付小花, 陳 皓, 張 華, 周 磊, 唐賢春
(同濟(jì)大學(xué)a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院;b.污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海 200092)
在全球變暖及我國“雙碳”目標(biāo)提出的背景下,自養(yǎng)微生物CO2的固定同化已成為研究熱點[1-3]。對特定環(huán)境,如濕地、森林、農(nóng)田等土壤中的固碳微生物種類及數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測,有助于近似估算這些區(qū)域的固碳潛能,對我國實現(xiàn)“碳中和碳達(dá)峰”目標(biāo)有積極意義[4-5]。目前關(guān)于固碳微生物的分析有培養(yǎng)法和不需培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法,培養(yǎng)法費時費力,而且結(jié)果中缺失不可培養(yǎng)的微生物信息,而不需培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法在分析微生物群落時具有快速、高效、信息全面等特點[6]。常用的基于16SrRNA基因的測序分析,得到的是所有微生物的類群信息,難以獲得確切的固碳微生物數(shù)量信息。以卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的大亞基編碼基因cbbL作為靶標(biāo)表征固碳微生物是科學(xué)研究中常用的方法,被廣泛應(yīng)用于固碳微生物分析[7-8]。
目前主要運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法進(jìn)行以cbbL基因為靶標(biāo)的固碳微生物定量檢測[9],該定量方法依賴于Ct值(Ct指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)),需要用標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,此過程較為費時費力,而且環(huán)境樣品中抑制劑的存在會改變樣品的Ct值,使得定量結(jié)果不準(zhǔn)確。微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ddPCR)是近年來新興的一種靶基因絕對定量實驗技術(shù),該方法不依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以實現(xiàn)對核酸分子數(shù)目的絕對定量,檢測靈敏度高,理論上可檢出20 μL反應(yīng)體系中的一個目的DNA分子[10]。分液技術(shù)可稀釋背景序列干擾,結(jié)果判讀時僅判斷“有”或“無”2 種擴(kuò)增狀態(tài),因此ddPCR對PCR反應(yīng)抑制劑的耐受能力大大提高[11]。ddPCR技術(shù)在檢測低拷貝基因時有優(yōu)勢,特別適合定量檢測復(fù)雜環(huán)境樣品中微量/痕量目的基因,目前已應(yīng)用于醫(yī)療、食品、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域[12-15],尚無應(yīng)用于固碳微生物檢測的文獻(xiàn)。建立了以cbbL基因為檢測靶標(biāo)、絕對定量土壤固碳微生物的ddPCR技術(shù),為土壤固碳微生物的測定及碳匯能力評估提供技術(shù)支撐。
(1)實驗儀器。PCR儀(BioRad T100),定量PCR儀(BioRad CFX96),ddPCR 系統(tǒng)(BioRad QX200),臺式高速離心機(jī)(Thermo Pico21),生物樣品均質(zhì)儀(MP FastPrep24-5G),單道可調(diào)微量移液器(Eppendorf,Rainin),超微量紫外/可見光分光光度計(NanoDrop2000),水浴鍋,恒溫?fù)u床,隔水式恒溫培養(yǎng)箱。
(2)主要試劑。土壤DNA提取試劑盒(DNeasy?PowerSoil Pro Kit)購自Qiagen 公司;ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)、微滴生成油和微滴讀取油均購自Bio-Rad公司;Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)購自TaKaRa公司;引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
通過文獻(xiàn)資料調(diào)研,以編碼卡爾文循環(huán)關(guān)鍵酶大亞基的cbbL基因表征固碳微生物,選擇引物cbbLR1F(5′-AAG GAY GAC GAG AAC ATC-3′)、cbbLR1intR(5′-TGC AGS ATC ATG TCR TT-3′)以及探針cbbLRpro(5′-CAT GCA YTG GCG CGA CCG-3′),其中,S = C/G,R = A/G,Y = C/T,擴(kuò)增產(chǎn)物大小約275 bp[16]。
土壤樣品充分混合,稱取0.25 g 土壤,采用Qiagen公司的DNeasy? PowerSoil Pro Kit試劑盒按操作說明提取DNA,最后溶于60 μL無菌水,-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>
