西式干腌火腿中蛋白降解與粗肽抑菌能力相關(guān)性分析初步研究

張?jiān)棋?張欣,李明明,曹建新,王守偉*

1(昆明理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明,650500)2(中國(guó)肉類食品綜合研究中心,北京,100068)

干腌火腿以其獨(dú)特的質(zhì)地和風(fēng)味在世界各地廣受歡迎,而干腌火腿在不同年份之間有明顯的差異[1-2]。蛋白質(zhì)降解是干腌火腿中非常重要的組成部分,現(xiàn)有研究表明,蛋白質(zhì)的變化會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品產(chǎn)生顯著影響,其中NaCl含量、水分含量、pH值和溫度是最突出的因素[3]。蛋白質(zhì)降解是在內(nèi)源酶(如組織蛋白酶、鈣蛋白酶、二肽酶和三肽酶等)共同作用下[4],由內(nèi)肽酶啟動(dòng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解為蛋白質(zhì)片段和多肽。這些多肽可被外肽酶進(jìn)一步水解,產(chǎn)生更小的肽和游離氨基酸,這些小肽因其特殊的氨基酸排列順序和部分特殊結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)出一定的生物活性,例如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、抗氧化活性、抑菌活性、二肽基肽酶IV抑制活性等體內(nèi)降壓、降血糖或抗炎活性[5-10]。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一類具有天然生物活性的多肽,自1972年,BOMAN等[11]通過(guò)誘導(dǎo)惜古比天蠶分離出的第一例抗菌肽-天蠶素(cecropins)開(kāi)始,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3 000余種抗菌肽。抗菌肽來(lái)源廣泛,主要包括動(dòng)物源、植物源和微生物源這3種,而動(dòng)物源抗菌肽主要源自昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和海洋生物等[12],在食品領(lǐng)域中,抗菌肽更多來(lái)自于牛奶[13]、蝦[14]、辣椒籽[15]等,肉源的抗菌肽相對(duì)較少[16],并且大多存在于肉制品中[17-18]。鄭錦曉[19]研究了3種中國(guó)傳統(tǒng)干腌火腿中粗多肽抗菌活性,在宣威火腿中篩分出了抗菌肽并鑒定了其結(jié)構(gòu);CASTELLANO等[20]對(duì)西班牙干腌火腿進(jìn)行提取分離,獲得了一個(gè)對(duì)李斯特菌有效的抗菌肽RHGYM。研究者們大多數(shù)是通過(guò)抗菌活性逐步分離純化,最終得到一個(gè)或多個(gè)具備優(yōu)良性能的抗菌肽,較為單一。從火腿蛋白降解方面對(duì)抑菌性能進(jìn)行分析不失是對(duì)火腿抗菌肽方面的補(bǔ)充,蔡音音通過(guò)此方法對(duì)魚(yú)蝦進(jìn)行研究,并通過(guò)建構(gòu)模型對(duì)抗菌肽進(jìn)行預(yù)測(cè)[21]。本研究將以不同成熟期的西式干腌火腿作為研究對(duì)象,以蛋白降解指數(shù)和多肽氨基酸組成為因素,火腿粗肽的抑菌能力為指標(biāo),初步探究火腿蛋白降解與火腿粗肽抑菌能力的關(guān)系,為后續(xù)深入分析西式干腌火腿中抗菌肽性能與蛋白降解之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干腌火腿,北京金美添公司,分別選取成熟時(shí)間為24月和30月火腿樣品,從每個(gè)成熟期隨機(jī)選取3條火腿,用無(wú)菌刀取其股二頭肌(biceps femoris, BF)和半膜肌(semimembranosus, SM)部分各500 g,成熟期24月、30月對(duì)應(yīng)的股二頭肌和半膜肌樣品分別記為24BF、24SM、30BF和30SM,真空封存4 ℃冷藏備用。

硫酸、Na2HPO4、NaH2PO4、甲醇、乙醇、消化片、鹽酸、硼酸、三氯乙酸、異丙醇、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、四硼酸鈉、β-巰基乙醇、胰酪蛋白胨,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、BHI肉湯培養(yǎng)基、瓊脂,北京索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水分含量與水分活度測(cè)定

