基于BLI技術(shù)的BamAβ-barrel結(jié)合化合物檢測方法的建立

鄭怡凡?朱小紅?陳明華?盧宇 ?魏元娟? 時文靜? 司書毅?李妍

摘要：目的 以革蘭陰性菌外膜蛋白折疊輔助因子關(guān)鍵蛋白BamA為靶蛋白，基于生物膜干涉（Biolayer interferometry，BLI）技術(shù)建立化合物與BamA蛋白β折疊結(jié)構(gòu)域（BamAβ-barrel）結(jié)合活性的評價方法，為建立靶向BamA蛋白的抗革蘭陰性菌先導(dǎo)物奠定基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用BLI方法檢測BamAβ-barrel與已知的陽性化合物darobactin的結(jié)合活性。原核表達并純化帶有His標(biāo)簽的大腸埃希菌BamAβ-barrel蛋白，使用表面活性劑LDAO對其進行復(fù)性和折疊；使用生物素標(biāo)記折疊和未折疊蛋白，并結(jié)合到超級鏈霉親和素（super streptavidin，SSA）生物傳感器，然后檢測蛋白與不同濃度的darobactin結(jié)合信號的變化，同時做無蛋白或darobactin稀釋液對照；空白對照采用未結(jié)合生物素化的BamAβ-barrel蛋白的傳感器，檢測上述系列稀釋樣品。相應(yīng)信號采用Steady state analysis方式擬合分析，計算平衡常數(shù)（KD）值。結(jié)果 成功獲得高純度的折疊狀態(tài)BamAβ-barrel蛋白，通過BLI技術(shù)檢測到折疊狀態(tài)的BamAβ-barrel與陽性化合物darobactin具有良好結(jié)合活性且呈現(xiàn)濃度依賴性，R2為0.9998，KD值為（2.2E-06±8.0E-08）M。結(jié)論 基于BLI技術(shù)成功建立了折疊狀態(tài)的BamAβ-barrel-化合物結(jié)合活性的評價方法，為后續(xù)BamA蛋白靶向性抗革蘭陰性菌抗生素的發(fā)現(xiàn)建立基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：革蘭陰性菌；Darobactin；BamAβ-barrel；生物膜干涉技術(shù)

中圖分類號：R978.1文獻標(biāo)志碼：A

Establishment of a method to detect the binding activity of compounds and?BamA β-barrel based on BLI assay

Zheng Yifan， Zhu Xiaohong， Chen Minghua， Lu yu， Wei Yuanjuan， Shi Wenjing， Si Shuyi， and Li yan

（Beijing Key Laboratory of Antimicrobial Agents， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050）

Abstract Objective Using the key protein BamA of the Gram-negative bacterial outer membrane protein folding cofactor as the target protein， this study established a method to detect the binding activity between BamAβ-barrel and compounds based on biolayer interferometry （BLI） technology and laid the foundation for screening antibiotics against Gram-negative bacteria targeting the BamA protein. Methods Double subtraction BLI was used to detect the interaction of BamAβ-barrel and the positive compound darobactin. E. coli BamAβ-barrel was expressed and purified and then it was refolded with LDAO in vitro. The refolded BamAβ-barrel or unfolded BamAβ-barrel were labeled with biotin and bound to the Super Streptavidin （SSA） biosensor. The binding of darobactin to BamAβ-barrel was detected based on the changes in binding signals. To identify the diluted samples， a blank control was employed， which involved employing unbound biotinylated BamAβ-barrel protein sensors. This control was performed simultaneously with the protein-free or darobactin dilution control. The signal that corresponded to it was fitted and evaluated using steady-state analysis in order to get the value of the equilibrium constant （KD）. Results High-purity folded BamAβ-barrel was successfully obtained. The folded BamAβ-barrel bound to the sensor showed good binding activity with darobactin with R2=0.9998 and KD=2.2E-06 ± 8.0E-08 M. Conclusion An optimized BLI method for detecting the interaction between compounds and BamAβ-barrel had been established， which could be used for antibiotics against Gram-negative bacteria targeting BamAβ-barrel.

