非洲豬瘟基因I 型/II 型重組病毒研究現(xiàn)狀及思考

戈勝強(qiáng)，沙 洲，鄭 輝，劉春菊，左媛媛，胡永新，王曉華，劉 爽，魏 榮，王志亮

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島市現(xiàn)代生物工程及動物疫病研究重點實驗室，山東青島 266032；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

2018 年非洲豬瘟（African swine fever，ASF）傳入我國后，在國內(nèi)持續(xù)流行蔓延，目前疫情數(shù)量雖然大幅下降，但其病原已在我國定殖并形成較大污染面，疫情發(fā)生風(fēng)險依然較高。我國最早傳入的非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）為China 2018/1 株[1]（后重新命名為China/LN/2018/1[2]），是基因II 型毒株。隨后相關(guān)研究機(jī)構(gòu)在相近時間內(nèi)分離到了pig/HLJ/18 株[3]和SY18 株[4]，其均為基因II 型毒株。這些分離株與2007 年傳入格魯吉亞的Georgia 2007 毒株[5]高度相似，致死率最高可達(dá)100%。2021 年國內(nèi)報道發(fā)現(xiàn)基因I 型HeN/ZZ-P1/21 株和SD/DY-I/21 株，該類毒株仍具有一定毒力和水平傳播能力，且組織臟器中病毒拷貝檢測Ct 值達(dá)25 左右[6]。基因I 型和II 型毒株在同一區(qū)域內(nèi)流行，過去只在非洲部分國家[7]和意大利撒丁島[8]等區(qū)域發(fā)生。國外研究者曾報道過ASFV 重組毒株，但發(fā)生基因I 型和II 型重組的未見報道。2021 年以來，國內(nèi)研究者在江蘇?。↗iangsu/LG/2021 株，JS/LG/21）、河南省（Pig/Henan/123014/2022 株，HeN/123014/22）和內(nèi)蒙古自治區(qū)（Pig/Inner Mongolia/DQDM/2022株，IM/DQDM/22）相繼發(fā)現(xiàn)基因I 型/II 型重組毒株[9]，這是世界范圍內(nèi)首次報道此類相關(guān)重組毒株。目前，關(guān)于ASFV 重組毒株的國內(nèi)外研究較少，尚缺乏系統(tǒng)的專業(yè)闡述，為此就相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)歸納，以期為我國ASF 防控提供參考。

1 ASFV 重組研究現(xiàn)狀

基因重組是許多病毒進(jìn)化的重要驅(qū)動力[10]。基因重組事件通常發(fā)生在序列高度相似的病毒之間[11]，特別是DNA 病毒，如在ASFV、皰疹病毒（herpesviruses）、腺病毒（adenoviruses）、痘病毒（poxviruses）、雙生病毒（geminiviruses）等病毒中均觀察到重組現(xiàn)象[12-14]。值得注意的是，根據(jù)有限的基因組序列識別重組事件并非易事[15-16]。早期的ASFV 重組研究因缺乏足夠完整的病毒基因組序列，只能對其進(jìn)行相對簡單的單基因重組分析。例如，16 株意大利分離株和1 株南非分離株的E183L基因（編碼p54 蛋白）經(jīng)RDP3 軟件分析存在相似的重組事件，推測這些毒株來源于同一個重組毒株[17]。相似的，ASFV的多基因家族（MGF）以及B602L、EP153R和EP402R（編碼CD2v 蛋白）等基因也存在重組事件[18]。例如，格魯吉亞2007分離株（Georgia 2007/1）的EP402R基因與非洲馬拉維分離株（Malawi Lil20/1）和肯尼亞分離株（Kenya 1950）相近，而其EP153R基因與疣豬分離株相近[19-20]。進(jìn)一步的研究[21]顯示，EP153R和EP402R基因的重組，促進(jìn)了ASFV 血清型特異性位點進(jìn)化，有利于病毒的進(jìn)化生存。2019 年P(guān)eng等[22]對39 株ASFV 全基因組序列（包含多種基因型）分析發(fā)現(xiàn)，ASFV 基因組間存在廣泛的同源重組，而同源重組是造成ASFV 遺傳多樣性的主要原因。2023 年Bao 等[23]進(jìn)一步對41 株基因II 型ASFV 進(jìn)行了遺傳追溯研究，也證實了重組現(xiàn)象存在于基因II 型分離株中。

ASFV 發(fā)生重組必須滿足以下條件：一是病毒基因組中存在大量重復(fù)序列并在病毒復(fù)制過程中發(fā)生基因替換等重組現(xiàn)象（此基因組特征已被廣泛證實[24]）；二是多株毒株共同感染（較高感染劑量）同一頭豬，不同毒株間發(fā)生基因重組。臨床中，雙重感染（dual infections）、共同感染（co-infection）、重復(fù)感染（superinfections）在病毒感染宿主過程中并不罕見[25]。但實際上在ASF 流行歷史中，流行毒株相對單一，因而發(fā)生雙重感染的事件并不是很多。如莫桑比克在1960 年至1994 年間，存在同一疫情暴發(fā)期間兩個基因型毒株共同傳播，但并未發(fā)現(xiàn)共同感染的證據(jù)[26]。這其中的原因也可能是當(dāng)時的鑒別診斷方法并不先進(jìn)。如果某個地域存在多種毒株流行，就存在一定的雙重感染發(fā)生概率。2017 年，Mulumba-Mfumu 等[27]在追溯研究中首次報道，在2005 年的同一份豬病料中分離到2 株基因I 型ASFV 毒株，在2010 年的疫情中分離到兩個基因型毒株（基因I 型和基因XIV）。相似的，2021 年，F(xiàn)iori 等[28]進(jìn)行了ASFV 追溯性研究，從1984 年的野豬樣品和2018 年的家豬樣品中均發(fā)現(xiàn)了雙重感染證據(jù)。鑒于檢測雙重感染的診斷技術(shù)具有一定難度，同時該研究在不到100 個樣本中就發(fā)現(xiàn)有兩種不同的雙重感染，這有力說明了ASFV雙重感染在意大利撒丁島可能是相對常見事件，這可能與該地區(qū)ASFV 流行率高和多種毒株共同流行的現(xiàn)狀緊密相關(guān)。