水分活度測(cè)定:將去除表面氧化層的火腿樣品取2 cm,切碎,平放在智能水分活度儀樣品槽中進(jìn)行分析。

水分含量測(cè)定:根據(jù)HARKOUSS等[3]的方法,將2～3 g樣品在105 ℃的恒溫箱中干燥至恒重。水分含量表示為水與總物質(zhì)(TM)質(zhì)量的比值,kgH2O/kgTM。

1.2.2 蛋白降解指數(shù)(proteolysis index, PI)的測(cè)定

總氮(total nitrogen, TN)測(cè)定:參考國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》,稱取火腿樣品1.000 g至消化管中,再加入兩片消化片和10 mL硫酸于消化爐進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到420 ℃之后,繼續(xù)消化1 h,冷卻取出后采用自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行總氮含量的測(cè)定。

非蛋白氮(nonprotein nitrogen, NPN)測(cè)定:準(zhǔn)確稱取1 g火腿樣品,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液溶解樣品并定容至50.0 mL,混勻后靜置20 min,過(guò)濾。吸取5.0 mL濾液,移入消化管中,消化及測(cè)定方法同總氮測(cè)定方法。PI的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.3 干腌火腿粗肽的提取

磷酸鹽提取法:參考刑路娟[7]的實(shí)驗(yàn)方法,并略作修改:取干腌火腿樣品50 g,組織搗碎后加入200 mL異丙醇,浸提2 h,紗布過(guò)濾,室溫蒸發(fā)剩余異丙醇;加入200 mL pH=7.4磷酸緩沖液(0.02 mol/L),用無(wú)菌均質(zhì)機(jī)600 r/min拍打4 min,于4 ℃靜置1 h后,12 000×g離心20 min,取上清液過(guò)濾,再加入2倍體積乙醇溶液,4 ℃靜置10 h后,12 000×g離心10 min,最后取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,旋蒸濃縮,冷凍干燥、稱量,-20 ℃冰箱中保存。

鹽酸提取法:參考CASTELLANO等[20]實(shí)驗(yàn)方法,并略作修改:取干腌火腿樣品50 g,打碎后分別加入200 mL異丙醇,浸提2 h后紗布過(guò)濾,室溫蒸發(fā)剩余異丙醇;加入200 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液,用無(wú)菌均質(zhì)機(jī),600 r/min拍打4 min,于4 ℃靜置1 h后,12 000×g離心20 min,取上清液過(guò)濾,再加入2倍體積乙醇溶液,4 ℃靜置10 h后,12 000×g離心10 min,最后取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,旋蒸濃縮,冷凍干燥、稱量,-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 磷酸法提取實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

樣品預(yù)處理?xiàng)l件相同,以乙醇添加量(1.5、2、2.5、3倍)和乙醇沉淀時(shí)間(4、10、20 h)為變量,以大腸桿菌抑菌率、單增李斯特菌抑菌率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素條件優(yōu)化試驗(yàn),得到較佳的干腌火腿粗肽提取工藝參數(shù)。

1.2.5 肽含量的測(cè)定

參考CHURCH等[22]的方法,并略作修改。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的粗肽液,取40 mg鄰苯二甲醛溶于1.0 mL甲醇,依次加入25 mL 100 mmol/L硼砂,2.5 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))十二烷基硫酸鈉和100 μL β-巰基乙醇,用超純水定容至50.0 mL,配制成鄰苯二甲醛混合液;取100 μL待測(cè)樣品與2.0 mL鄰苯二甲醛混合液混合,在室溫下反應(yīng)2 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定其在340 nm下的吸光值。并以胰酪蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,配制等梯度濃度的溶液,測(cè)定其吸光值,繪制胰酪蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算粗肽的含量。

1.2.6 大腸桿菌抑菌率測(cè)定

參考鄭錦曉[19]的實(shí)驗(yàn)方法并略作修改。將菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,濃度調(diào)整為1×105CFU/mL,按照1∶4(體積比),吸取細(xì)菌培養(yǎng)液100 μL至400 μL無(wú)菌PBS中,為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)管中分別加入100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液,400 μL無(wú)菌多肽溶液,500 μL LB肉湯培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)(37 ℃,150 r/min,1 h)。隨后對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋,取1 mL菌液與20 mL的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂混勻,傾注在培養(yǎng)皿上,等待凝固后倒置37 ℃培養(yǎng)24 h,計(jì)算菌落總數(shù)。抑菌率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:N1,對(duì)照管細(xì)菌菌落總數(shù),CFU;N0,實(shí)驗(yàn)管細(xì)菌菌落總數(shù),CFU。

