潔， 朱金忠， 等， 2021. 基于matK、psbA-trnH、racL-a、trnL-trnF序列分析枸杞古樹的遺傳多樣性 ［J/OL］. 分子植物育種： 1-14 ［2023-06-18］. https：//ifgfy2b08d79e045e4fd4hqw0x55pxwqov6qcqficg.res.gxlib.org.cn/kcms/detail/46.1068.S.20211011.1803.008. html.］

JIANG FJ， 2017. Phylogeography of Lilium pumilum Redouté in southeast of Qinghai-Tibetan Plateau ［D］. Xining： Qinghai University： 1-74. "［蔣福娟， 2017. 青藏高原東南部山丹的譜系地理學研究 ［D］. 西寧： 青海大學： 1-74.］

LI H， 1996.The ecological phytogeography and origin of the family Araceae ［J］. Acta Bot Yunnan， 18（1）： 14-42. "［李恒， 1996. 從生態(tài)地理探索天南星科的起源 ［J］. 云南植物研究， 18（1）： 14-42.］

LI YX， LIU XD， ZHU ZJ， 2004. Progress on the research of pharmacology of Pinellia ternate ［J］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med， 6（6）： 459-460. "［李玉先， 劉曉東， 朱照靜， 2004. 半夏藥理作用的研究述要 ［J］. 遼寧中醫(yī)學院學報， 6（6）： 459-460.］

LI Z， XUAN J， ZHAO ZH， et al.， 2021. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Banxia （Pinelliae Rhizoma） ［J］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med， 23（11）： 154-158. "［李哲， 玄靜， 趙振華， 2021. 半夏化學成分及其藥理活性研究進展 ［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學學報， 23（11）： 154-158.］

LIBRADO P， ROZAS J， 2009. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data ［J］. Bioinformatics， 25（11）： 1451-1452.

LU XL， 2018.Phylogeography of Camellia nitidissima ［D］. Guilin： Guangxi Normal University： 1-61. "［路雪林， 2018. 金花茶的譜系地理學研究 ［D］. 桂林： 廣西師范大學： 1-61.］

LIU JQ， SUN YS， GE XJ， et al.， 2012. Phylogeographic studies of plants in China： advances in the past and directions in the future ［J］. J Syst Evol， 50（4）： 267-275.

LIU JQ， FU MJ， WU HY， et al.， 2021. Phylogeography of the Loess Plateau plant Prinsepia uniflora inferred from the chloroplast DNA ［J］. Guihaia， 41（3）： 396-403. "［劉家奇， 付孟嬌， 吳海洋， 等， 2021. 基于葉綠體DNA的黃土高原特有植物蕤核的譜系地理學 ［J］. 廣西植物， 41（3）： 396-403.］

MENG HH， GAO XY， HUANG JF， et al.， 2015. Plant phylogeography in arid Northwest China： Retrospectives and perspectives ［J］. J Syst Evol， 53（1）： 33-46.

MO ZM， YANG CD， LI YS， et al.， 2022. Analysis of genetic diversity and geographical distribution pattern of Spiranthes sinensis ［J］. Mol Plant Breed， 20（3）： 1037-1044. "［莫忠妹， 楊傳東， 李銀雙， 等， 2022. 綬草的遺傳多樣性及地理分布格局分析 ［J］. 分子植物育種， 20（3）： 1037-1044.］

MO ZM， CHENG Y， SHI T， et al.， 2019. Geneticrelationship and geographical distribution pattern of different Allium macrostemon populations in southwest China based on ITS sequences ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 39（9）： 1573-1580. "［莫忠妹， 成宇， 石甜， 等， 2019. 基于ITS序列西南地區(qū)不同居群薤白親緣關(guān)系及其地理分布格局研究 ［J］. 西北植物學報， 39（9）： 1573-1580.］

PAN F， MO ZM， SHI T， et al.， 2021. Genetic diversity and genetic structure analysis of Pinellia ternata （Thunb.） Breit populations ［J］. Mol Plant Breed， 19（24）： 8347-8352. "［潘鳳， 莫忠妹， 石甜， 等， 2021. 半夏居群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析 ［J］. 分子植物育種， 19（24）： 8347-8352.］

PETIT RJ， DUMINIL J， FINESCHI S， et al.， 2005. Comparative organization of chloroplast， mitochondrial and nuclear diversity in plant populations ［J］. Mol Ecol， 14（3）： 689-701.