Key words Gram-negative bacteria; Darobaction; BamAβ-barrel; Biolayer interferometry

抗生素耐藥菌導(dǎo)致的感染性疾病是21世紀(jì)人類健康和公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的巨大威脅之一。相對于革蘭陽性（Gram-positive bacteria，G+）菌，革蘭陰性菌（Gram-negative bacteria，G-）耐藥性感染的治療迫切性更為突出。中國CHINET 2005—2022年的臨床監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示G-耐藥菌（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌）的檢出率則仍呈現(xiàn)相當(dāng)程度的增長趨勢[1]。2017年由世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的亟須推動新抗生素研發(fā)的重點病原體清單中，列為1類重點、迫切性最高的3類病原：耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌科細菌均為G-菌[2]。但在藥物研發(fā)方面，相較于G+菌，抗G-菌新藥研發(fā)的進展明顯緩慢。因此新型抗G-菌抗生素的發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。

相較G+菌，G-菌有獨特的非對稱外膜結(jié)構(gòu)（outer membrane，OM），由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和磷脂組成基本結(jié)構(gòu)，外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）鑲嵌其中。LPS組成的厚達8～10 nm的生物學(xué)屏障可保護G-菌免受菌體外環(huán)境中的有害分子的侵害，同時也是造成G-菌固有耐藥的重要因素和內(nèi)毒素形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。外膜受損時，菌細胞會出現(xiàn)外膜穩(wěn)定性下降、抗生素敏感性增加、易被免疫細胞清除等現(xiàn)象，對細菌造成致死性傷害。因此，抑制G-菌外膜生物合成是廣受認(rèn)可的抗G-菌藥物研發(fā)策略[3-4]。OMPs是一大類功能各異的蛋白，鑲嵌于LPS層中，在LPS層的形成、OM的穩(wěn)定以及致病菌毒力方面發(fā)揮著重要作用。OMPs在外膜中主要以反向平行的β-折疊（β-Strands）通過相鄰的氫鍵結(jié)合形成的β桶狀（β-barrel）結(jié)構(gòu)存在，這種結(jié)構(gòu)是OMPs發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。OMPs通常在細胞質(zhì)中合成，借助N端信號肽結(jié)合Sec和Sur伴侶蛋白完成跨膜的轉(zhuǎn)運，然后通過BAM（β-barrel assembly machine）復(fù)合體在外膜中進行折疊組裝[5-7]。G-菌的BAM復(fù)合體通常包括BamA、B、C、D和E 5個蛋白，其中BamA是OMPs折疊和組裝于LPS層的核心場所（圖1）[7]。BamA本身也是β折疊的外膜蛋白，其C端β桶結(jié)構(gòu)域定位于外膜，是OMPs折疊和插入外膜的場所，其涉及到的β桶組裝機制在G-菌中是高度保守的[8-10]。BamA蛋白的N端由5個多肽轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域（POTRA）組成，存在于周質(zhì)空間，與其他BAM復(fù)合體相互作用，完成OMPs的轉(zhuǎn)運且維持BAM復(fù)合體的穩(wěn)定。BamA是G-菌的必需蛋白，其編碼基因的敲除會導(dǎo)致外膜合成的損傷，并最終導(dǎo)致細胞死亡；同時BamA蛋白定位于外膜，其靶向性抗生素可能不需要跨外膜發(fā)揮抗菌活性，能夠克服外膜帶來的固有耐藥，增強其他抗生素的敏感性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個具有抗G-菌活性的先導(dǎo)物具有潛在的BamA抑制活性[11]，證實了BamA蛋白作為新型抗G-菌抗生素研發(fā)靶標(biāo)的潛能，但是目前尚未有以BamA尤其是BamA折疊結(jié)構(gòu)域為靶標(biāo)的抗G-菌抗生素的高通量篩選的報道。

