微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性發(fā)掘方法

方岫琴 王文璟 李華東 張曉婷 朱天驕 車茜 李德海 張國建

摘要：微生物次級代謝產(chǎn)物是微生物在生長過程中產(chǎn)生的非必需性代謝產(chǎn)物，其往往具有獨特的生物活性。隨著對微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性研究的不斷深入開展，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)在實驗室的常規(guī)培養(yǎng)條件下微生物的代謝潛能不能完全被激發(fā)，從中可獲得的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型遠遠少于其代謝潛能所決定的數(shù)量。近年來，隨著基因組技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)特別是合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，研究人員開發(fā)了如OSMAC、表觀遺傳、異源表達等多種方法，從多個角度多層次地發(fā)掘次級代謝產(chǎn)物多樣性。這些方法有效激活潛在的生物合成基因簇、提高了微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性，加之與高通量篩選方法聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著改善了微生物活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)效率。本文綜述了微生物次級代謝潛能的激活以及代謝產(chǎn)物高效篩選的方法和技術(shù)，為提高微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性發(fā)掘，加快先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供參考。

關(guān)鍵詞：微生物次級代謝產(chǎn)物；沉默基因簇；代謝潛能；激活；結(jié)構(gòu)多樣性

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Methods for exploring the chemical diversity of microbial secondary metabolites

Fang Xiuqin1， Wang Wenjing1， Li Huadong1， Zhang Xiaoting1， Zhu Tianjiao1， Che Qian1，?Li Dehai1， 2， and Zhang Guojian1， 2， 3

（1 Key Laboratory of Marine Drugs， Ministry of Education， School of Medicine and Pharmacy， Ocean University of China， Qingdao 266003; 2 Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology， Qingdao 266237; 3 Marine Biomedical Research Institute of Qingdao， Qingdao 266100）

Abstract Microbial secondary metabolites are non-essential metabolites created by microorganisms throughout the development process， but they frequently exhibit unique biological activities. As research on microbial natural products went on， researchers gradually found that the metabolic capacity of microorganisms could not be completely activated under normal laboratory growth conditions， which led to the fact that the skeletal diversities of natural products obtained from some microbial strains were significantly less than the amount indicated by their potential metabolic capacity. With recent years' development in genomic technology and molecular biology technology， especially synthetic biology-related technologies， several advanced approaches， including OSMAC， epigenetic expression and heterologous expression， have been applied to investigate the diversity of secondary metabolites at the multi-angle and multi-level. Combined with proper screening techniques， those above methods showed increased efficiency in activating silent biosynthetic gene clusters and obtaining diversified secondary metabolites from microbial strains. This article reviewed practical methodologies and strategies for tapping up microbial metabolic potential and screening unique metabolites to provide references for efficiently exploring the variety of microbial natural products and speeding up the identification of drug lead compounds.

Key words? Microbial secondary metabolites; Silent gene clusters; Metabolic potential; Activation; Structural diversity

微生物來源廣泛、成本低廉、基因組較小、次級代謝產(chǎn)物豐富，是重要的藥用資源。微生物次級代謝產(chǎn)物是微生物在特定條件下以初級代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)，經(jīng)過不同生源途徑合成的生長非必需的代謝產(chǎn)物，其具有結(jié)構(gòu)多樣復(fù)雜、生物活性廣泛等特點[1]。自1928年Fleming從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，微生物次級代謝產(chǎn)物研究一直作為藥物研發(fā)的熱點領(lǐng)域為人們所關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，在微生物體內(nèi)存在著在常規(guī)培養(yǎng)中未激活的次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑，而與之相關(guān)的系列基因則稱為沉默基因簇（silent biosyntheic gene clusters）[2-3]。例如，通過對青霉菌Penicillium基因組測序分析結(jié)果表明，從24個青霉菌的基因組中發(fā)現(xiàn)的1317個生物合成基因簇中有61%（798個）編碼PKS、NRPS或PKS-NRPS雜交途徑，其中僅有16%的PKS和NRPS基因簇可以確定生產(chǎn)某類天然產(chǎn)物[4]；同樣，關(guān)于維吉芽胞桿菌Virgibacillus的基因組測序分析結(jié)果表明，在已發(fā)現(xiàn)的215個合成基因簇中，僅有少數(shù)被發(fā)現(xiàn)與次級代謝產(chǎn)物相關(guān)，其中約79%的合成基因簇均為未知基因簇[5]。上述實例說明在實驗室常規(guī)培養(yǎng)條件下，微生物體內(nèi)存在著大量處于沉默的基因簇尚未激活。這些沉默的基因資源中蘊含著巨大的次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)潛能，成為微生物藥用資源亟待開發(fā)的“暗物質(zhì)”。因此，如何激活沉默基因簇，點亮這些“暗物質(zhì)”并獲得新穎的活性先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)，是進一步探尋微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的重要的途徑。

