乳鐵蛋白的重組表達(dá)系統(tǒng)及法規(guī)管理現(xiàn)狀概述

吳曉文,張長太,李佳佳,凡孝菊*,周景文*

1(江蘇創(chuàng)健醫(yī)療科技股份有限公司,江蘇 常州,213000)2(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214000)

乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種功能性糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,大約由700個(gè)氨基酸構(gòu)成,分子質(zhì)量在80 kDa左右[1]。1939年,SORENSEN等[2]首次從牛奶中分離得到了這種粉紅色的蛋白質(zhì);1960年,JOHANSON[3]又從人乳中成功將其提取出來。人初乳中富含乳鐵蛋白,平均濃度可達(dá)到6 g/L;隨著時(shí)間的推移,濃度會(huì)降低并維持在1～2 g/L水平;牛初乳和常乳中的乳鐵蛋白濃度分別為0.8 g/L左右和0.03～0.49 g/L,低于人初乳和常乳中的含量。除了普遍存在于哺乳動(dòng)物的乳汁當(dāng)中,乳鐵蛋白還分布在膽汁、胃腸液、尿液、眼淚、唾液等各種黏膜分泌物里,同時(shí)也是次級中性粒細(xì)胞的重要組成成分[3-4]。

人乳鐵蛋白(human lactoferrin,hLF)由703個(gè)氨基酸組成,METZ-BOUTIGUE等[5]在1984年完成了對其整體序列的測定;1989年,ANDERSON等[3]解析了人乳鐵蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白的三維構(gòu)象呈兩個(gè)球形葉片狀,N-葉與C-葉之間有40%左右的序列一致性,兩者通過一段α螺旋連接。以人乳鐵蛋白1FCK(文件1FCK來自PDB數(shù)據(jù)庫)為例,N-葉與C-葉又各自分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域之間的裂隙是Fe3+的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合時(shí)需要陰離子如CO32-的配合(圖1)[6]。乳鐵蛋白在哺乳動(dòng)物當(dāng)中的進(jìn)化高度保守[7]。牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,bLF)的氨基酸序列與人乳鐵蛋白有69%的一致性,兩者的二級結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象幾乎相同,僅在N-葉與C-葉的相對位置以及兩者內(nèi)部各自2個(gè)結(jié)構(gòu)域閉合程度上略有差異[8]。除了人和牛之外,數(shù)據(jù)庫里還包含其他8個(gè)物種的乳鐵蛋白序列,分別來自鼠、馬、豬、山羊、綿羊、水牛、牦牛和駱駝[9-10]。在不同的哺乳動(dòng)物體內(nèi),乳鐵蛋白含量存在顯著差異,而針對不同來源的乳鐵蛋白進(jìn)行生化特性對比研究的報(bào)道很少[7]。

a-乳鐵蛋白的三維構(gòu)象;b-與金屬離子相互作用的氨基酸殘基位點(diǎn)

乳鐵蛋白作為一種糖蛋白,通過Asn-X-Thr/Ser三肽中的天冬酰胺殘基進(jìn)行N-連接型糖基化。從氨基酸序列上可預(yù)測出,人乳鐵蛋白有4個(gè)潛在位點(diǎn),但研究結(jié)果表明,其中只有2個(gè)真正連接了糖鏈[5];牛乳鐵蛋白有5個(gè)潛在位點(diǎn),只有3個(gè)連接了糖鏈[8]。乳鐵蛋白的空間構(gòu)象和生物活性不受糖基化的直接影響,但其抵抗胰蛋白酶降解的能力會(huì)在糖基化之后增強(qiáng),從而提升結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[11]。來自哺乳動(dòng)物的天然乳鐵蛋白帶有復(fù)雜型糖鏈,而重組表達(dá)的乳鐵蛋白,根據(jù)不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)條件,具有多樣性的糖基化形式,或者缺乏糖基化修飾[12]。

1 乳鐵蛋白的生物學(xué)功能

乳鐵蛋白是哺乳動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,具有廣泛的抵抗病原體的活性,包括抵抗細(xì)菌、真菌、病毒的能力及抗寄生蟲能力等;同時(shí),乳鐵蛋白還具有抗氧化、抗癌、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及免疫調(diào)節(jié)等功能[13-15]。