生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技術(shù)是一種無須使用酶、熒光或者放射性元素對待測樣本進行標(biāo)記就能夠?qū)崟r檢測和表征分子相互作用的一項技術(shù)，在BLI分析中獲得的親和常數(shù)（KD值）是抗體、適配體、肽等生物分子質(zhì)量的良好指標(biāo)，近年來被廣泛應(yīng)用于蛋白與小分子結(jié)合、抗體篩選等多個研究領(lǐng)域。本研究通過體外折疊獲得大量BamA活性蛋白，以已經(jīng)報道的具有明確BamA蛋白結(jié)合活性的darobactin為探針，基于BLI技術(shù)建立評價檢測BamA蛋白β桶結(jié)構(gòu)域與化合物結(jié)合活性的方法，為高通量篩選靶向BamA蛋白的抗G-菌抗生素奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

Darobactin由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物） 篩選實驗室制備；pET-15b表達載體由本實驗室保存；蛋白標(biāo)準(zhǔn)Maker（BioRad）；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉（Oxoid）；氨芐西林、4×非變性蛋白上樣緩沖液、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（索萊寶）； HisTrapTM 層析柱、HiTrap Q HP陰離子交換柱（GE Healthcare）；5×蛋白上樣緩沖液（碧云天）；考馬斯亮藍染色液（普利萊）；超濾濃縮管（Millipore）；PBS磷酸鹽緩沖液（中杉金橋）；Tween-20（Sigma）；生物素化標(biāo)記試劑 NHS-LC-LC-Biotin、Zeba desalting spin columns脫鹽柱（Thermo）；96孔板（Corning Costar）；SSA傳感器（ForteBio）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 緩沖液

緩沖液A1：8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris，

300 mmol/L NaCl，pH 8.0；緩沖液A2：20 mmol/L Tris，LDAO 0.1%，pH 8.0；洗脫液B1：8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 8.0；洗脫液B2：20 mmol/L Tris，LDAO 0.1%，500 mmol/L NaCl，pH 8.0；復(fù)性緩沖液：

50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L精氨酸，0.5% LDAO，10 mmol/L DTT，pH 8.0。

1.1.3 儀器

超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)）；恒溫搖床（北京沃德創(chuàng)技貿(mào)有限公司）；多功能微孔板檢測儀（PerkinElmer）；高速冷凍離心機（Sigma）；高壓細胞破碎儀（Constant Systems）；加熱制冷型金屬浴（Thermo）；蛋白質(zhì)電泳儀、AKTA層析系統(tǒng)（GE Healthcare）；微量分光光度計（Life Real）；分子相互作用檢測儀器（Octet Red96）。

1.2 方法

1.2.1 BamAβ-barrel蛋白的原核表達

全基因合成大腸埃希菌（E.coli）BamA蛋白β-桶折疊結(jié)構(gòu)域（421aa-810aa）編碼基因序列（Gene ID：944870），在其5'端和3'端分別插入NdeI和Xhol酶切位點。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-15b-bamAβ-barrel（N端帶有6×His標(biāo)簽），通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌E. coli BL21感受態(tài)細胞，通過氨芐西林（Amp）抗性篩選獲得陽性克隆。陽性克隆接種至8 mL含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃以180 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（A600=0.6），IPTG（0.5、1、1.5和2 mmol/L）誘導(dǎo)表達（110 r/min，18 ℃，12 h）。蛋白表達量通過10% SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色進行檢測。