圍繞著“如何激活沉默基因簇”這一問題，世界各國的微生物學(xué)家、化學(xué)家近年來發(fā)展了諸多新穎的技術(shù)和策略，如：OSMAC（one strain many compounds）策略、共培養(yǎng)技術(shù)、表觀遺傳修飾、啟動子工程、核糖體工程、合成生物學(xué)技術(shù)等。上述方法的應(yīng)用，進一步揭示了微生物次級代謝產(chǎn)物的多樣性。同時，這些技術(shù)和策略結(jié)合下游的分子網(wǎng)絡(luò)、高通量篩選等技術(shù)，大大提高了微生物次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)效率。如圖1所示，本文將從培養(yǎng)條件的優(yōu)化、基因轉(zhuǎn)錄與表達的調(diào)控、合成生物學(xué)的應(yīng)用和篩選方法的優(yōu)化4個角度概括微生物次級代謝產(chǎn)物開發(fā)技術(shù)的進展及其應(yīng)用，旨在為未來的微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性發(fā)掘提供思路。

1 培養(yǎng)條件的改變

1.1 OSMAC策略

1999年，Zeeck等[6]提出了OSMAC策略，該策略通過系統(tǒng)地改變培養(yǎng)條件（如：培養(yǎng)基成分、溫度、通氣量等）來發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物的多樣性。OSMAC策略可能激活微生物體內(nèi)的沉默基因簇表達，進而產(chǎn)生更多樣的次級代謝產(chǎn)物，該方法操作簡便，效果顯著，已被廣泛應(yīng)用。

Chen等[7]通過向培養(yǎng)基中添加3% NaBr或3% KI從紅樹林真菌Phomopsis sp. QYM-13中分離得到12個新的細胞松弛素phomopchalasins D-O （1-3，5-12，14），包括1種溴化和2種碘化的細胞松弛素。其中，溴化細胞松弛素對人癌細胞系MDAMB-435具有選擇性細胞毒性（IC50=7.4 μmol/L）。

Lei等[8]通過向大米培養(yǎng)基中添加3%人工海鹽，從海綿來源真菌異角疫霉Pestaltiopsis heterocornis XWS03F09中分離出9個新化合物，包括8個新的聚酮衍生物heterocornols Q-X和1個新的神經(jīng)酰胺ceramide，其中heterocornols W-X可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生，其活性與抗炎藥物地塞米松相當。

通過OSMAC策略發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的例子多有報道，但其背后的調(diào)控機制仍不甚明了。隨著相關(guān)菌株生理生化功能的不斷揭示，OSMAC策略對沉默基因表達調(diào)控的影響機制會越來越清晰，這將為培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供更為清晰的指導(dǎo)。

1.2 共培養(yǎng)技術(shù)

近幾十年來，研究者們逐漸意識到一些生化過程需要多種微生物的共同參與才能進行，并且不同菌株在同一生境中相互作用、相互影響，對復(fù)雜次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有促進作用。在此基礎(chǔ)上，共培養(yǎng)技術(shù)（coculture）應(yīng)運而生。共培養(yǎng)技術(shù)是指在相對封閉的環(huán)境中培養(yǎng)2種或2種以上微生物，通過對其原始生存環(huán)境的模擬，達到改變相應(yīng)微生物次級代謝產(chǎn)物的效果[9-11]。共培養(yǎng)技術(shù)可以看作OSMAC策略的延伸，該技術(shù)已然成為了發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的有效途徑之一。例如，Thissera等[12]將小麥植物根系相關(guān)細菌Pantoea aggolomerans和棗棕櫚葉衍生真菌Penicillium citrinum（PC）使用PDA培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了2個新的普利西汀衍生物pulicatin H、I和6個已知化合物，其中pulicatin H對PC具有較強的抗菌活性。Li等[13]運用多代謝物交叉喂養(yǎng)（multi-metabolite cross-feeding，MMCF）的方法，通過對氨基酸合成代謝和能量代謝進行調(diào)控，成功構(gòu)建了穩(wěn)定的微生物共培養(yǎng)體系，并且在體系中引入代謝物響應(yīng)性的生物傳感器，進一步提高了體系的可調(diào)節(jié)性。將該體系運用于3菌株的共培養(yǎng)體系中，最終實現(xiàn)了水飛薊賓（silybin）和異水飛薊賓（isosilybin）的合成。

雖然共培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是微生物生態(tài)關(guān)系復(fù)雜，且易受環(huán)境影響，故深入研究菌株之間的相互作用機制，對進一步拓展共培養(yǎng)技術(shù)在次級代謝產(chǎn)物挖掘中具有重要意義。目前，楊志超等[14]總結(jié)了群體感應(yīng)現(xiàn)象對乳酸菌產(chǎn)細菌素的調(diào)控機制，并解析了不同因素對其產(chǎn)細菌素的促進機制。李洪濤等[15]總結(jié)了微生物共培養(yǎng)互作機制研究的方法及進展。徐德陽等[9]也對微生物共培養(yǎng)中存在的協(xié)同代謝作用、誘導(dǎo)作用和基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象進行了分析與總結(jié)。然而，微生物間的相互作用機制十分復(fù)雜，尚未完全解析，仍待進一步研究闡明。