1.1 對細(xì)菌的影響

乳鐵蛋白能夠通過結(jié)合Fe3+限制細(xì)菌的生長。鐵是大多數(shù)細(xì)菌生長所必需的元素,乳鐵蛋白憑借高度的親和力競爭性螯合Fe3+,從而抑制大腸桿菌、變形鏈球菌、霍亂弧菌等需鐵細(xì)菌的生長,以及抑制銅綠假單胞菌等病原菌生物膜的形成[16];自身鐵飽和度越低,乳鐵蛋白的抑菌活性越強(qiáng)[17]。然而,鐵爭奪只是延緩了細(xì)菌的生長繁殖,補(bǔ)鐵之后抑菌作用會(huì)消失[18]。

除了抑菌作用之外,乳鐵蛋白還具有直接的殺菌活性。對于細(xì)胞壁含有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的革蘭氏陰性菌,乳鐵蛋白能夠與細(xì)胞外膜上的孔道蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)LPS釋放,從而增加外膜對疏水分子的通透性,有利于溶菌酶和其他抗菌分子進(jìn)入菌體內(nèi)部殺死細(xì)菌[19]。對于細(xì)胞壁含有負(fù)電性磷壁酸的革蘭氏陽性菌,乳鐵蛋白能夠通過靜電相互作用,以N-葉帶正電荷的氨基酸殘基與磷壁酸結(jié)合,打破非極性環(huán)境,改變膜通透性,使菌體因內(nèi)部成分外泄而死[20]。

1.2 對真菌的影響

乳鐵蛋白對包括酵母菌和霉菌在內(nèi)的多種真菌病原體具有抑制或殺傷作用。FERNANDES等[21]評估了牛乳鐵蛋白對22種酵母和24種霉菌的抗真菌活性,及其與6種廣泛使用的抗真菌藥物的協(xié)同效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,牛乳鐵蛋白對所有被測試的酵母菌具有廣泛且一致的抑制能力,而只對4種霉菌有效果;其抑制酵母菌的活性會(huì)受到鐵飽和度以及消化程度的影響。當(dāng)牛乳鐵蛋白與兩性霉素B(amphotericin B,AMB)聯(lián)合用于抑制真菌時(shí),對22種酵母中的19種展現(xiàn)出高度的協(xié)同作用。LF-AMB能夠促使菌體孔隙形成、菌絲變薄以及細(xì)胞塌陷,具有應(yīng)用于抗真菌治療的潛力。

乳鐵蛋白能夠誘導(dǎo)常見的條件致病菌——白色念珠菌的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。通過掃描電鏡可觀察到,暴露于乳鐵蛋白的白色念珠菌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)膨脹、內(nèi)容物泄露,或者表面凹陷、裂縫等變化,最終走向死亡。2008年,ANDRéS等[22]首次證明了K+外流參與了這一細(xì)胞凋亡過程。K+通過離子通道流出導(dǎo)致滲透壓變化,細(xì)胞發(fā)生收縮從而一定程度上促進(jìn)了凋亡,而菌體細(xì)胞膜的通透性并未改變。2019年,該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出,乳鐵蛋白抑制Pma1p H+-ATPase活性導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化,才是調(diào)控細(xì)胞死亡通路的第一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)[23]。除此之外,人乳鐵蛋白誘導(dǎo)的白色念珠菌細(xì)胞凋亡樣表型還包括磷脂酰絲氨酸外化、核染色質(zhì)凝結(jié)、DNA降解和活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加[22]。ACOSTA-ZALDVAR等[24]在釀酒酵母模型中研究該細(xì)胞凋亡機(jī)制時(shí),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了乳鐵蛋白能引起與ROS積累和細(xì)胞色素C釋放相關(guān)的線粒體功能障礙,說明線粒體能量代謝在人乳鐵蛋白的殺傷功效中起著關(guān)鍵作用。

1.3 對病毒的影響

乳鐵蛋白對感染人類和動(dòng)物的多種RNA及DNA病毒具有抗性,通常而言,缺鐵型乳鐵蛋白的抗病毒效果更為顯著,但鐵飽和型也能夠起到一定的作用,可見鐵飽和度并非決定性因素[25]。一些情況下,乳鐵蛋白可以阻止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞,在病毒感染的早期發(fā)揮作用,如針對脊髓灰質(zhì)炎病毒[26]、單純皰疹病毒[27]、巨細(xì)胞病毒[28]以及艾滋病病毒[29];而另外一些情況下,乳鐵蛋白還可以直接與病毒顆粒作用,阻止其發(fā)揮毒性或者抑制其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制,如針對丙型肝炎病毒[30]和輪狀病毒[31]。以輪狀病毒為例,乳鐵蛋白能夠與病毒顆粒結(jié)合,阻止其吸附到靶細(xì)胞上,預(yù)防感染;而在輪狀病毒感染過程中,乳鐵蛋白能夠干擾其合成抗原,即在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后仍能保持抗病毒作用[31]。