1.2.2 BamAβ-barrel蛋白的純化

終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG加入到2 L培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，18 ℃培養(yǎng)12 h。5000 r/min離心20 min收集菌體，而后重懸于緩沖液A1。反復(fù)3次高壓破碎（38 kpsi）后收集破碎液，5000 r/min離心（4 ℃）30 min以除去細胞碎片。上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，在4 ℃環(huán)境下加載到1 mL HisTrapTM親和層析色譜柱上，使用AKTA系統(tǒng)對蛋白進行純化：五倍柱體積的緩沖液A1平衡色譜柱，然后使用洗脫液B1進行梯度洗脫（10%、40%、60%和100%），對280 nm處的UV峰值進行監(jiān)測并收集蛋白，10% SDS-PAGE檢測蛋白純度。使用10kD超濾離心管離心（4 ℃，5000 r/min）濃縮蛋白，微量分光光度計定量后調(diào)整蛋白濃度為1 mg/mL，-80 ℃冷凍保存。

1.2.3 BamAβ-barrel蛋白的復(fù)性折疊與純化

蛋白的復(fù)性和折疊按照Hartmann等[11]的描述進行。使用復(fù)性緩沖液稀釋1 mg/mL的蛋白儲液至

0.1 mg/mL，4 ℃緩慢攪拌12 h。然后使用10 kD的透析袋在20 mmol/L Tris （pH 8.0）緩沖液中透析

12 h，全程保持4 ℃低溫。透析后的蛋白溶液加載到HiTrap Q HP離子交換柱上，使用5倍體積的緩沖液A2平衡后，以洗脫液B2進行梯度洗脫（15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%和100%），對280 nm處的UV峰值進行監(jiān)測，收集洗脫液B2含量為45%～85%的洗脫液。

1.2.4 BamAβ-barrel蛋白的測定（Semi-SDS-PAGE）

蛋白樣品加入4×蛋白非變性緩沖液（無SDS），混合均勻后直接進行10% SDS-PAGE電泳。電泳全程80V恒壓，冰浴。

1.2.5 生物膜干涉技術(shù)檢測darobactin與BamAβ-barrel蛋白間相互作用

參照說明書對BamAβ-barrel蛋白（Folded BamAβ-barrel）和僅得到復(fù)性但仍處于非折疊狀態(tài)的BamAβ-barrel蛋白（Unfolded BamAβ-barrel）進行生物素化，然后使用PBST緩沖液稀釋至200 μg/mL。4根SSA傳感器分別置于傳感器支架第一、二列，每列兩根，第一列結(jié)合生物素化蛋白，第二列為空白對照。使用PBST-BSA（含0.2% BSA的PBST）緩沖液將darobactin自2 μg/mL起梯度稀釋至0.125 μg/mL，保持每孔DMSO濃度均為1%。在96孔板中按照表1所示加入樣品，A行為待測樣品，B行為空白對照，將樣品孔替換為等量的Reference緩沖液，其余各孔不變，每孔總體積均為200 μL。在Data Acquisition 9.0軟件中按照表2所示的檢測條件進行設(shè)置，檢測不同樣品孔與傳感器的結(jié)合。使用Data analysis 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。選擇“雙參比”模式，以對應(yīng)的未結(jié)合蛋白的傳感器及Reference緩沖液作為對照進行扣除，以穩(wěn)態(tài)分析（Steady state analysis）方式擬合，計算響應(yīng)值與KD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BamAβ-barrel原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pET-15b-bamAβ-barrel轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21細胞并涂布于Amp抗性LB平板，隨機挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示出預(yù)期為1185 bp的目的基因和5.7 kbp的載體片段（圖2）。對同一陽性菌落bamAβ-barrel表達片段測序，比對分析顯示，重組質(zhì)?；蛐蛄信c預(yù)期構(gòu)建序列相似率達100%，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-15b-bamAβ-barrel。

2.2 BamAβ-barrel原核表達

Amp抗性篩選得到的含有重組質(zhì)粒的菌液在0.5、1、1.5和2 mmol/L的IPTG濃度下低溫誘導(dǎo)蛋白表達，經(jīng)由10% SDS-PAGE進行檢測，結(jié)果如圖3A所示，與空載體菌相比，在37～50 kDa之間，IPTG誘導(dǎo)的全菌和包涵體中均存在與目的蛋白分子量