1.3 表觀遺傳修飾劑的添加

自2007年首次報道微生物次級代謝的調(diào)控與表觀遺傳修飾具有相關(guān)性開始，表觀遺傳修飾方法成為了進一步發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的新方法[16]。表觀遺傳修飾是指在DNA的序列不發(fā)生改變的條件下，基因的表達發(fā)生穩(wěn)定且可遺傳變化的現(xiàn)象。其主要作用機制包含2個方面：①針對DNA的甲基化修飾和各種組蛋白的修飾；②非編碼的RNA分子參與影響翻譯后修飾過程[17-21]。其中，組蛋白的修飾部分因操作簡便、對菌株次級代謝行為影響明顯，在實驗室研究中具有廣泛的應(yīng)用。向培養(yǎng)基中添加表觀遺傳化學(xué)調(diào)控劑是該方法最直接的應(yīng)用。用于添加的表觀遺傳化學(xué)修飾抑制劑主要包括2種：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNA methyltransferase inhibitors，DNMTi）和組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACi）。

朱靜軒等[22]通過向培養(yǎng)基中添加化學(xué)表觀遺傳調(diào)控劑——組蛋白去乙?；种苿–646）對海洋來源雜色曲霉（Aspergillus versicolo）進行化學(xué)表觀遺傳調(diào)控，最終得到3個新化合物——彎孢霉菌素（curvularin）、環(huán)形（L-色氨酸-L-苯丙氨酸）[cyclo-（L-Trp-L-Phe）]和二苯二酚（diorcinol）；Wu等[23-24]通過向培養(yǎng)基中添加表觀遺傳化學(xué)調(diào)控劑—組蛋白去乙?；敢种苿┬炼岜桨樊惲u肟酸（SAHA），使1株海兔來源的土曲霉（Aspergillus terreus）RA2905的代謝譜發(fā)生變化，最終分離得到兩個新的阿斯呋喃酮（asperfuranone）對映體及兩個新的阿斯呋喃酮化合物asperfuranone A和B，這是首次報道的從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)含有芐基呋喃酮和芐基吡喃酮骨架的結(jié)構(gòu)。

2 基因轉(zhuǎn)錄和表達的調(diào)控

通過改變微生物的培養(yǎng)狀態(tài)激活沉默基因簇的表達，其最適培養(yǎng)條件的確定需要重復(fù)大量的篩選工作，且受菌株內(nèi)在轉(zhuǎn)錄過程變化的影響，其不同培養(yǎng)批次的代謝產(chǎn)物圖譜依然存在重現(xiàn)性差的問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷更新，從基因?qū)用鎸赀M行定向改造越來越受到重視，尤其是轉(zhuǎn)錄調(diào)控、啟動子工程和核糖體工程等方法的應(yīng)用，可以更為精準地調(diào)控代謝過程，獲得多樣化的次級代謝產(chǎn)物（圖2）。

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

直接添加表觀遺傳化學(xué)調(diào)控劑的方法無須了解菌株的遺傳背景，應(yīng)用簡便，但該方法缺乏深入的機制解析，使用存在不確定性，且目前能選擇的表觀遺傳修飾劑種類較少[25-26]。因此，直接從基因或蛋白層面進行定向改造可以更好地提高微生物次級代謝產(chǎn)物的多樣性。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT，如保守調(diào)控因子laeA、llm1等），與組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）功能的解析在分子酶學(xué)層面為實現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控提供了可能。

早在2004年，Keller等[27]首次報道了laeA基因作為絲狀真菌次級代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)多種次級代謝產(chǎn)物基因簇的表達，從而影響菌株的次級代謝圖譜。近年來，本課題組還應(yīng)用過表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子laeA的方法對真菌次級代謝產(chǎn)物進行發(fā)掘，并獲得了許多結(jié)構(gòu)多樣的活性代謝產(chǎn)物。2019年，本課題組通過高表達1株雙齒青霉菌（Penicillium dipodomyis） YJ-11自身的laeA基因，豐富了其中sorbicillinoid類化合物的代謝圖譜，從中分離得到了2個該類新化合物10，11-dihydrobislongiquinolide和10，11，16，17-tetrahydrobislongiquinolide[28]；2020年，通過對laeA基因的過表達，從1株溴化青霉（Penicillium brocae） HDN-12-143中分離得到1個新的煙熏氯醇（fumigatin chlorohydrin）和1個新的異煙熏氯醇（iso-fumigatin chlorohydrin），這兩個化合物均對HL-60癌細胞系均表現(xiàn)出一定的細胞毒作用[29]；2022年，同時對laeA基因和生物合成剪切酶MpaB基因進行過表達，從1株海洋來源鏈格孢菌（Alternaria alternata） JJY-32分離得到4種新的ACTG-毒素-硫代萜類三環(huán)交鏈芳烴O-R（meroterpenoids tricycloalternarenes O-R），其對TLR4轉(zhuǎn)染的巨噬細胞（RAW264.7）均表現(xiàn)出較強的抗炎活性[30]。

llm1基因與laeA基因具有類似的結(jié)構(gòu)域，故調(diào)控llm1基因表達量也可能促進微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的產(chǎn)生。王云勝[31]構(gòu)建了llm1基因過表達的冠突散囊菌（Eurotium cristatum）突變體，在PDB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，最終通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)llm1過表達的突變體相比于野生型產(chǎn)生了3個新的色譜峰，并且通過antiSMASH數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明過表達llm1基因能激活冠突散囊菌次級代謝基因簇的表達。

