土壤固碳微生物的絕對定量檢測實驗設(shè)計

付小花， 陳 皓， 張 華， 周 磊， 唐賢春

（同濟大學(xué)a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；b.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092）

0 引 言

在全球變暖及我國“雙碳”目標提出的背景下，自養(yǎng)微生物CO2的固定同化已成為研究熱點［1-3］。對特定環(huán)境，如濕地、森林、農(nóng)田等土壤中的固碳微生物種類及數(shù)量進行監(jiān)測，有助于近似估算這些區(qū)域的固碳潛能，對我國實現(xiàn)“碳中和碳達峰”目標有積極意義［4-5］。目前關(guān)于固碳微生物的分析有培養(yǎng)法和不需培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法，培養(yǎng)法費時費力，而且結(jié)果中缺失不可培養(yǎng)的微生物信息，而不需培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法在分析微生物群落時具有快速、高效、信息全面等特點［6］。常用的基于16SrRNA基因的測序分析，得到的是所有微生物的類群信息，難以獲得確切的固碳微生物數(shù)量信息。以卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco）的大亞基編碼基因cbbL作為靶標表征固碳微生物是科學(xué)研究中常用的方法，被廣泛應(yīng)用于固碳微生物分析［7-8］。

目前主要運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法進行以cbbL基因為靶標的固碳微生物定量檢測［9］，該定量方法依賴于Ct值（Ct指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），需要用標準品制備標準曲線，此過程較為費時費力，而且環(huán)境樣品中抑制劑的存在會改變樣品的Ct值，使得定量結(jié)果不準確。微滴數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（ddPCR）是近年來新興的一種靶基因絕對定量實驗技術(shù)，該方法不依賴于Ct值和標準曲線就可以實現(xiàn)對核酸分子數(shù)目的絕對定量，檢測靈敏度高，理論上可檢出20 μL反應(yīng)體系中的一個目的DNA分子［10］。分液技術(shù)可稀釋背景序列干擾，結(jié)果判讀時僅判斷“有”或“無”2 種擴增狀態(tài)，因此ddPCR對PCR反應(yīng)抑制劑的耐受能力大大提高［11］。ddPCR技術(shù)在檢測低拷貝基因時有優(yōu)勢，特別適合定量檢測復(fù)雜環(huán)境樣品中微量/痕量目的基因，目前已應(yīng)用于醫(yī)療、食品、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域［12-15］，尚無應(yīng)用于固碳微生物檢測的文獻。建立了以cbbL基因為檢測靶標、絕對定量土壤固碳微生物的ddPCR技術(shù)，為土壤固碳微生物的測定及碳匯能力評估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

（1）實驗儀器。PCR儀（BioRad T100），定量PCR儀（BioRad CFX96），ddPCR 系統(tǒng)（BioRad QX200），臺式高速離心機（Thermo Pico21），生物樣品均質(zhì)儀（MP FastPrep24-5G），單道可調(diào)微量移液器（Eppendorf，Rainin），超微量紫外/可見光分光光度計（NanoDrop2000），水浴鍋，恒溫搖床，隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

（2）主要試劑。土壤DNA提取試劑盒（DNeasy?PowerSoil Pro Kit）購自Qiagen 公司；ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）、微滴生成油和微滴讀取油均購自Bio-Rad公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購自TaKaRa公司；引物、探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 引物、探針的選擇

通過文獻資料調(diào)研，以編碼卡爾文循環(huán)關(guān)鍵酶大亞基的cbbL基因表征固碳微生物，選擇引物cbbLR1F（5′-AAG GAY GAC GAG AAC ATC-3′）、cbbLR1intR（5′-TGC AGS ATC ATG TCR TT-3′）以及探針cbbLRpro（5′-CAT GCA YTG GCG CGA CCG-3′），其中，S = C/G，R = A/G，Y = C/T，擴增產(chǎn)物大小約275 bp［16］。

1.3 土壤總DNA提取

土壤樣品充分混合，稱取0.25 g 土壤，采用Qiagen公司的DNeasy? PowerSoil Pro Kit試劑盒按操作說明提取DNA，最后溶于60 μL無菌水，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含cbbL基因質(zhì)粒的構(gòu)建

用cbbLR1F和cbbLR1intR 擴增提取得到的土壤樣品DNA，擴增條件為：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，55℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物連接pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含60 μg/mL氨芐青霉素的LB 固體平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序，序列比對正確的轉(zhuǎn)化子保存菌種并提取質(zhì)粒，獲得陽性質(zhì)粒，命名為pMDcbbL，NanoDrop2000 超微量紫外/可見光分光光度計測定質(zhì)粒濃度。

1.5 定量PCR檢測引物與探針的適用性

將pMD-cbbL質(zhì)粒的質(zhì)量濃度根據(jù)分子量換算成拷貝數(shù)濃度2.31010copies/μL，10 倍稀釋，取拷貝數(shù)濃度2.3100～2.3106copies/μL的pMD-cbbL為模板，以引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro進行實時熒光定量PCR實驗，以評估引物探針的適用性。實時熒光定量PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃、5 min；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min（收集熒光），40 個循環(huán)。