（43 kDa）相符的明顯條帶。IPTG濃度對蛋白表達量無明顯影響。圖3B顯示，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌和包涵體中在37～50 kDa出現(xiàn)明顯條帶，破碎后上清和培養(yǎng)基中無明顯條帶，與文獻報道一致[11]。

2.3 BamAβ-barrel蛋白的純化

由于BamAβ-barrel蛋白大量表達后以不溶性包涵體的形式存在，因此使用含有高濃度變性劑（8 mol/L尿素）的緩沖液對蛋白進行處理[12]，然后通過親和層析法進行純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第54 min左右，洗脫液B1含量為10%～40%時，UV280 nm處出現(xiàn)峰值（圖4A）。對流穿液和洗脫液B1含量為10%、40%和60%時的洗脫液進行10% SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示在43 kDa處出現(xiàn)單一條帶（圖4B）。

2.4 BamAβ-barrel的復(fù)性折疊與分離純化

純化后獲得的蛋白在含有高濃度變性劑（8 mol/L尿素）的緩沖液中以非折疊狀態(tài)的形式存在，并不具備生物活性，因此需要對蛋白進行復(fù)性，進一步使之重新折疊。蛋白折疊后立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有折疊結(jié)構(gòu)的蛋白未經(jīng)變性處理時在電泳中的移動速率比線性結(jié)構(gòu)的非折疊蛋白更為迅速，因此可以借此區(qū)分折疊和非折疊蛋白[13]。在含有0.5%表面活性劑LDAO的復(fù)性緩沖液中透析12 h后，通過10% Semi-SDS-PAGE檢測蛋白的折疊狀態(tài)，結(jié)果如圖5A所示，僅經(jīng)過復(fù)性緩沖液稀釋未經(jīng)透析的蛋白在43 kDa出現(xiàn)單一條帶，仍處于非折疊狀態(tài)，而經(jīng)過透析處理后的樣品在43 kDa與約30 kDa處呈現(xiàn)兩個條帶，這與文獻報道相符，證明獲得了折疊狀態(tài)的蛋白[11]。

為了去除未折疊的BamAβ-barrel蛋白，應(yīng)用離子交換柱對折疊后的蛋白樣品進行純化。發(fā)現(xiàn)在第70 min左右，洗脫液B2含量為55%時，UV280nm處出現(xiàn)峰值（圖5B）。收集洗脫液B2含量為45%～85%時的流出液進行10% Semi-SDS-PAGE，結(jié)果顯示濃度為55%時洗脫下來的蛋白為復(fù)性折疊的蛋白，在30 kDa附近呈現(xiàn)單一條帶，具有較高的純度（圖5C）。因為后續(xù)BLI檢測方法中使用的緩沖液體系有所改變，因此對該條件（PBST+0.2% BSA，pH 6.0）下蛋白的穩(wěn)定性進行了進一步檢測，結(jié)果依舊僅在30 kDa附近發(fā)現(xiàn)單一蛋白條帶，說明該緩沖液對折疊蛋白未產(chǎn)生影響（圖5D）。