2.2 啟動子工程

對于微生物來說，影響基因表達水平的最重要因素是轉(zhuǎn)錄水平，基因的啟動子序列在其中發(fā)揮著重要作用[32]。目前，啟動子工程采用了許多策略，如：內(nèi)源性啟動子的改造和替換、啟動子文庫的篩選和構(gòu)建等。

啟動子改造和替換是激活基因簇的有力手段，前者直接對內(nèi)源啟動子進行突變改造或用特定的轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合來改變啟動子強度[33]；后者將原有啟動子替換，徹底改變受控基因的表達譜，在轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)對關(guān)鍵基因的精準控制。

Wu等[34]在枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中將啟動子PgamA中轉(zhuǎn)錄因子GamR的結(jié)合位點gamO2插入到Pveg啟動子序列中，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（transcription factor binding site，TFBS）的優(yōu)化，成功構(gòu)建了可以響應(yīng)胞內(nèi)6-磷酸氨基葡萄糖（glucosamine-6-phosphate，GlcN6P）的合成啟動子，成功激活了GlcN6P的沉默生物合成基因簇。Wang等[35]將包含兩個廣泛應(yīng)用的人工啟動子kasOp*的片段插入TiaP2和聚酮骨架的編碼基因，首次在鏈霉菌Streptomycetaceae宿主中成功異源表達了非達霉素（fidaxomicin）生物合成基因簇，獲得了6個苷元，其中4個為新化合物，補充和拓展了非達霉素苷元的合成途徑。

啟動子文庫的篩選和構(gòu)建也是啟動子工程常用的方法。但是傳統(tǒng)啟動子文庫的構(gòu)建耗時費力，且難以獲得理想的啟動子。因此，利用生物信息學(xué)和計算機科學(xué)工具，預(yù)測、設(shè)計、優(yōu)選和改造啟動子[36]等方法正受到越來越多的關(guān)注和研究。

非保守區(qū)隨機突變（non conservative random mutation，NCR）可用于快速生成不同強度的大規(guī)模啟動子庫，并被廣泛應(yīng)用于代謝途徑的通量優(yōu)化。Wei等[37]設(shè)計了一個基于谷氨酰胺-10（NNTANANT）和-35（NNGNCN）共識區(qū)、保守RBS（AAAGGA）元件和60個隨機核苷酸的啟動子庫，其所獲得的啟動子可以有效地調(diào)控基因的表達，并在很大范圍內(nèi)表現(xiàn)出不同的強度。在此基礎(chǔ)上，該團隊還開發(fā)了一種全新的基于啟動子庫的多模塊組合（promoter library-based module combination，PLMC）技術(shù)，以有效地優(yōu)化谷氨酰胺中基因的表達。

啟動子工程也常與其他技術(shù)聯(lián)用，以提高啟動子工程的效率。Wei等[38]建立了一種基于流式細胞術(shù)、在單細胞分辨率下檢測超折疊綠色熒光蛋白的絲狀真菌啟動子的定量評估方法，其中所鑒定的活性最強的啟動子PzipA和PsltA分別比常用的組成型啟動子PgpdA高2.9倍和1.5倍，并應(yīng)用這兩個啟動子激活原生宿主煙曲霉（Aspergillus fumigatus）及異源宿主構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中的沉默非核糖體肽合成酶基因Afpes1，并最終在其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種新的環(huán)狀四肽衍生物，為真菌中的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)提供了一種創(chuàng)新策略。

人工智能在啟動子工程方面展現(xiàn)出良好前景，Lafleur等[39]通過大規(guī)模并行分析，將生物物理學(xué)和機器學(xué)習(xí)相結(jié)合，開發(fā)出一個可預(yù)測任何σ70啟動子序列的特異性轉(zhuǎn)錄起始率的346參數(shù)模型。同時，利用機器學(xué)習(xí)進行人工啟動子的設(shè)計、創(chuàng)制和優(yōu)化的研究已經(jīng)蓬勃興起，并取得了一系列突破性的成果。Wang等[40]以大腸埃希菌中天然啟動子序列為基礎(chǔ)，通過研究不同位置核苷酸的互作關(guān)系，利用計算機從頭設(shè)計啟動子，將預(yù)測模型與深度生成模型相結(jié)合，經(jīng)過兩輪優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)超過70%的啟動子具有功能性，且與大腸埃希菌的基因組沒有明顯的序列相似性，從而建立了啟動子設(shè)計“從端到端”的方法，最終成功構(gòu)建了基于人工智能從頭設(shè)計啟動子的框架；Van Brempt等[41]通過使用來自熒光激活細胞分類啟動子庫的高通量DNA測序數(shù)據(jù)來訓(xùn)練卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而實現(xiàn)對啟動子轉(zhuǎn)錄起始頻率和σ因子特異性啟動子正交性的預(yù)測，并以此作為在線啟動子設(shè)計工具（ProD）的基礎(chǔ)，為定制的遺傳系統(tǒng)提供定制的啟動子。