1.2.7 單增李斯特菌抑菌率測(cè)定

參考鄭錦曉[19]的實(shí)驗(yàn)方法并略作修改。將菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,濃度調(diào)整為1×105CFU/mL,按照1∶4(體積比),吸取細(xì)菌培養(yǎng)液100 μL至400 μL無(wú)菌PBS中,為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)管中分別加入100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液,400 μL無(wú)菌多肽溶液,500 μL BHI肉湯培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)(37 ℃,150 r/min,1 h)。隨后對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋,取1 mL菌液與20 mL的BHI營(yíng)養(yǎng)瓊脂混勻,傾注在培養(yǎng)皿上,等待凝固后倒置37 ℃培養(yǎng)24 h,計(jì)算菌落總數(shù)。抑菌率計(jì)算公式參考公式(2)。

1.2.8 西式干腌火腿粗肽的氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》的方法,稱取50 mg肽樣于水解管中,加入15 mL 6 mol/L鹽酸后,放入-20 ℃冰箱冷凍20 min,重復(fù)抽真空-充入N23次后,在充N2狀態(tài)下擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱內(nèi),水解22 h后,取出,冷卻至室溫后,將水解液過(guò)濾至50 mL容量瓶?jī)?nèi),用少量超純水多次沖洗水解管,水洗液移入同一50 mL容量瓶?jī)?nèi),最后用超純水定容至刻度,振蕩混勻。準(zhǔn)確吸取1.0 mL濾液移入試管中,用平行蒸發(fā)儀在50 ℃加熱環(huán)境下減壓干燥,干燥后殘留物用1～2 mL水溶解,再減壓干燥,最后蒸干。用1.0 mL pH 2.2、0.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解,振蕩混勻,過(guò)0.22 μm濾膜后,轉(zhuǎn)移至液相瓶,用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理,并采用Origin 2022b和SIMCA 14.1軟件進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 西式干腌火腿水分活度與水分含量分析

由圖1所示,不同成熟期的火腿樣品的水分含量和水分活度較為接近。隨著成熟時(shí)期不斷延長(zhǎng),30月火腿樣品的水分含量和水分活度與24月火腿樣品沒(méi)有明顯差異(P>0.05),這是因?yàn)楦呻缁鹜戎械乃衷邴}漬階段迅速降低后,在成熟階段下降逐漸平緩導(dǎo)致的[23-24]。同時(shí),在相同的成熟階段,火腿的BF肌肉水水分活度顯著大于SM肌肉(P<0.05),該結(jié)論與江玉霞[25]、RVIZ-RAMREZ等[26]的結(jié)果一致。分析該差異產(chǎn)生的原因,可能是由于SM表面沒(méi)有皮下脂肪和豬皮的覆蓋,直接暴露在空氣中,導(dǎo)致水分下降速率高于BF。

圖1 不同成熟期干腌火腿的水分含量和水分活度Fig.1 The moisture content and water activity of different ripen periods dry-cured ham

2.2 西式干腌火腿蛋白降解程度分析

由圖2可知,火腿樣品的PI隨著成熟時(shí)期的增加變化的并不明顯(P>0.05),這和HARKOUSS[3, 27]的結(jié)論相似,隨著成熟時(shí)間的增加,火腿的PI值增加逐漸平緩。此外,圖2中數(shù)據(jù)表明,所有時(shí)期的BF的PI值均高于SM(P<0.05)。這可能是因?yàn)锽F肌肉中水分含量高于SM,內(nèi)源蛋白酶的活性相對(duì)較高,從而導(dǎo)致BF肌肉的蛋白降解水平高于SM肌肉[3, 26-27]。

圖2 不同成熟期干腌火腿的蛋白降解指數(shù)Fig.2 The proteolysis index of different ripen periods dry-cured ham