用cbbLR1F和cbbLR1intR 擴(kuò)增提取得到的土壤樣品DNA,擴(kuò)增條件為:95 ℃、2 min;95 ℃、15 s,55℃、30 s,72 ℃、30 s,35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物連接pMD18T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含60 μg/mL氨芐青霉素的LB 固體平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序,序列比對正確的轉(zhuǎn)化子保存菌種并提取質(zhì)粒,獲得陽性質(zhì)粒,命名為pMDcbbL,NanoDrop2000 超微量紫外/可見光分光光度計測定質(zhì)粒濃度。
將pMD-cbbL質(zhì)粒的質(zhì)量濃度根據(jù)分子量換算成拷貝數(shù)濃度2.31010copies/μL,10 倍稀釋,取拷貝數(shù)濃度2.3100~2.3106copies/μL的pMD-cbbL為模板,以引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗,以評估引物探針的適用性。實時熒光定量PCR 反應(yīng)程序為:95 ℃、5 min;95 ℃、15 s;60 ℃、1 min(收集熒光),40 個循環(huán)。
(1)ddPCR檢測cbbL基因。參考BioRad 公司的ddPCR操作使用指南配制反應(yīng)體系(見表1)?;旌暇鶆颍x心除氣泡。將微滴生成卡DG8 放入支架中,用Rainin的20 μL移液器和20 μL吸頭吸取20 μL反應(yīng)液并加入DG8 中間一排孔中,在DG8 下面一排孔中分別加入70 μL微滴生成油,蓋上專用膠墊,放入微滴生成儀生成微滴。待微滴生成后,在微滴發(fā)生卡的上排能看見云霧狀的溶液,這就是生成的油包水微滴。緩慢吸取微滴(約40 μL),轉(zhuǎn)移到專用的96 孔板中。蓋上鋁膜,用預(yù)熱好的封膜儀180 °C、5 s 封膜,放入PCR 儀擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如表1 所示,全程升降溫速率均小于等于2 °C/s。擴(kuò)增完成后,讀取微滴信號,用QuantaSoft軟件分析數(shù)據(jù)。
表1 ddPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序
(2)ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。選用pMD-cbbL質(zhì)粒為模板,對ddPCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括退火溫度、探針濃度和引物濃度。優(yōu)化的關(guān)鍵因素是最大限度地提高陰性和陽性微滴分區(qū)之間的熒光振幅,并最小化具有中等熒光強(qiáng)度的微滴數(shù)量。退火溫度設(shè)為62.0、61.2、60.0、58.1、55.8、53.9、52.7、52.0 ℃。在優(yōu)化退火溫度的基礎(chǔ)上,設(shè)置4 組探針濃度進(jìn)行ddPCR 反應(yīng),分別為200、250、300、350 nmol/L,每組設(shè)3 個重復(fù)。最優(yōu)退火溫度和探針濃度確定后,設(shè)定上下游引物終濃度600、750、900 nmol/L 進(jìn)行ddPCR 反應(yīng),每組設(shè)3 個重復(fù)。
(3)線性范圍和靈敏度實驗。以pMD-cbbL 質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,10 倍稀釋,取拷貝數(shù)濃度2.3 ×100~2.3 ×106copies/μL 的pMD-cbbL 為模板,采用優(yōu)化的退火溫度、引物濃度和探針濃度進(jìn)行實驗,評估ddPCR 檢測cbbL基因的線性范圍和檢測靈敏度。
(4)重復(fù)性實驗。將提取的濕地土壤稀釋10 倍后作為模板,以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測cbbL基因拷貝數(shù),設(shè)置21 個重復(fù),計算變異系數(shù),以評估該方法的可重復(fù)性。
(5)特異性檢測。以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測pMDcbbL質(zhì)粒、濕地土壤、大腸桿菌、產(chǎn)堿芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、真菌18SrDNA,以雙蒸水代替模板為空白對照,評估ddPCR方法的特異性。
用引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro 實時熒光定量PCR 檢測質(zhì)粒pMD-cbbL,結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出,10 倍稀釋的質(zhì)粒樣品間呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系,R2= 0.996,擴(kuò)增效率為94.2%,說明實驗中選用的引物和探針能有效檢測cbbL基因。
圖1 定量PCR檢測cbbL基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線
(1)ddPCR 方法的微滴數(shù)量控制。ddPCR 的數(shù)據(jù)分析是用QuanatSoft軟件統(tǒng)計陰陽性微滴數(shù),計算陽性微滴的占比p,由泊松分布計算出每個微滴中所含有的靶基因拷貝數(shù)為-ln(1 -p),再根據(jù)理論微滴總數(shù)計算出靶基因總拷貝數(shù)[10]。為了獲得可靠數(shù)據(jù),一般微滴總數(shù)需超過10 000,微滴總數(shù)低于10 000 的結(jié)果舍棄。本文中涉及的所有實驗,擴(kuò)增的微滴總數(shù)均達(dá)到10 000 個以上,說明實驗結(jié)果均成立,后續(xù)不再贅述。圖2 所示為梯度稀釋實驗中16 個反應(yīng)(編號1 ~16)的微滴總數(shù)。