2.3 核糖體工程

“核糖體工程（ribosome engineering）”這一概念由日本國家食品研究所的Ochi教授首先提出[42]。該技術(shù)基于微生物嚴謹反應(yīng)的激活，通過引入抗生素選擇壓力，其核糖體蛋白或RNA聚合酶發(fā)生突變，使突變后菌株對環(huán)境脅迫的耐受性增強，并伴隨次級代謝產(chǎn)物多樣性的產(chǎn)生，以此篩選耐藥菌株。核糖體工程在天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用潛力受到研究者持續(xù)的關(guān)注。

在抗生素壓力的選擇上，鏈霉素、利福平和慶大霉素的研究開展較多，且篩選效果相對較好。Hosaka等[43]使用上述3種抗生素對1068株土壤放線菌進行了大規(guī)模的篩選，他們發(fā)現(xiàn)在這種壓力下，土壤中43%的鏈霉菌和6%的非鏈霉菌放線原本具備不生產(chǎn)抗生素的菌株最終都能夠明顯進化出生產(chǎn)抗生素的能力，最后從1株放線菌突變株中分離得到一系列新型的大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素piperidamycin。深入研究發(fā)現(xiàn)其突變體生產(chǎn)抗生素的能力得到顯著提高是由于其RNA聚合酶的突變，或者核糖體蛋白基因s12的突變而引起二者親和力的增加所導(dǎo)致。

核糖體工程的應(yīng)用還可以激活沉默的BGC，并在其他細菌或真菌中發(fā)現(xiàn)新的活性化合物。Wu等[44]用新霉素和DMSO對海洋產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum） G59進行抗性篩選，與之前培養(yǎng)結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)了5種新的次級代謝產(chǎn)物：curvularin， citrinin， penicitrinone A， erythro-23-O-methylneocyclocitrinol和22E-7α-methoxy-5α，6α-epoxyergosta-8（14），22-dien-3β-ol，并且這5個化合物對人癌細胞系K562、HL-60、HeLa和BGC-823均有不同程度的抑制。

目前核糖體工程與代謝工程聯(lián)用的例子較多，其主要的應(yīng)用方向為微生物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升，但是其對于微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的發(fā)掘也具有廣闊的前景。

3 合成生物學(xué)和異源表達技術(shù)的應(yīng)用

合成生物學(xué)是將工程化的思維邏輯應(yīng)用到生物合成中來，學(xué)習(xí)自然的生物合成機制，在此基礎(chǔ)上設(shè)計和構(gòu)建全新的生物元件、裝置和系統(tǒng)，或改良和優(yōu)化已有的天然生物合成系統(tǒng)。其中，微生物的生物合成基因簇是應(yīng)用基礎(chǔ)。合成生物學(xué)通過對合成基因簇的改造及表達調(diào)控，借助不同的底盤細胞，如酵母菌、大腸埃希菌等，實現(xiàn)高效異源表達所需化合物的目的，該方法也是目前研究的熱點之一（圖3）。如何合理設(shè)計和構(gòu)建生物元件、高效獲取目的基因片段、構(gòu)建良好的異源表達體系等問題是該技術(shù)所涉及的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.1 基因簇直接克隆與異源表達

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物的合成基因簇得到了快速的解析，在此基礎(chǔ)上利用合成生物學(xué)和異源表達的方法，研究者可以高效獲得結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物。但是，目標基因的獲取，尤其是大片段目標基因能否成功獲取直接決定了異源表達能否開展實施。

傳統(tǒng)方法通常通過構(gòu)建基因組文庫來進行篩選，該方法不僅資源投入大，還受到片段長度的限制，無法對大片段的目的基因進行有效提取?；诖耍絹碓蕉嗟幕虼乜寺〖夹g(shù)不斷涌現(xiàn)，為微生物異源表達及微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的發(fā)掘注入了新的活力。

Fu等[45]提出了RecET直接克隆技術(shù)，即利用大腸埃希菌全長Rac前噬菌體蛋白RecE和其伴侶RecT重組蛋白將目的基因直接克隆到表達載體中，運用該技術(shù)對發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens） TT01的基因組進行挖掘，成功克隆出10個未知PKS－NRPS基因簇中的9個，并異源表達出了其中2個基因簇，最終鑒定得到了3個新的次級代謝產(chǎn)物——發(fā)光霉素A（luminmycin A）和發(fā)光酰胺A/B（luminmide A/B）。但RecET直接克隆技術(shù)不能克隆大于50 kb的DNA片段。對此，Wang等[46-47]將RecET系統(tǒng)和Redαβ DNA修飾系統(tǒng)整合到一個大腸埃希菌宿主中，實現(xiàn)了對基因組克隆、轉(zhuǎn)移和異源表達的無縫對接，并將該技術(shù)命名為Red/ET重組技術(shù)；同時，該團隊利用核酸外切酶介導(dǎo)的體外多分子組裝和RecET直接克隆技術(shù)實現(xiàn)了將克隆載體和目的基因?qū)胪粋€宿主的同時，完成對大于100 kb的細菌基因組DNA進行直接克隆，并將該技術(shù)命名為ExoCET技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，Song等[48]利用Redαβ介導(dǎo)的線環(huán)重組、CcdB介導(dǎo)的反向篩選和核酸外切酶介導(dǎo)的體外同源重組，實現(xiàn)了對大型復(fù)雜基因簇中的基因編輯，并且通過該方法完成了對多殺菌素的基因簇的改造，獲得了新穎的丁烯基多殺菌素A（butenyl-spinosyn A），并將該技術(shù)命名為RedEx技術(shù)。