關(guān)于乳鐵蛋白的抗病毒作用,研究者們已經(jīng)提出了幾種機(jī)制,其中被廣泛接受的,是乳鐵蛋白結(jié)合并阻斷糖胺聚糖病毒受體,特別是硫酸乙酰肝素,從而阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞,避免了感染的發(fā)生[31]。但WEIMER等[32]的研究表明,體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間存在矛盾,乳鐵蛋白的抗病毒機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

1.4 功能特性

多項(xiàng)體內(nèi)、體外試驗(yàn)表明,乳鐵蛋白是一種具有生理活性的功能性蛋白質(zhì),參與調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)鐵吸收、促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抗氧化以及抗腫瘤等生物體內(nèi)多種病理生理過程[33]。這些功能使得乳鐵蛋白具有強(qiáng)大的應(yīng)用價(jià)值和市場潛力,引起了食品與飼料行業(yè)及醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

2018年,中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)婦幼營養(yǎng)分會(huì)發(fā)布《乳鐵蛋白嬰幼兒健康效應(yīng)專家共識(shí)》,明確了LF能夠降低嬰幼兒、兒童呼吸道疾病和腹瀉的發(fā)病率,降低新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血癥的發(fā)病率和死亡率,提高兒童幽門螺桿菌根除率,促進(jìn)幼兒生長發(fā)育[34]。4年之后,中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)臨床營養(yǎng)分會(huì)又發(fā)布了《乳鐵蛋白臨床應(yīng)用中國專家共識(shí)》,進(jìn)一步明確了LF功能特性的九大共識(shí),將LF納入專業(yè)醫(yī)學(xué)視角,以期將LF合理應(yīng)用到更多臨床治療場景[35]。截至目前,我國尚無添加LF的藥品,成人可以通過攝入普通食品或者保健品進(jìn)行補(bǔ)充。隨著人們對LF了解的逐漸深入以及LF相關(guān)產(chǎn)品的推廣普及,通過補(bǔ)充LF來提高免疫力和增強(qiáng)身體素質(zhì),有可能成為全民的共同選擇。

2 乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)

乳鐵蛋白因其獨(dú)特的生物學(xué)活性,在食品、日用品、保健品和藥品中都有廣闊的應(yīng)用空間。通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)級別上生產(chǎn)重組乳鐵蛋白,既可以打破因畜牧業(yè)規(guī)模和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)帶來的產(chǎn)量限制,又可以解決人源乳鐵蛋白獲得困難的問題。多數(shù)已開發(fā)的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組乳鐵蛋白,在物理、生化和生物學(xué)特性上,與天然乳鐵蛋白相比沒有顯著區(qū)別[36]。

2.1 細(xì)菌

已報(bào)道的成功用于乳鐵蛋白異源表達(dá)的細(xì)菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、遺傳背景清晰、成本低廉等優(yōu)勢,劣勢是重組蛋白缺乏合適的翻譯后加工修飾,無法通過連接糖鏈阻止聚集而多以包涵體形式存在[12]。另外,大腸桿菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖可在臨床上引起多種生理和病理反應(yīng)[37],以及大腸桿菌本身作為條件致病菌,對人體健康也存在風(fēng)險(xiǎn);因此,以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)乳鐵蛋白,必須對最終產(chǎn)品的內(nèi)毒素殘留水平和微生物指標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)測?？莶菅挎邨U菌和干酪乳桿菌雖然沒有大腸桿菌應(yīng)用廣泛,但這兩種菌株作為一般認(rèn)為安全(generally recognized as safe,GRAS)菌株,在安全性上具有先天優(yōu)勢。