1.6 ddPCR實驗條件的確定

（1）ddPCR檢測cbbL基因。參考BioRad 公司的ddPCR操作使用指南配制反應(yīng)體系（見表1）?；旌暇鶆?，離心除氣泡。將微滴生成卡DG8 放入支架中，用Rainin的20 μL移液器和20 μL吸頭吸取20 μL反應(yīng)液并加入DG8 中間一排孔中，在DG8 下面一排孔中分別加入70 μL微滴生成油，蓋上專用膠墊，放入微滴生成儀生成微滴。待微滴生成后，在微滴發(fā)生卡的上排能看見云霧狀的溶液，這就是生成的油包水微滴。緩慢吸取微滴（約40 μL），轉(zhuǎn)移到專用的96 孔板中。蓋上鋁膜，用預(yù)熱好的封膜儀180 °C、5 s 封膜，放入PCR 儀擴增，擴增程序如表1 所示，全程升降溫速率均小于等于2 °C/s。擴增完成后，讀取微滴信號，用QuantaSoft軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 ddPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

（2）ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。選用pMD-cbbL質(zhì)粒為模板，對ddPCR 反應(yīng)條件進行優(yōu)化，包括退火溫度、探針濃度和引物濃度。優(yōu)化的關(guān)鍵因素是最大限度地提高陰性和陽性微滴分區(qū)之間的熒光振幅，并最小化具有中等熒光強度的微滴數(shù)量。退火溫度設(shè)為62.0、61.2、60.0、58.1、55.8、53.9、52.7、52.0 ℃。在優(yōu)化退火溫度的基礎(chǔ)上，設(shè)置4 組探針濃度進行ddPCR 反應(yīng)，分別為200、250、300、350 nmol/L，每組設(shè)3 個重復(fù)。最優(yōu)退火溫度和探針濃度確定后，設(shè)定上下游引物終濃度600、750、900 nmol/L 進行ddPCR 反應(yīng)，每組設(shè)3 個重復(fù)。

（3）線性范圍和靈敏度實驗。以pMD-cbbL 質(zhì)粒為標準品，10 倍稀釋，取拷貝數(shù)濃度2.3 ×100～2.3 ×106copies/μL 的pMD-cbbL 為模板，采用優(yōu)化的退火溫度、引物濃度和探針濃度進行實驗，評估ddPCR 檢測cbbL基因的線性范圍和檢測靈敏度。

（4）重復(fù)性實驗。將提取的濕地土壤稀釋10 倍后作為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測cbbL基因拷貝數(shù)，設(shè)置21 個重復(fù)，計算變異系數(shù)，以評估該方法的可重復(fù)性。

（5）特異性檢測。以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測pMDcbbL質(zhì)粒、濕地土壤、大腸桿菌、產(chǎn)堿芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、真菌18SrDNA，以雙蒸水代替模板為空白對照，評估ddPCR方法的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針的適用性

用引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro 實時熒光定量PCR 檢測質(zhì)粒pMD-cbbL，結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出，10 倍稀釋的質(zhì)粒樣品間呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，R2= 0.996，擴增效率為94.2%，說明實驗中選用的引物和探針能有效檢測cbbL基因。

圖1 定量PCR檢測cbbL基因的標準曲線

2.2 ddPCR測定cbbL 基因方法的建立和反應(yīng)條件優(yōu)化

（1）ddPCR 方法的微滴數(shù)量控制。ddPCR 的數(shù)據(jù)分析是用QuanatSoft軟件統(tǒng)計陰陽性微滴數(shù)，計算陽性微滴的占比p，由泊松分布計算出每個微滴中所含有的靶基因拷貝數(shù)為-ln（1 -p），再根據(jù)理論微滴總數(shù)計算出靶基因總拷貝數(shù)［10］。為了獲得可靠數(shù)據(jù)，一般微滴總數(shù)需超過10 000，微滴總數(shù)低于10 000 的結(jié)果舍棄。本文中涉及的所有實驗，擴增的微滴總數(shù)均達到10 000 個以上，說明實驗結(jié)果均成立，后續(xù)不再贅述。圖2 所示為梯度稀釋實驗中16 個反應(yīng)（編號1 ～16）的微滴總數(shù)。

圖2 ddPCR檢測cbbL基因生成的微滴總數(shù)

（2）ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。不同退火溫度擴增結(jié)果如表2、圖3 所示。各溫度間測得的質(zhì)粒分子數(shù)有差異，其中52.7 ℃測定的質(zhì)粒分子數(shù)最大，其次是55.8 ℃。PCR 實驗中，退火溫度越高，反應(yīng)的特異性越好。當(dāng)溫度為55.8 ℃時，熒光振幅最大，陽性微滴和陰性微滴分布界限最為明顯。因此，確定反應(yīng)的最佳退火溫度為55.8 ℃。

圖3 退火溫度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果

表2 不同退火溫度下ddPCR檢測的質(zhì)粒分子數(shù)