TAR（Transformation associated recombination）克隆技術(shù)，即轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組技術(shù)，是1種基于酵母的同源重組系統(tǒng)、從復(fù)雜基因組中選擇性地快速克隆目的DNA片段的方法，該方法也是目前已報道的唯一能選擇性克隆300 kb及以上大片段的方法。例如，Yamanaka等[49]利用TAR克隆技術(shù)對海洋放線菌Saccharomonospora sp. CNQ-490進行產(chǎn)物多樣性發(fā)掘，表達出一個67 kb的非核糖體肽合成酶生物合成基因簇并在模型宿主細胞Streptomyces coelicolor中生產(chǎn)出一種新的抗生素taromycin A，成功激活沉默的生物合成途徑，體現(xiàn)了TAR直接克隆技術(shù)對生物合成流水線的轉(zhuǎn)移、激活，以及多樣化次級代謝物生產(chǎn)方面的便捷和高效。

與此同時，基因編輯與基因簇克隆的結(jié)合也催生出許多新方法。Jiang等[50]利用CRISPR/Cas9和Gibson組裝開發(fā)了1種在體外將細菌基因組中特定的基因簇直接克隆的方法，稱為CATCH技術(shù)（Cas9-assisted targeting of chromosome segments），該技術(shù)可在1個步驟內(nèi)，完成對幾乎任意的、長達100 kb的細菌基因組序列的有效靶向克隆。Liang等[51]開發(fā)了一種CRISPR-Cas12a介導(dǎo)的快速直接生物合成基因簇克隆法，稱為CAT-FISHING，用于直接捕獲大型BGCs。

3.2 功能基因的整合重構(gòu)及異源表達

天然產(chǎn)物生物合成途徑的異源表達不僅可以結(jié)合基因組挖掘技術(shù)，將隱性生物合成基因簇在異源宿主細胞中進行功能性表達，還可以結(jié)合生物合成工程，將不同來源的基因進行組合和重新排列來產(chǎn)生一系列新的類似物。這種策略極大地促進了新活性化合物的發(fā)現(xiàn)，為進一步發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性提供新思路。下面我們主要介紹在合成生物學(xué)指導(dǎo)下，重組基因或重構(gòu)生物合成途徑在異源表達方面的應(yīng)用。

Zhang等[52]借助基于“脫氧單糖的重構(gòu)”和“糖基模塊替換” 對紅霉素的基因簇進行了重構(gòu)整合，在大環(huán)內(nèi)酯苷元上引入不同的糖基化修飾，生產(chǎn)了一系列對紅霉素耐藥菌株具有抑制活性的紅霉素類似物。Huffman等[53]從細菌核苷酸合成途徑中的補救合成途徑入手，設(shè)計了逆向合成路線，通過定向進化獲得5種穩(wěn)定的合成酶，在4種輔酶的輔助下實現(xiàn)了抗HIV藥物伊斯拉曲韋（islatravir）生物全合成，相比于化學(xué)全合成工藝，步驟更少，產(chǎn)量更高。

隨著啟動子工程、基因簇克隆以及基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，未來在合成生物學(xué)理論指導(dǎo)下的異源表達技術(shù)在微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性發(fā)掘中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 人工智能指導(dǎo)合成生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用

生物元件的設(shè)計是合成生物學(xué)的基石，其固有的復(fù)雜性限制了對其工程化的改造，因此如何實現(xiàn)合成核心元件的標準化并提高其與底盤細胞的適配性是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一個核心的研究方向。

生物信息學(xué)與人工智能（artificial intelligence，AI）不斷發(fā)展，人們有望于在設(shè)計和優(yōu)化生物元件、代謝工程和合成途徑等方面取得更進一步的突破。Li等[54]通過人工智能技術(shù)對芽胞桿菌Bacillus sp．中催化碳－碳雙鍵的不對稱氫胺化中所使用的天冬氨酸酶YM55-1進行重新設(shè)計，獲得了具有高度選擇性的β-氨基酸合成酶，從而構(gòu)建了高效合成β-氨基酸的工程菌，首次完成了由計算指導(dǎo)來發(fā)現(xiàn)新型合成酶的應(yīng)用，實現(xiàn)了人工智能技術(shù)在微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性挖掘方面的成功運用。Yeh等[55]開發(fā)了一種基于深度學(xué)習(xí)的蛋白設(shè)計策略——family-wide hallucination，該策略可以產(chǎn)生大量不同結(jié)合口袋的理想蛋白結(jié)構(gòu)，并設(shè)計出編碼這些結(jié)構(gòu)的序列，通過該策略，團隊成功實現(xiàn)了可選擇性催化化學(xué)發(fā)光的人造熒光素酶的從頭設(shè)計，該策略的成功應(yīng)用，在人工設(shè)計酶領(lǐng)域堪稱里程碑意義的突破，這一突破意味著利用計算機可以實現(xiàn)尚未在自然界中發(fā)現(xiàn)的人工酶的從頭設(shè)計，從而完成對化學(xué)反應(yīng)定制酶的需求。