WANG等[9]通過BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)獲得了昆明小鼠乳鐵蛋白及其N-葉部分,經(jīng)鎳柱純化后產(chǎn)量分別為17 mg/L和20 mg/L;由于兩者均以包涵體的形式存在,因此抗菌效果不夠理想。HU等[38]通過BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)獲得了以包涵體形式存在的人乳鐵蛋白C-葉部分,經(jīng)純化和復(fù)性處理后產(chǎn)量為700 mg/L;與全長人乳鐵蛋白相比,該工作中表達(dá)的乳鐵蛋白C-葉具有更強(qiáng)的抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的能力,這可能要?dú)w因C-葉獨(dú)特的空間構(gòu)象和高底物親和力,更加詳細(xì)的抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。GARA-MONTOYA等[39]通過BL21(DE3)成功表達(dá)了牛乳鐵蛋白-硫氧還蛋白融合蛋白,產(chǎn)量為15.3 mg/L;經(jīng)凝血酶和胃蛋白酶處理所得的乳鐵蛋白肽,對大腸桿菌的抑制作用是未處理樣品的4倍。JIN等[40]以枯草芽孢桿菌為宿主,通過優(yōu)化氨基酸密碼子和選擇最優(yōu)啟動(dòng)子Pveg,成功表達(dá)了牛乳鐵蛋白N-葉,純化后產(chǎn)量為16.5 mg/L。表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。

乳鐵蛋白具有廣譜抑菌性,但在以上工作中,重組乳鐵蛋白均在細(xì)胞內(nèi)完成表達(dá),似乎并未對宿主產(chǎn)生毒害作用,研究者們沒有就此問題開展討論。對于干酪乳桿菌表達(dá)體系,情況則又有不同。由于乳酸菌可以適應(yīng)缺鐵環(huán)境,乳鐵蛋白的存在不會(huì)對其活力產(chǎn)生負(fù)面影響,反而是可以促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖[41-42]。CHEN等[43]將干酪乳桿菌作為宿主表達(dá)人乳鐵蛋白,產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到了10.6 mg/L。以重組干酪乳桿菌對小鼠進(jìn)行灌胃試驗(yàn),與使用野生型菌株灌胃的對照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠對致病性大腸桿菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗能力和更低的腸道損傷,說明該重組干酪乳桿菌具有作為腸道微生態(tài)制劑的潛力。

2.2 酵母

酵母表達(dá)系統(tǒng)具有培育周期短、操作簡單的特點(diǎn),同時(shí)還具有翻譯后加工修飾的功能,重組產(chǎn)物多以高甘露糖基化的糖蛋白形式存在;除此之外,目的蛋白還可以通過分泌途徑分泌至酵母細(xì)胞外,提取程序簡單。相比于大腸桿菌等常用的原核表達(dá)體系,使用酵母表達(dá)乳鐵蛋白更便于工業(yè)化生產(chǎn)[12, 44]。

LIANG等[45]在1993年以釀酒酵母為宿主成功表達(dá)了重組人乳鐵蛋白。在該表達(dá)系統(tǒng)中,部分產(chǎn)物可以通過酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)肽分泌至細(xì)胞外,培養(yǎng)液中濃度為1.5～2 mg/L,還有部分產(chǎn)物殘留在細(xì)胞內(nèi)。測試結(jié)果表明,分泌型重組目的蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)過了糖基化修飾,且具有Fe2+和Cu2+結(jié)合能力。然而,在后期進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時(shí),出現(xiàn)了產(chǎn)物表達(dá)量顯著低于前期測試水平的現(xiàn)象,作者推測可能是由于乳鐵蛋白對酵母細(xì)胞具有毒性從而導(dǎo)致了表達(dá)量難以穩(wěn)定。并且,在表達(dá)分子質(zhì)量高于30 kDa的外源蛋白時(shí),釀酒酵母在分泌效率上不占優(yōu)勢[46],所以此后更多的團(tuán)隊(duì)把畢赤酵母表達(dá)重組乳鐵蛋白作為研究方向。

PARAMASIVAM等[47]首次在畢赤酵母中成功表達(dá)了完整的馬乳鐵蛋白,搖瓶中的產(chǎn)量達(dá)到16.5 mg/L,圓二色光譜測試結(jié)果證實(shí)了產(chǎn)物具有合理的空間構(gòu)象。IGLESIAS-FIGUEROA等[48]將牛乳鐵蛋白在畢赤酵母KM71-H中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá),最終產(chǎn)量達(dá)到3.5 g/L,表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和部分銅綠假單胞菌具有抑制作用。該工作中,目的蛋白的表達(dá)量非常可觀,但由于需要對菌體進(jìn)行裂解以及對包涵體進(jìn)行復(fù)性處理,純化工藝復(fù)雜,所以工業(yè)化難度較大。此外,來源于藏羊[49]、牦牛[10]的乳鐵蛋白也都在畢赤酵母中得到了成功表達(dá),分泌表達(dá)量分別為60 mg/L和40 mg/L,且產(chǎn)物均具有相應(yīng)的抑菌活性。