2.5 生物膜干涉技術(shù)檢測蛋白與小分子相互作用

Darobactin是已知的與折疊狀態(tài)的BamAβ-barrel特異性結(jié)合的化合物。為了驗證BLI技術(shù)是否能應(yīng)用于檢測化合物與BamAβ-barrel的結(jié)合，本研究以darobactin為陽性化合物對該方法進行了評價[14]。同時以未折疊BamAβ-barrel蛋白（Unfolded BamAβ-barrel）為對照。為了排除darobactin與傳感器的結(jié)合造成的假陰性，首先檢測了darobactin與空白傳感器的結(jié)合，結(jié)果如圖6A所示，darobactin與空白傳感器具有明顯的非特異性結(jié)合。因此在后續(xù)檢測中使用封閉劑Tween 20與BSA對緩沖液體系進行優(yōu)化，得到能夠較好消除darobactin與空白傳感器非特異性結(jié)合影響的緩沖液體系（PBST+0.2% BSA，pH 6.0）（圖6B）。如圖6C所示， darobactin能與Folded BamAβ-barrel結(jié)合，并且隨著化合物濃度增加，響應(yīng)值明顯增強，具有濃度依賴性，R2=0.9998，KD=2.2E-06±8.0E-08M；同時，并未檢測到darobactin與Unfolded BamA β-barrel蛋白存在明顯的相互作用（圖6D）。

3 討論

OM是G-菌特有的結(jié)構(gòu)，外膜蛋白是近年來抗G-菌藥物研發(fā)中受到廣泛關(guān)注的潛在靶標(biāo)，主要集中于LPS的合成和轉(zhuǎn)運過程[15-17]。隨著OMPs在外膜中的重要功能和結(jié)構(gòu)的解析，OMPs靶向性抗生素的發(fā)現(xiàn)也受到越來越多的關(guān)注。外膜蛋白LptD是LPS在外膜組裝的場所，是必需蛋白。主蛋白OmpA在外膜穩(wěn)定性中起著重要的作用，同時也是細菌毒力因子，介導(dǎo)生物被膜的形成。OMPs中的孔道蛋白OmpF、OmpC、phoE和Maltoporin等是營養(yǎng)物質(zhì)和部分抗生素進入菌體內(nèi)的通道。此外，有些OMPs還具有蛋白酶、黏附因子和外排泵等功能，是重要的致病性病原菌的毒力因子和耐藥因素。OMPs的缺失會導(dǎo)致LPS層的缺損和菌體死亡；毒力因子下調(diào)，病原菌致病性降低。因此，靶向OMPs生物合成的抗生素具有獨特的抗菌優(yōu)勢。首先，抗生素本身具有抑菌、殺菌和降低病原菌毒力的作用；其次，此類抗生素導(dǎo)致的外膜損傷能夠增加跨膜困難的抗生素對GNB的抗菌活性，從而發(fā)揮增敏作用，克服GNB固有耐藥。因此，OMPs生物合成的調(diào)控因子是目前抗GNB藥物研發(fā)的熱點靶標(biāo)之一。

作為OMPs折疊輔助因子的BAM復(fù)合體，其核心組成部分BamA蛋白既是外膜蛋白折疊的場所，在外膜的組裝和穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，是細菌的必需蛋白，同時作為外膜蛋白，其靶向性抗生素?zé)o須跨膜即可發(fā)揮抗菌活性。因此BamA蛋白在抗G-菌抗生素的研發(fā)中可能具有良好的成靶性。目前已經(jīng)報道多種化合物的抗G-菌活性與BamA抑制相關(guān)[18]。JB-95是一種新型β發(fā)卡環(huán)肽，可與包括BamA在內(nèi)的多種外膜蛋白結(jié)合，選擇性地破壞大腸埃希菌外膜[19]；單克隆抗體MAB1與細胞外BamA表位直接結(jié)合，抑制其β桶折疊活性，誘導(dǎo)周質(zhì)應(yīng)激，破壞外膜完整性并殺死細菌[20]；由變形桿菌分泌的凝集素樣細菌素（LlpAs）可選擇性識別BamA蛋白結(jié)合到靶細胞表面，誘發(fā)BAM復(fù)合體機制受損，實現(xiàn)對革蘭陰性菌的殺傷作用[21]；分離自線蟲共生菌的天然環(huán)肽darobactin可以選擇性與BamA折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制其活性，抑制外膜形成，并且在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的抗G-菌活性，是目前最為明確且活性最好的BamA靶向性抑制劑[22]。