2 我國基因I 型/II 型重組毒株研究現(xiàn)狀

2021 年國內(nèi)報道的基因I 型毒株（HeN/ZZP1/21 株和SD/DY-I/21 株）均無紅細(xì)胞吸附活性（HAD-）[6]，這是國內(nèi)基因I 型毒株最具代表的生物學(xué)特征之一?；蚍中停↖ 型或II 型）由B646L基因（編碼p72 蛋白）序列決定，紅細(xì)胞吸附活性由EP402R基因（編碼CD2v 蛋白）序列的完整性決定。因此，當(dāng)研究者發(fā)現(xiàn)國內(nèi)新分離基因I 型毒株具備紅細(xì)胞吸附活性（HAD+）時，會首先聯(lián)想到其B646L和EP402R基因發(fā)生了組合變化?；騃 型/II 型重組毒株（JS/LG/21、HeN/123014/22和IM/DQDM/22）可簡單定義為，B646L基因來自于基因I 型，EP402R基因來自于基因II 型。但全基因組序列分析顯示，該毒株的重組復(fù)雜程度遠(yuǎn)超之前國內(nèi)外的其他所有重組分離株。根據(jù)基因I型和II 型ASFV 的特異性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分析，基因I 型/II 型重組毒株的全基因組序列可被拆分為20 個大的基因片段（F1—F20），其中10 個片段來源于基因I 型毒株（基因I 型相似率為99.36%～100%，基因II 型相似率低至71.28%～99.15%）， 另外10 個片段來源于基因II 型毒株（基因II 型相似率為99.95%～100%，基因I 型相似率低至27.50%～98.32%）。

基因I 型/II 型重組毒株毒力評價顯示，該毒株的毒力與基因II 型強(qiáng)毒株（pig/HLJ/18）相當(dāng)，某些致病指標(biāo)甚至更高。如基因II 型強(qiáng)毒株（pig/HLJ/18）以106.5HAD50劑量攻毒后，最早在第6天出現(xiàn)感染豬死亡[3]；而基因I 型/II 型重組毒株（JS/LG/21）以更低的106HAD50劑量攻毒后，最早在第5 天出現(xiàn)感染豬死亡。此外，該毒株可逃避基因II 型減毒活疫苗株（HLJ/18-7GD）[29]誘導(dǎo)的免疫保護(hù)，即對HLJ/18-7GD 免疫接種豬（肌肉注射，106TCID50）進(jìn)行JS/LG/21 攻毒（肌肉注射，103TCID50），結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有豬均在第10 天死亡。

之前也有類似ASFV 大片段重組的報道，重組區(qū)域最大為20 010 bp[30]，但像JS/LG/21 這樣，僅以基因I 型和II 型基因序列為來源，不同長度片段（重組區(qū)域占比為1%～24%）交替重組的尚屬首次發(fā)現(xiàn)，其基因組序列在某種意義上更近似基因I型/II 型嵌合基因組（mosaic genomes of genotype I and genotype II）的樣貌。再加上基因II 型減毒活疫苗株不能對該毒株產(chǎn)生有效保護(hù)，結(jié)合ASFV 不同基因型間普遍存在交叉保護(hù)差的問題，這似乎也佐證了該毒株具備了基因I 型和II 型的雙重特性，在生物學(xué)特性上具備了嵌合病毒的一些特征。該毒株在國內(nèi)的流行演變可能會顯著影響ASFV 的進(jìn)化方向，并提示以基因II型為研究對象的疫苗半成品，將面臨新的研制挑戰(zhàn)。

3 結(jié)語

過去研究認(rèn)為，ASFV 在疣豬和軟蜱中的長期持續(xù)感染可能為不同基因型毒株的共同感染及隨后的基因重組提供了機(jī)會[31]。但由于鑒別診斷和全基因測序分析技術(shù)的滯后及流行毒株單一等，在東歐國家以及俄羅斯流行的基因II 型毒株（Georgia 2007 株來源）未出現(xiàn)重大的重組事件[21]。而我國分離的基因I 型/II 型重組毒株，因嵌合了兩個基因型序列并部分整合了二者的生物學(xué)特性，使得我國流行分離株增加了新的分支。在原有基因II 型強(qiáng)毒株、基因I 型中等毒力毒株、基因II 型缺失株/變異株等共同流行的背景下，新出現(xiàn)的基因I型/II 型重組毒株可能會進(jìn)一步“擾亂”現(xiàn)有毒株的進(jìn)化方向，加速毒株向復(fù)雜化、差異化變異。但同時，基因I 型/II 型重組毒株，也會沿襲病毒演化規(guī)律[32]，經(jīng)臨床不斷“馴化”后演變出毒力致弱的相關(guān)毒株，提示我國ASF防控形勢將更加復(fù)雜。

此外，現(xiàn)有絕大多數(shù)核酸檢測方法是針對B646L基因保守區(qū)，因此對于鑒定基因I 型/II 型重組毒株仍有效，但過分強(qiáng)調(diào)鑒別檢測能力的新方法（特別是多重qPCR 方法），雖可對當(dāng)前流行毒株進(jìn)行鑒別檢測，但伴隨著毒株變異可能加速，變異方向不確定等因素，可能存在新研制檢測方法很快失效的困境，需加以重視和區(qū)分。