在畢赤酵母中,最常用的醇氧化酶啟動(dòng)子需要通過甲醇進(jìn)行誘導(dǎo),使得該表達(dá)體系在生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)存在安全隱患。以上研究均處于實(shí)驗(yàn)室階段,未對該問題進(jìn)行討論。如果項(xiàng)目進(jìn)入到了投產(chǎn)階段,那么對每批次的產(chǎn)品進(jìn)行跟蹤檢測,確保甲醇?xì)埩袅吭跉v經(jīng)純化、干燥等工藝后已降低至安全限量以下,是不可缺少的程序。

2.3 霉菌

霉菌作為生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞工廠,具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢。它具有強(qiáng)大的蛋白表達(dá)能力和分泌途徑,能夠正確地進(jìn)行各種翻譯后處理,包括糖基化、多肽鏈剪切、二硫鍵形成等,并且能夠?qū)㈠e(cuò)誤折疊的蛋白快速清除[50]。更加重要的是,霉菌還具有很強(qiáng)的生存能力,這使得它優(yōu)于以大腸桿菌、畢赤酵母為代表的原核體系和酵母體系,尤其適合作為生產(chǎn)乳鐵蛋白這種具有廣譜抗菌性的“毒蛋白”的底盤細(xì)胞。

來自Baylor醫(yī)學(xué)院的Ward課題組,是最早在霉菌中異源表達(dá)哺乳動(dòng)物糖蛋白的團(tuán)隊(duì)。1992年,該課題組在構(gòu)巢曲霉中表達(dá)人乳鐵蛋白,獲得了5 mg/L的產(chǎn)量[51];同時(shí)期在米曲霉中表達(dá)人乳鐵蛋白,分泌表達(dá)量為25 mg/L,且重組產(chǎn)物與天然乳鐵蛋白具有相同的分子質(zhì)量、鐵結(jié)合能力以及免疫活性[52]。1995年,該團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步在泡盛曲霉中將人乳鐵蛋白與葡萄糖淀粉酶進(jìn)行融合表達(dá),再通過內(nèi)源性KEX-2肽酶切割加工成為成熟的乳鐵蛋白,該重組產(chǎn)物具有與人腸細(xì)胞受體結(jié)合的能力,且分泌表達(dá)產(chǎn)量高達(dá)2 g/L,已具備商業(yè)化價(jià)值[53]。雖然基于該重組乳鐵蛋白開發(fā)的藥物,因在三期臨床試驗(yàn)中與安慰劑組相比沒有療效上的差異[54],未能成功走向市場,但該研究仍讓我們窺見了霉菌體系生產(chǎn)重組乳鐵蛋白走向產(chǎn)業(yè)化的可能。

2.4 動(dòng)物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物

在動(dòng)物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中誘導(dǎo)表達(dá)重組產(chǎn)物,是目前基礎(chǔ)研究、生物制藥以及基因治療的重要研究方向[55]。通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)目的蛋白,能夠獲得與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更加一致的產(chǎn)物;但由于細(xì)胞培養(yǎng)對專業(yè)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)投入的較高要求,難以避免地在規(guī)?；瘧?yīng)用上受到限制[56]。通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)目的蛋白,乳腺細(xì)胞無疑是最理想的表達(dá)場所;乳腺是外分泌器官,乳汁不會(huì)進(jìn)入體循環(huán)影響宿主的生理代謝,且重組蛋白在分泌過程中已經(jīng)過充分的加工和修飾,一般具有穩(wěn)定的生物活性[57]。