此外，人工智能還可以用于合成生物學(xué)的預(yù)測，極大地減少逆向設(shè)計的大量試錯成本。然而，人工智能對合成生物學(xué)的影響依舊有限，仍局限于特定的數(shù)據(jù)集和研究問題。

目前，研究者們面臨的挑戰(zhàn)仍是如何使其適用于更廣泛的應(yīng)用程序和其他數(shù)據(jù)集。對此，人工智能技術(shù)已經(jīng)結(jié)合了生物物理、機器學(xué)習(xí)和強化學(xué)習(xí)模型，以求更有效地進行預(yù)測，如：ReFeaFi[56]、生成對抗網(wǎng)絡(luò)（generative adversarial network，GAN）[57]等，為調(diào)控元件的識別、活性強度預(yù)測、元件從頭設(shè)計等方面提供了新思路[58]。

4 篩選方法的優(yōu)化

微生物次級代謝產(chǎn)物的篩選方法是影響發(fā)掘效率的關(guān)鍵因素之一。一旦獲得或即將獲得這些產(chǎn)物，高效地篩選和分離目標化合物成為亟須解決的問題。針對這一問題，研究者們致力于改進篩選體系，力求簡化和加速篩選、分離過程，以提高微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的發(fā)掘效率。

4.1 高通量篩選策略

高通量篩選技術(shù)（high throughput screening，HTS）將多種技術(shù)（如組合化學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)、自動化和機器人技術(shù)）相結(jié)合，實現(xiàn)快速、高效、自動化的篩選。這種方法已廣泛應(yīng)用于微生物次級代謝產(chǎn)物的篩選，隨著應(yīng)用范圍的擴大，其重要性逐漸凸顯，在微生物定向進化中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

定向進化（directed evolution）是利用實驗室的條件來模擬自然進化的過程[59]，通過對突變體次級代謝產(chǎn)物的篩選，可以用于發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物的多樣性。這一過程需要對大量的突變體進行篩選，因而一個靈敏、可靠且快速的高通量篩選方法十分重要。熒光激活細胞分選技術(shù)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）[60]，即一種將酶活性轉(zhuǎn)化為熒光信號以對單細胞進行高效快速分選的技術(shù)。Tan等[61]開發(fā)了一種熒光激活細胞的分選系統(tǒng)，運用超高通量篩選的方法（107個突變體/h）對突變體進行篩選，成功從幽門螺桿菌（Helicobacter pylori） strain NCTC 11639的突變體中篩選得到了α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性提高14倍的突變體M32。近年來，微流控技術(shù)（fluidics）也從最初的微電子工業(yè)應(yīng)用逐漸發(fā)展到生命科學(xué)領(lǐng)域當中。微流控技術(shù)是一種將單個細胞包埋于液滴中，以實現(xiàn)對單細胞及其胞外代謝產(chǎn)物的分析技術(shù)。應(yīng)用微流控技術(shù)，張道遠等[62]綜合考慮了基于液滴的數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）和基于芯片的ddPCR的優(yōu)勢及不足，設(shè)計并制備了高集成度的數(shù)字PCR微流控芯片，完成了PCR的高通量、高通用及高進樣效率的要求，為PCR反應(yīng)的高通量篩選提供了可能。高通量篩選技術(shù)為定向進化賦能將有助于高效解析生物合成的基因簇，并將其運用于微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的發(fā)掘中。通過對微生物定向進化中突變體的高通量篩選，可以定向得到合成生物學(xué)的進化元件，其篩選效率直接決定了微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性發(fā)掘的效率。

隨著計算機技術(shù)的不斷進步，人工智能同樣在輔助篩選領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。如朱尤卓等[63]詳述了深度學(xué)習(xí)模型——卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、生成對抗網(wǎng)絡(luò)和循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等在抗菌肽藥物篩選和設(shè)計中的應(yīng)用，但由于深度學(xué)習(xí)生成的抗菌肽缺乏指導(dǎo)理論，仍存在臨床毒副作用過大等弊端；宋益東等[64]針對目前較新的蛋白質(zhì)功能及結(jié)合位點的預(yù)測方法進行了總結(jié)及優(yōu)劣分析，并提出了對目前預(yù)測方法的改進方向，為更好地預(yù)測蛋白質(zhì)功能及結(jié)合位點提供了新的思路；胡如云等[65]詳闡了機器學(xué)習(xí)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的調(diào)控元件設(shè)計、酶催化元件的設(shè)計、功能多肽設(shè)計和代謝過程等方面的應(yīng)用?？梢娪嬎銠C技術(shù)為高效篩選微生物次級代謝產(chǎn)物提供了新思路。

4.2 分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)