2.3 西式干腌火腿粗肽提取工藝的優(yōu)化與抑菌性比較

2.3.1 不同乙醇添加量與乙醇沉淀時(shí)間對(duì)火腿粗肽抑菌率的影響

圖3-a中的數(shù)據(jù)表明,粗肽提取過(guò)程中,隨著乙醇用量的增加,粗肽的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),圖3-b中乙醇的沉淀時(shí)間的影響亦是如此。分析該結(jié)果產(chǎn)生的原因,可能由于火腿粗肽的提取過(guò)程中,乙醇通過(guò)破壞大分子蛋白的水化膜,或者使蛋白質(zhì)變性,從而降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度,引發(fā)蛋白質(zhì)的聚集沉淀,達(dá)到除去大分子蛋白[28]的效果。但隨著乙醇量和沉淀時(shí)間的逐漸增加,部分被包裹在大蛋白里面的生物活性肽,會(huì)隨著蛋白的脫除而產(chǎn)生損失,因此采取一個(gè)適宜的提取方法有助于抗菌多肽的富集。綜合分析得出,火腿粗肽提取的最佳條件是:2倍乙醇下沉淀10 h后再進(jìn)行后續(xù)分析。

a-不同乙醇添加量;b-不同沉淀時(shí)間

2.3.2 火腿粗肽含量比較

綜合2.2節(jié)蛋白降解程度分析,BF肌肉的PI值總體大于SM肌肉,降解程度更高,提取出來(lái)的肽含量更高,所以選用BF肌肉統(tǒng)一進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不同成熟時(shí)期和提取方法提取出的粗肽液的肽含量對(duì)比如表1所示。鹽酸提取法時(shí),每100 g 30月、24月成熟期火腿分別能提取10.58 g和11.40 g粗肽,而采用磷酸提取法時(shí),上述樣品分別能提取8.82 g和9.06 g粗肽。對(duì)比2個(gè)成熟時(shí)期的火腿,發(fā)現(xiàn)兩者的差異并不顯著;對(duì)比相同成熟時(shí)期的肽粉,鹽酸法粗肽的提取量顯著大于磷酸法。采用鄰苯二甲醛多肽含量測(cè)定得到肽含量分別為78.88%、72.15%、57.75%和60.82%,計(jì)算可得4種多肽的提取率。其中30月鹽酸法提取出的粗肽略高于其他3種。綜合分析得出,鹽酸提取法的多肽提取率顯著大于磷酸提取法,且30月成熟期的火腿多肽提取率顯著大于24月成熟期火腿。

表1 不同成熟時(shí)期與提取方法的火腿粗肽的肽含量對(duì)比Table 1 Comparison of peptide content in dry-cured ham from different ripen period and methods

2.3.3 火腿粗肽抑制大腸桿菌和單增李斯特菌能力比較

圖4列出了不同成熟時(shí)期和不同提取方法條件下西式干腌火腿抑制大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌能力。從圖4可以看出,30月火腿粗肽的抑制能力低于24月火腿粗肽,且磷酸法粗肽的抑菌能力顯著高于鹽酸法(P<0.05)。對(duì)比大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制能力,粗肽對(duì)大腸桿菌的抑制率要遠(yuǎn)高于李斯特菌,這可能是因?yàn)榇竽c桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,多肽能破壞大腸桿菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu),在細(xì)胞表面形成褶皺,破壞細(xì)胞完整性[29];而李斯特菌細(xì)胞壁較厚,不易破壞掉,所以抑制能力相對(duì)較弱[19]。

圖4 不同成熟時(shí)期和方法下火腿粗肽的抑菌能力Fig.4 The antimicrobial activity of ham crude peptide in different ripen period and method

2.4 火腿降解程度與粗肽抑菌性能相關(guān)性分析

2.4.1 火腿粗肽氨基酸組成分析

生物活性肽的功能與氨基酸的組成和排列相關(guān)[30]。在不同時(shí)期和提取方法下火腿粗肽的氨基酸組成如表2所示,磷酸法提取的多肽中谷氨酸的比例明顯大于鹽酸法,同時(shí)丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸在火腿多肽的組成中占比較多,其中丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是疏水性氨基酸,這可能是粗肽具有抑菌性的原因[31]。