目前,人乳鐵蛋白已在轉(zhuǎn)基因小鼠、山羊、豬和牛中得到了成功表達(dá),產(chǎn)量從3 g/L到30 g/L不等,重組產(chǎn)物均與天然人乳鐵蛋白具有相似的鐵結(jié)合釋放特性以及抗菌能力[56,58-61]。荷蘭Pharming公司聯(lián)合萊頓大學(xué)[60]克隆的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在泌乳期分泌人乳鐵蛋白,分泌量可達(dá)13 g/L,但是小鼠乳腺的尺寸限制了乳鐵蛋白的規(guī)?；a(chǎn),相比之下,奶牛乳腺生物反應(yīng)器是更加理想的靶蛋白表達(dá)系統(tǒng)。該團(tuán)隊(duì)又通過核顯微注射法克隆了轉(zhuǎn)基因牛,重組人乳鐵蛋白的表達(dá)水平在整個(gè)泌乳期內(nèi)保持平穩(wěn),產(chǎn)量達(dá)到3 g/L,且未影響牛奶的總體產(chǎn)量及理化參數(shù)[61]。WANG等[56]采用相比于顯微注射更加簡單高效的核轉(zhuǎn)染法,獲得了無抗生素標(biāo)記的高拷貝細(xì)菌人工染色體(bacterial artifcial chromosome,BAC)轉(zhuǎn)基因牛,克隆牛表達(dá)的人乳鐵蛋白產(chǎn)量可達(dá)4.5～13.6 g/L。該團(tuán)隊(duì)通過進(jìn)一步的胚胎移植繁育了200頭轉(zhuǎn)基因牛,表明轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器具有大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的潛力;但另一方面,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群的飼養(yǎng)仍要依賴傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式,在投入產(chǎn)出比和可持續(xù)發(fā)展上還需要更多考量。

表1 乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)Table 1 Various expression systems of recombinant lactoferrin

3 乳鐵蛋白的法規(guī)管理與應(yīng)用

3.1 法規(guī)管理

3.1.1 天然乳鐵蛋白

2000年,美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)首次批準(zhǔn)bLF為GRAS物質(zhì),可用于特定食品的生產(chǎn);2012年,歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)bLF可添加于特定食品中以強(qiáng)化其健康功能。關(guān)于應(yīng)用范圍和使用限量,美國FDA陸續(xù)許可將bLF用于嬰幼兒配方乳粉、調(diào)制乳粉、風(fēng)味發(fā)酵乳、冰淇淋、甜點(diǎn)及口香糖等產(chǎn)品中,添加量在100～400 mg/100 g;歐盟允許bLF應(yīng)用的范圍更廣,除上述品類外,還包括飲料、糖果、糕點(diǎn)以及奶酪基產(chǎn)品等,添加量在80～3 000 mg/100 g[65]。

在我國,乳鐵蛋白屬于食品添加劑當(dāng)中的細(xì)分類別——營養(yǎng)強(qiáng)化劑,產(chǎn)品規(guī)格按照GB 1903.17—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑 乳鐵蛋白》進(jìn)行管理,使用限量的發(fā)展歷程見表2。根據(jù)GB 14880—2012 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》,乳鐵蛋白可添加到調(diào)制乳、風(fēng)味發(fā)酵乳和含乳飲料中,使用量≤1.0 g/kg;可用在嬰幼兒配方食品中,使用量≤1.0 g/kg(限粉狀產(chǎn)品,液態(tài)按稀釋倍數(shù)折算)。2012年,衛(wèi)生部發(fā)布第15號(hào)公告,附件4《鐵等8種擴(kuò)大使用范圍及用量的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑》中規(guī)定,乳鐵蛋白可用于調(diào)制乳粉,使用量≤1.0 g/kg。2013年,衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布第11號(hào)文件《關(guān)于批準(zhǔn)抗壞血酸鈉等8種食品添加劑擴(kuò)大使用范圍用量的公告》,乳鐵蛋白在嬰幼兒配方食品中的最大使用量為1.0 g/L,以即食狀態(tài)計(jì),粉狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)增加使用量。

表2 乳鐵蛋白的使用規(guī)定Table 2 Regulations for the application of lactoferrin

3.1.2 重組乳鐵蛋白

現(xiàn)階段,我國尚未出臺(tái)任何關(guān)于重組乳鐵蛋白的使用標(biāo)準(zhǔn)和政策,國外也沒有關(guān)于重組乳鐵蛋白的安全食用歷史。2021年,國家衛(wèi)健委正式打開了轉(zhuǎn)基因食品添加劑新品種的申報(bào)路徑,如果針對重組乳鐵蛋白進(jìn)行申報(bào),需要先根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》對產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià);取得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部出具的轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)證書之后,再參照《食品添加劑新品種管理辦法》和《食品添加劑新品種申報(bào)與受理規(guī)定》向國家衛(wèi)生計(jì)生委提出關(guān)于食品添加劑新品種生產(chǎn)與經(jīng)營的申請。