Darobactin是目前研究得最為深入的BamA抑制劑，其與BamA蛋白的結(jié)合模式已經(jīng)得到較為全面的解析。BamA蛋白在細胞質(zhì)中合成后以線性的結(jié)構(gòu)存在，然后轉(zhuǎn)運到外膜進行C端的β-折疊與外膜組裝。與多數(shù)非常穩(wěn)定的β折疊蛋白不同，折疊狀態(tài)BamA蛋白的β桶狀結(jié)構(gòu)域存在一個不穩(wěn)定且呈現(xiàn)開放狀態(tài)的“側(cè)門”，以利于OMPs的折疊和在外膜中的組裝。Darobactin通過模仿β-鏈的結(jié)合方式，以高親和力與BamA側(cè)門結(jié)合，穩(wěn)定BamA的側(cè)向封閉構(gòu)象阻止其打開，抑制同源新生外膜蛋白與BamA的結(jié)合，進而抑制外膜形成，發(fā)揮抗菌活性[14，23]。在本研究中，darobactin與折疊的BamA蛋白具有明顯結(jié)合，這再次確證了darobactin能夠與折疊狀態(tài)的BamA結(jié)合發(fā)揮其抗菌活性這一論點。此外，darobactin與未折疊的BamA蛋白之間不存在明顯的相互作用，這可能與darobactin和BamA的結(jié)合特性相關(guān)。darobactin自身的反向平行的β折疊構(gòu)象與BamA的Gly424-Ile430配對，形成主鏈氫鍵以發(fā)揮競爭性抑制劑作用[24]。線性的BamA蛋白不存在折疊構(gòu)象；同時，與未折疊的BamA相比，形成桶狀折疊結(jié)構(gòu)域的BamA蛋白的氨基酸之間（比如Gly424和Ile430）在空間距離上發(fā)生了很大的變化，這些都會造成其與darobactin親和力的改變。這一結(jié)果說明本研究建立的檢測方法較好地還原了天然狀態(tài)下BamA蛋白與darobactin的結(jié)合方式，能夠應(yīng)用于篩選靶向折疊BamA蛋白的特異性抑制劑。

目前已知的BamA靶向性抗G-菌先導(dǎo)物大部分都是在機制研究中偶然發(fā)現(xiàn)的。Li等[25]以酵母雙雜交技術(shù)建立BamA/BamD蛋白相互作用模型，高通量篩選相互作用阻斷劑，發(fā)現(xiàn)了IMB-H4能夠與未折疊BamA結(jié)合，阻斷其與BamD蛋白結(jié)合活性，并具有抗G-菌活性，這可能與影響B(tài)amA蛋白自身的折疊有關(guān)[26]。相對于未折疊的BamA蛋白，位于外膜的折疊狀態(tài)的BamA蛋白可能具有更好的成靶性，但是目前尚未有以折疊狀態(tài)的BamA蛋白為靶向的高通量篩選的報道。本研究是首次以BLI技術(shù)建立具有折疊BamA蛋白結(jié)合活性的化合物的評價方法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過生物素化的折疊BamAβ-barrel蛋白可以很好地與傳感器結(jié)合，同時以darobactin為陽性化合物也能檢測到其與折疊BamAβ-barrel蛋白的結(jié)合。這證明該BLI檢測方法能夠應(yīng)用于BamAβ-barrel結(jié)合化合物的結(jié)合活性檢測，這也為后續(xù)高通量篩選靶向BamA蛋白的抗革蘭陰性菌抗生素的發(fā)現(xiàn)奠定了的基礎(chǔ)。

參 考 文 獻

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作者簡介：鄭怡凡，女，生于1999年，在讀碩士研究生，主要研究方向為抗感染藥物的發(fā)現(xiàn)和作用機理研究，E-mail： zhengyifan@imb.pumc.edu.cn

*通信作者，E-mail： liyan@imb.pumc.edu.cn