設(shè)置A05 ～C05、D05 ～F05、G05 ～A06、B06 ～D06的探針濃度分別為200、250、300、350 nmol/L，cbbLddPCR測定結(jié)果如圖4 所示。隨著探針濃度的增加，ddPCR測定的質(zhì)粒濃度逐漸增加，但不同探針濃度測得的質(zhì)?？截悢?shù)差異不顯著（P＞0.05）。200、250、300、350 nmol/L 探針濃度下，ddPCR 檢測的質(zhì)粒分子數(shù)分別為（618. 00 ± 24.17）、（627. 33 ± 22.17）、（629.33 ±50.76）、（634. 67 ±14.08）copies/μL。當(dāng)探針濃度為350 nmol/L 時，熒光振幅最高，陰陽微滴區(qū)分最為明顯。因此，確定反應(yīng)的最佳探針濃度為350 nmol/L。

圖4 探針濃度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果

當(dāng)探針濃度為350 nmol/L 時，設(shè)置A07 ～C07、D07 ～F07、G07 ～A08 的引物濃度分別為900、750、600 nmol/L，cbbL-ddPCR 測定結(jié)果如圖5 所示?？梢姡谒x定的引物濃度范圍內(nèi)，隨著引物濃度降低，ddPCR測定的質(zhì)粒濃度逐漸增加，但差異不顯著（P＞0.05）。900、750、600 nmol/L引物濃度下，ddPCR 檢測的質(zhì)粒分子數(shù)分別為（604.67 ±10.87）、（614.67 ±41.71）、（644. 67 ± 21.97）copies/μL。當(dāng)引物濃度為600 nmol/L時，測得的質(zhì)粒分子數(shù)最高，但熒光振幅低于900、750 nmol/L時。當(dāng)引物濃度為750 nmol/L時，測得的質(zhì)粒濃度較高，熒光振幅最高，陽性微滴和陰性微滴區(qū)分最為明顯。因此，確定反應(yīng)的最佳引物濃度為750 nmol/L。

圖5 引物濃度優(yōu)化cbbL-ddPCR測定結(jié)果

2.3 ddPCR方法的線性范圍和靈敏度

以拷貝數(shù)濃度為2.3 ×100～2.3 ×106copies/μL的pMD-cbbL質(zhì)粒為模板，每個濃度設(shè)置3 個平行實驗，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行ddPCR擴增，結(jié)果如圖6所示。從圖6（a）可以看出，拷貝數(shù)濃度為2.3 ×106copies/μL的樣品，所有微滴都顯示為陽性微滴，無陰性微滴，檢測結(jié)果不可靠，舍去。由圖6（b）可見，其余6 個稀釋度的質(zhì)粒濃度與ddPCR檢測的拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，曲線方程為y= 0.107 7x- 95.562，R2=0.999 7，線性關(guān)系良好，說明建立的cbbL-ddPCR 檢測方法定量結(jié)果可信。該方法的最高定量限為2.3 ×105copies/μL-DNA，最低定量限為2.3 copies/μLDNA。ddPCR實驗靈敏度極高，在20 μL 反應(yīng)液中只要有1 個cbbL基因分子該技術(shù)就能檢測出來，實驗中20 μL 反應(yīng)液中加入2 μL DNA模板，所以該方法的檢出限或者靈敏度為0.5 copy/μL-DNA。

圖6 ddPCR檢測cbbL基因的線性范圍

2.4 ddPCR方法的重復(fù)性

以優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測稀釋10 倍的濕地土壤DNA的cbbL基因拷貝數(shù)，設(shè)置21 個重復(fù)（編號1 ～21）。結(jié)果顯示，21 個重復(fù)的cbbL基因拷貝數(shù)濃度范圍為2 080 ～2 380 copies/μL，組內(nèi)變異系數(shù)為3.92%，說明建立的cbbL-ddPCR檢測方法具有極好的重復(fù)性（見表3、圖7）。

圖7 ddPCR方法的組內(nèi)重復(fù)性實驗

表3 ddPCR方法檢測濕地土壤DNA的重復(fù)性實驗

2.5 ddPCR方法的特異性

用建立的cbbL-ddPCR方法分別對大腸桿菌、產(chǎn)堿芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和真菌18SrDNA 進行檢測，測試該方法的特異性。結(jié)果顯示，除了pMD-cbbL 質(zhì)粒和濕地土壤樣本出現(xiàn)了陽性微滴（分別為5 967 和5 238 個），其他4 個DNA樣本和空白對照均未出現(xiàn)陽性微滴，說明建立的ddPCR 檢測方法對含有cbbL基因的固碳微生物具有較好的特異性（見圖8）。

圖8 ddPCR方法的特異性實驗

3 結(jié) 語

建立了以cbbL基因為靶標的固碳微生物ddPCR檢測方法。通過優(yōu)化得到最佳退火溫度為55.8 ℃，最佳引物與探針濃度分別為750 nmol/L和350 nmol/L。測試結(jié)果表明，該方法靈敏度和重復(fù)性高、特異性好，實現(xiàn)了真正意義上的絕對定量，可用于測定土壤固碳微生物數(shù)量，從而評估土壤碳匯能力。