表2 不同提取方法影響下不同成熟時(shí)期干腌火腿粗肽的氨基酸組成分析Table 2 The amino acid composition analysis of different ripen periods dry-cured ham crude peptides in different methods

2.4.2 多元線性回歸分析與偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)影響抑菌能力關(guān)鍵因子

為進(jìn)一步分析干腌火腿蛋白降解與火腿粗肽抑菌能力之間的關(guān)系,對(duì)火腿的PI、氨基酸組成與抑菌能力做多元線性回歸模型(multiple linear regression model, MLRM)分析。表3列出了多元線性回歸方程的系數(shù)與P值,模型R2=0.991 78(P<0.01),回歸效果良好。從表3可以看到,PI和組氨酸的回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平(P<0.05),脯氨酸的回歸系數(shù)達(dá)到較顯著水平(0.05

表3 多元線性回歸方程的系數(shù)與相關(guān)性Table 3 Coefficient and correlation of multiple linear regression equations

PLS-DA是一種新的多元統(tǒng)計(jì)方法,能將多個(gè)自變量通過(guò)偏最小二乘回歸降維成幾個(gè)綜合變量,并可以準(zhǔn)確確定影響分組的關(guān)鍵變量[32],差異變量因子(variable importance for the projection, VIP)可以量化自變量與因變量相關(guān)的變量的重要性,其中VIP值>1表示重要變量,VIP<0.5視為不重要變量。PLS加載權(quán)重圖(PLS-loadings)顯示的是自變量X與因變量Y之間的關(guān)系,做出一條連接Y變量和原點(diǎn)的直線,并將其他X和Y變量投影在這條直線上。相互對(duì)立的變量是負(fù)相關(guān)的,與它們附近的變量是正相關(guān)的。圖5和圖6分別為PI值、氨基酸組成和抑菌能力的PLS-VIP圖和PLS-loadings圖。從圖5可以看到,VIP>1的為蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、脯氨酸、精氨酸和PI值。從圖6中可以得到,蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸和PI值與抑菌率正相關(guān)。綜合分析上述結(jié)果,可以推出蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、脯氨酸和PI值是抑菌能力的正相關(guān)重要變量。

圖5 根據(jù)PLS模型計(jì)算出PI值和氨基酸的VIP值Fig.5 PI and VIP of amino acids were calculated from the PLS model

圖6 根據(jù)PLS模型計(jì)算出自變量X(氨基酸和PI值)、 因變量Y(抑菌率)的加載權(quán)重圖Fig.6 The PLS-Loadings of PI and amino acids were calculated from the PLS regression model

進(jìn)一步綜合分析MLRM和PLS-DA結(jié)果,發(fā)現(xiàn)組氨酸、脯氨酸和蛋白降解指數(shù)對(duì)抑菌能力呈促進(jìn)作用,其中組氨酸是堿性氨基酸,大多數(shù)抗菌肽的N端以組氨酸、賴氨酸和精氨酸這類堿性氨基酸作為開(kāi)頭[12, 33];脯氨酸是疏水性氨基酸,抗菌肽中含有大量疏水性和帶正電荷的氨基酸[31],且抗菌肽中富含脯氨酸[12, 19, 34]。

3 結(jié)論

本研究以不同成熟時(shí)期的西式干腌火腿作為研究對(duì)象,分別對(duì)水分含量、水分活度、PI進(jìn)行分析,優(yōu)化得到干腌火腿提取粗肽工藝中乙醇沉淀的條件:乙醇使用量2倍,沉淀時(shí)間10 h。通過(guò)對(duì)比不同時(shí)期和不同提取手段下火腿粗肽的抑菌能力,發(fā)現(xiàn)采用磷酸法提取24月成熟期火腿的粗肽抑菌能力最強(qiáng)。進(jìn)一步結(jié)合多元回歸分析和PLS-DA對(duì)粗肽的氨基酸組分、蛋白降解指數(shù)和抑菌能力進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)組氨酸、脯氨酸和蛋白降解程度對(duì)抑菌呈顯著正相關(guān),這可能跟抗菌肽中N端大多數(shù)為堿性氨基酸,其中含有大量疏水性氨基酸有關(guān)。該結(jié)果為深入分析西式干腌火腿中抗菌肽性能與蛋白降解之間的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。