3.2 生產(chǎn)與應(yīng)用

1985年,比利時(shí)Oleofina公司成為首家商業(yè)化生產(chǎn)牛乳鐵蛋白的企業(yè)。1989年,日本森永乳業(yè)開始在德國Milei公司生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。隨后,新西蘭新萊特、荷蘭皇家菲仕蘭、澳洲百斯頓等公司也加入進(jìn)來,全球乳鐵蛋白年產(chǎn)量從2006年的不足80 t上升至2015年的221 t,并在2021年達(dá)到300 t左右[66-67]。2022年5月,飛鶴首條乳鐵蛋白自動(dòng)化生產(chǎn)線也已正式投產(chǎn),開創(chuàng)了國內(nèi)乳業(yè)先河。1986年,森永乳業(yè)首次將乳鐵蛋白應(yīng)用于嬰兒配方乳粉的生產(chǎn)。歷經(jīng)多年發(fā)展,乳鐵蛋白在日本的應(yīng)用范圍已擴(kuò)大至酸奶、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、寵物食品、牙膏和化妝品等,在產(chǎn)品中起到改善腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗感染等作用[66,68]。目前,我國對乳鐵蛋白的應(yīng)用多集中在嬰幼兒配方乳粉和保健食品領(lǐng)域,原料主要依賴進(jìn)口。

重組人乳鐵蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)在抗菌、鐵的結(jié)合釋放性能等方面與天然人乳鐵蛋白(hLF)具有相似的性質(zhì)。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,胃蛋白酶能在60 min內(nèi)將rhLF完全消化,與hLF的消化情況相似。截至目前,沒有關(guān)于人類對乳鐵蛋白這種存在于自身分泌腺中的物質(zhì)過敏的報(bào)道。因此,對具有相同氨基酸序列的外源蛋白質(zhì)過敏的可能性幾乎可以忽略不計(jì)[69]。另外,戴亞妮等[70]通過急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)證明,rhLF屬無毒級產(chǎn)品,無亞慢性毒性,無潛在的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。

2022年8月,新加坡生物技術(shù)公司TurtleTree宣布,將通過發(fā)酵技術(shù)(乳腺細(xì)胞)生產(chǎn)重組牛乳鐵蛋白產(chǎn)品,專注于嬰兒營養(yǎng)、免疫、腸道健康等方面的研究,并計(jì)劃于2023年率先在美國推出商業(yè)化產(chǎn)品[71]。De Novo Dairy是首家總部位于南非的精密發(fā)酵公司,這家初創(chuàng)公司通過畢赤酵母表達(dá)體系生產(chǎn)rhLF,并計(jì)劃在2023年將新產(chǎn)品推向市場[72]。

4 總結(jié)與展望

重組乳鐵蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)與天然乳鐵蛋白基本一致,來自不同表達(dá)體系的產(chǎn)品雖然在糖基化方面存在差異,但生物活性幾乎不受影響。同時(shí),重組乳鐵蛋白在產(chǎn)量與規(guī)格上更具可控性,在生產(chǎn)上更加高效、環(huán)保、可持續(xù),高度符合“未來食品”的特征。隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展,以及法規(guī)管理的與時(shí)俱進(jìn),一些勇于創(chuàng)新的生物技術(shù)公司已經(jīng)開始對重組乳鐵蛋白的商業(yè)化進(jìn)行布局,未來有望出現(xiàn)重組產(chǎn)品與天然產(chǎn)品在市場上并駕齊驅(qū)的景象。

在表達(dá)體系的考量上,相比于仍要依賴傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,以及培養(yǎng)成本居高不下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行翻譯后修飾的酵母和霉菌無疑是更加具有競爭力的選擇。鑒于乳鐵蛋白具有廣譜抑菌性,想要獲得高效分泌和表達(dá)的菌株,宿主細(xì)胞對重組乳鐵蛋白的耐受程度是關(guān)鍵因素。或許,可以通過高通量篩選或者底盤細(xì)胞改造等手段,獲得具有商業(yè)價(jià)值的高產(chǎn)菌株,最終促成重組乳鐵蛋白的產(chǎn)業(yè)化之路。