QIU YX， FU CX， COMES HP， 2011. Plant molecular phylogeography in China and adjacent regions： Tracing the genetic imprints of Quaternary climate and environmental change in the worlds most diverse temperate flora ［J］. Mol Phylogenet Evol， 59（1）： 225-244.

SHAFER A， CULLINGHAM CI， CO∧Té SD， et al.， 2010. Of glaciers and refugia： a decade of study sheds new light on the phylogeography of "northwestern North America ［J］. Mol Ecol， 19（21）： 4589-4621.

SHI T， MO ZM， WU M， et al.， 2021. Phylogeography of medicinal and edible homologous plant Allium macrostemon ［J］. Bull Bot Res， 42（4）： 574-583. "［石甜， 莫忠妹， 吳敏， 等， 2021. 藥食同源植物薤白的譜系地理學研究 ［J］. 植物研究， 42（4）： 574-583.］

SLATKIN M， 1985. Gene flow in natural populations ［J］. Ann Rev Ecol Syst， 16： 393-430.

SOLTIS DE， MORRIS AB， MCLACHLAN JS，et al.， 2006. Comparative phylogeography of unglaciated eastern North America ［J］. Mol Ecol， 15（14）： 4261-4293.

SUDHIR K， GLEN S， KOICHIRO T， 2016. MEGA7： Molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for bigger datasets ［J］. Mol Biol Evol， 33（7）： 1870-1874.

SUN RX， 2017. Genetic diversity and geography of Liquidambar formosana Hance in China ［D］. Beijing： China Academy of Forestry Sciences： 1-132. "［孫榮喜， 2017. 中國楓香樹遺傳多樣性及譜系地理研究 ［D］. 北京： 中國林業(yè)科學研究院： 1-132.］

TAJIMA F， 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism ［J］. Genetics， 123（3）： 585-595.

WANG AH， JI XB， WENG XP， 2012. Genetic diversity of 16 wild Pinellia ternate germplasm ［J］. Guizhou Agric Sci， 40（1）： 15-19. "［王愛華， 季祥彪， 文曉鵬， 2012. 16份野生半夏的遺傳多樣性分析 ［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 40（1）： 15-19.］

WANG YH， COMES HP， CAO YN， et al.， 2017. Quaternary climate change drives allo-peripatric speciation and refugial divergence in the Dysosma versipellis-pleiantha complex from different forest types in China ［J］. Sci Rep-UK， 7（1）： 40261.

WANG ZX， PENG ZS， HE YK， 2000. Genetic analysis of male gamete abortion of Pinellia ternate ［J］. J Crops， 26（1）： 83-86. "［王祖秀， 彭正松， 何奕昆， 2000. 三葉半夏雄配子敗育的遺傳分析 ［J］. 作物學報， 26（1）： 83-86.］

WEI G， CHUAN C， CHRISTOPH D， et al.， 2008. Phylogeography of a living fossil： Pleistocene glaciations forced Ginkgo biloba L. （Ginkgoaceae） into two refuge areas in China with limited subsequent postglacial expansion ［J］. Mol Phylogenet Evol， 48（3）： 1094-1105.

YE JW， BAI WN， BAO L， et al.， 2017. Sharp genetic discontinuity in the aridity-sensitive species Lindera obtusiloba （Lauraceae）： Solid evidence supporting the tertiary floral subdivision in East Asia ［J］. J Biogeogr， 44（9）： 2082-2095.

ZHANG D， GAO F， JAKOVLI I， et al.， 2020. PhyloSuite： An integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies ［J］. Mol Ecol Resour， 20（1）： 348-355.

ZHANG J， LI XD， ZONG QB， et al.， 2021.Development of SSR molecular markers and genetic diversity analysis in Pinellia ternata （Thunb.） Breit ［J］. J Huazhong Agric Univ， 40（6）： 19-26. "［張景， 李曉東， 宗慶波， 等， 2021. 半夏SSR分子標記開發(fā)與遺傳多樣性 ［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學學報， 40（6）： 19-26.］

ZHANG JY， GUO Q， ZHENG D， 2013. Genetic diversity analysis of Pinellia teranata based on SRAP and TRAP markers ［J］. Biochem Syst Ecol. DOI：10.1016/j.bse.2013.03.052.