近年來，隨著生化信息學(xué)的快速發(fā)展，一大批強大的工具和網(wǎng)絡(luò)平臺不斷涌出，掀起了一場“天然產(chǎn)物分離藝術(shù)”的革命。其中，基于質(zhì)譜的分子網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)是最具代表性的一類多功能便捷工具，其在天然產(chǎn)物分離工作中表現(xiàn)出的快速去重復(fù)化、低成本、高效性，極大地簡化了傳統(tǒng)的分離工作，為研究者發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子提供了一條更為科學(xué)和便捷的方法。

基于串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的分子網(wǎng)絡(luò)是一種生物信息學(xué)策略，用于可視化和解釋非目標MS數(shù)據(jù)。MS/MS分子網(wǎng)絡(luò)利用藥物代謝物中分子間結(jié)構(gòu)的相似性，通過比較每個MS/MS光譜之間的光譜相似程度，將MS/MS光譜作為分子網(wǎng)絡(luò)映射到數(shù)據(jù)集中。分子網(wǎng)絡(luò)在天然產(chǎn)物分離上的應(yīng)用大致可以分為3類：①利用現(xiàn)有質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對已知化合物進行自動查詢；②利用已知的光譜特征對待查詢的光譜進行分析；③利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫對所有化合物進行全面注釋并生成推定結(jié)構(gòu)。關(guān)于分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的原理及應(yīng)用進展近期已有多篇綜述進行評述總結(jié)[66-68]，這里就不再贅述。

在MS/MS分子網(wǎng)絡(luò)的指導(dǎo)下，本實驗室[69]從海洋沉積物中衍生的放線菌Nocardiopsis sp. HDN154086中獲得了5個新穎的對三聯(lián)苯并噻唑衍生物（p-terphenyl derivatives）nocarterphenyls D-H（1～5），其中化合物1對MRSA具有顯著的抗菌。Han等[70]采用分子網(wǎng)絡(luò)方法從海綿衍生的雜色曲霉（Aspergillus versicolor）中靶向分離出一系列新的柄曲霉素衍生物sterigmatocystins A～C。本單位Shao等[71]在MS/MS分子網(wǎng)絡(luò)的指導(dǎo)下，從珊瑚衍生真菌花斑曲霉中分離出4個新的環(huán)七肽（cycloheptapeptides）與3個曲霉酰胺類似物asperversiamide A～C，并在此基礎(chǔ)上半合成出一系列衍生物，進而系統(tǒng)評價了其潛在的抗結(jié)核活性。

5 總結(jié)與展望

一直以來，從微生物中尋找活性次級代謝產(chǎn)物就是先導(dǎo)化合物開發(fā)的重要途徑，但是現(xiàn)有的技術(shù)和方法在產(chǎn)物多樣性的開發(fā)及高通量篩選等方面仍存在局限性，尤其是常規(guī)培養(yǎng)中無法被激活的沉默生物合成途徑，更是微生物次級代謝產(chǎn)物研究的最大阻礙。為此，研究者開發(fā)了多種策略，試圖從不同層面解決這一問題。

在改變培養(yǎng)條件層面，OSMAC策略與共培養(yǎng)技術(shù)通過改變培養(yǎng)環(huán)境來激活菌株代謝潛能，表觀遺傳修飾則可通過簡單地添加化學(xué)調(diào)控劑挖掘多種結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物。在基因轉(zhuǎn)錄和表達層面，啟動子工程和核糖體工程可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上實現(xiàn)對目標基因更為精細化的調(diào)控，以達到提高產(chǎn)量，獲取更多新穎次級代謝產(chǎn)物的目的。此外，通過合成生物學(xué)技術(shù)對功能基因?qū)嵤┩蛔兏脑?，并完成對生物合成流水線的重構(gòu)甚至異源表達能夠?qū)崿F(xiàn)對天然產(chǎn)物的精準合成，高效獲得多樣化的活性天然產(chǎn)物。在篩選方法優(yōu)化層面，基于測序技術(shù)的高通量篩選新策略與分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的指導(dǎo)為高效篩選微生物次級代謝產(chǎn)物提供了新思路、指明了發(fā)展方向。

然而方法與技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展并不是彼此割裂、相互獨立的，在實際科研中，研究人員常采用多方法聯(lián)用、多技術(shù)交叉的策略，多角度挖掘和改良微生物的代謝潛力與代謝能力。同時，基因組學(xué)、代謝組學(xué)和生物信息學(xué)的蓬勃發(fā)展也為微生物代謝潛力探索挖掘提供了強有力的支持。隨著更多更全面的次級代謝產(chǎn)物的基因信息被解析，其生物合成途徑與機制逐漸被揭示，越來越多的沉默基因簇將會被發(fā)現(xiàn)并激活，迎來微生物次級代謝產(chǎn)物快速開發(fā)的新時代。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（No. 41976105）；山東省泰山學(xué)者青年專家項目（No. tsqn202103153）

作者簡介：方岫琴，女，生于2002年，主要研究方向為微生物天然產(chǎn)物，E-mail： fangxiuqin@stu.ouc.edu.cn

*通信作者，E-mail： zhangguojian@ouc.edu.cn