圖2 ddPCR檢測cbbL基因生成的微滴總數(shù)
(2)ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。不同退火溫度擴(kuò)增結(jié)果如表2、圖3 所示。各溫度間測得的質(zhì)粒分子數(shù)有差異,其中52.7 ℃測定的質(zhì)粒分子數(shù)最大,其次是55.8 ℃。PCR 實驗中,退火溫度越高,反應(yīng)的特異性越好。當(dāng)溫度為55.8 ℃時,熒光振幅最大,陽性微滴和陰性微滴分布界限最為明顯。因此,確定反應(yīng)的最佳退火溫度為55.8 ℃。
圖3 退火溫度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果
表2 不同退火溫度下ddPCR檢測的質(zhì)粒分子數(shù)
設(shè)置A05 ~C05、D05 ~F05、G05 ~A06、B06 ~D06的探針濃度分別為200、250、300、350 nmol/L,cbbLddPCR測定結(jié)果如圖4 所示。隨著探針濃度的增加,ddPCR測定的質(zhì)粒濃度逐漸增加,但不同探針濃度測得的質(zhì)粒拷貝數(shù)差異不顯著(P>0.05)。200、250、300、350 nmol/L 探針濃度下,ddPCR 檢測的質(zhì)粒分子數(shù)分別為(618. 00 ± 24.17)、(627. 33 ± 22.17)、(629.33 ±50.76)、(634. 67 ±14.08)copies/μL。當(dāng)探針濃度為350 nmol/L 時,熒光振幅最高,陰陽微滴區(qū)分最為明顯。因此,確定反應(yīng)的最佳探針濃度為350 nmol/L。
圖4 探針濃度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果
當(dāng)探針濃度為350 nmol/L 時,設(shè)置A07 ~C07、D07 ~F07、G07 ~A08 的引物濃度分別為900、750、600 nmol/L,cbbL-ddPCR 測定結(jié)果如圖5 所示??梢?,在所選定的引物濃度范圍內(nèi),隨著引物濃度降低,ddPCR測定的質(zhì)粒濃度逐漸增加,但差異不顯著(P>0.05)。900、750、600 nmol/L引物濃度下,ddPCR 檢測的質(zhì)粒分子數(shù)分別為(604.67 ±10.87)、(614.67 ±41.71)、(644. 67 ± 21.97)copies/μL。當(dāng)引物濃度為600 nmol/L時,測得的質(zhì)粒分子數(shù)最高,但熒光振幅低于900、750 nmol/L時。當(dāng)引物濃度為750 nmol/L時,測得的質(zhì)粒濃度較高,熒光振幅最高,陽性微滴和陰性微滴區(qū)分最為明顯。因此,確定反應(yīng)的最佳引物濃度為750 nmol/L。
圖5 引物濃度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果
以拷貝數(shù)濃度為2.3 ×100~2.3 ×106copies/μL的pMD-cbbL質(zhì)粒為模板,每個濃度設(shè)置3 個平行實驗,用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖6所示。從圖6(a)可以看出,拷貝數(shù)濃度為2.3 ×106copies/μL的樣品,所有微滴都顯示為陽性微滴,無陰性微滴,檢測結(jié)果不可靠,舍去。由圖6(b)可見,其余6 個稀釋度的質(zhì)粒濃度與ddPCR檢測的拷貝數(shù)呈線性關(guān)系,曲線方程為y= 0.107 7x- 95.562,R2=0.999 7,線性關(guān)系良好,說明建立的cbbL-ddPCR 檢測方法定量結(jié)果可信。該方法的最高定量限為2.3 ×105copies/μL-DNA,最低定量限為2.3 copies/μLDNA。ddPCR實驗靈敏度極高,在20 μL 反應(yīng)液中只要有1 個cbbL基因分子該技術(shù)就能檢測出來,實驗中20 μL 反應(yīng)液中加入2 μL DNA模板,所以該方法的檢出限或者靈敏度為0.5 copy/μL-DNA。
圖6 ddPCR檢測cbbL基因的線性范圍
以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測稀釋10 倍的濕地土壤DNA的cbbL基因拷貝數(shù),設(shè)置21 個重復(fù)(編號1 ~21)。結(jié)果顯示,21 個重復(fù)的cbbL基因拷貝數(shù)濃度范圍為2 080 ~2 380 copies/μL,組內(nèi)變異系數(shù)為3.92%,說明建立的cbbL-ddPCR檢測方法具有極好的重復(fù)性(見表3、圖7)。
圖7 ddPCR方法的組內(nèi)重復(fù)性實驗
表3 ddPCR方法檢測濕地土壤DNA的重復(fù)性實驗
用建立的cbbL-ddPCR方法分別對大腸桿菌、產(chǎn)堿芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和真菌18SrDNA 進(jìn)行檢測,測試該方法的特異性。結(jié)果顯示,除了pMD-cbbL 質(zhì)粒和濕地土壤樣本出現(xiàn)了陽性微滴(分別為5 967 和5 238 個),其他4 個DNA樣本和空白對照均未出現(xiàn)陽性微滴,說明建立的ddPCR 檢測方法對含有cbbL基因的固碳微生物具有較好的特異性(見圖8)。
圖8 ddPCR方法的特異性實驗
建立了以cbbL基因為靶標(biāo)的固碳微生物ddPCR檢測方法。通過優(yōu)化得到最佳退火溫度為55.8 ℃,最佳引物與探針濃度分別為750 nmol/L和350 nmol/L。測試結(jié)果表明,該方法靈敏度和重復(fù)性高、特異性好,實現(xiàn)了真正意義上的絕對定量,可用于測定土壤固碳微生物數(shù)量,從而評估土壤碳匯能力。