ZHANG JY， 2007. Study on genetic diversity of "Pinellia ternata by molecular markers and quality assessment ［D］. Nanjing： Nanjing Agricultural University： 1-140. "［張君毅， 2007. 半夏遺傳多樣性分子標記及質(zhì)量評價研究 ［D］. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學： 1-140.］

ZHANG JY， GUO QS， WU LW， et al.， 2006. Ribosomal DNA ITS sequence analysis of Pinellia ternata from different geographical region in China ［J］. Chin J Chin Mat Med， 31（21）： 1768-1772. "［張君毅， 郭巧生， 吳麗偉， 等， 2006. 我國不同地區(qū)半夏rDNA序列分析 ［J］. 中國中藥雜志， 31（21）： 1768-1772.］

ZHANG M， ZHONG GY， MA KS， et al.， 2004. Experimental observation on the causes of Pinellia ternata seedling fall ［J］. Chin J Chin Mat Med， 29（3）： 85-86. "［張明， 鐘國躍， 馬開森， 等， 2004. 半夏倒苗原因的實驗觀察研究 ［J］. 中國中藥雜志， 29（3）： 85-86.］

ZHANG XY， YANG MQ， XU Y， et al.， 2019. Study on the genetic diversity and genetic structure of Cardiocrinum giganteum based on rpl16 sequences analysis ［J］. J Plant Genet Resour， 20（1）： 199-206. "［張曉蕓， 楊妙琴， 徐英， 等， 2019. 基于rpl16序列分析大百合的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu) ［J］. 植物遺傳資源學報， 20（1）： 199-206.］

ZHAO JJ， HUANG Y， ZHANG DQ， et al， 2021. Phylogeography of Paris polyphylla var. yunnanensis based on chloroplast gene trnL-trnF sequences ［J］. Chin J Chin Mat Med， 46（5）： 1094-1101. "［趙晶晶， 黃瑜， 張德全， 等， 2021. 基于葉綠體基因trnL-trnF序列的滇重樓譜系地理學研究 ［J］. 中國中藥雜志， 46（5）： 1094-1101.］

ZHAO YF， 2022. Application of chloroplast genome in botany research ［J］. Biol Teach， 47（3）： 83-85. "［趙玉芬， 2022. 葉綠體基因組在植物學研究中的應用進展 ［J］. 生物學教學， 47（3）： 83-85.］

ZHAO YM， LI XL， 2016. An application of matK and rbcL in Pinellia ［J］. J Shangluo Univ， 30（6）： 67-70. "［趙月梅， 李筱玲， 2016. matK和rbcL序列在半夏屬中的應用 ［J］. 商洛學院學報， 30（6）： 67-70.］

ZHENG DS， ZHANG JY， GUO QS， 2013. cpDNA non-coding sequence analysis of Pinellia ternata and its related species ［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 44（7）：881-886. "［鄭丹書， 張君毅， 郭巧生， 2013. 半夏及近緣種葉綠體非編碼區(qū)序列分析 ［J］. 中草藥， 44（7）： 881-886.］

（責任編輯"周翠鳴）

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202207008

吳敏， 吳詩琪， 潘鳳， 等， 2024.

中國野生半夏的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究 ［Ｊ］.廣西植物， 44（4）： 766-776.

WU M， WU SQ， PAN F， et al.， 2024.Genetic diversity and genetic structure of wild "Pinellia ternata （Araceae） in China ［J］.Guihaia， 44（4）： 766-776.

吳敏等： 中國野生半夏的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究

收稿日期： "2023-06-18"接受日期： 2023-07-20

基金項目： "貴州科技支撐計劃項目（黔科合支撐［2019］2451-2號）； 貴州省教育廳教育部重點實驗室開放課題（黔教合KY字［2019］033）； 貴州省生物學國內(nèi)一流建設(shè)學科開放基金（GNYL［2017］009）； 貴州省中藥材現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（GZCYTX-02）； 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室開放課題基金（［2020］2003）。

第一作者： 吳敏（1996—），碩士研究生，主要從事植物系統(tǒng)與進化生物學研究，（E-mail）2495649994@qq.com。

通信作者： "趙財，博士，副教授，主要從事植物系統(tǒng)與進化、植物多樣性及保護方向研究，（E-mail）zhaocai_11@163.com。