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    流式細(xì)胞技術(shù)在抗生素抑菌實驗中的應(yīng)用

    2024-05-17 18:03:56蔣海霞
    實驗室研究與探索 2024年4期
    關(guān)鍵詞:象限單胞菌霉素

    蔣海霞, 許 杰

    (上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240)

    0 引 言

    在抗生素抑菌能力研究中,快速檢測靶標(biāo)細(xì)菌的生長或活力狀態(tài)至關(guān)重要[1]。目前檢測細(xì)菌生長和活力的經(jīng)典方法主要是平板抑菌圈法和細(xì)菌細(xì)胞透性檢測法(包括膜電勢測量法和Ca2+濃度測量法等)[2-4]。盡管這些方法比較成熟,但是存在耗時長、誤差大、操作繁瑣等問題,難以滿足抗生素抑菌能力實驗中快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)菌生長狀態(tài)的要求,因此尋找可用于抗生素抑菌檢測的新方法很有必要。

    流式細(xì)胞儀(FCM)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、腫瘤醫(yī)學(xué)和臨床檢驗等領(lǐng)域[5-6]。流式細(xì)胞儀具有靈敏、精確、高效、樣品前處理簡單等優(yōu)勢,可快速采集多參數(shù)數(shù)據(jù)[7]。目前流式細(xì)胞儀在真核細(xì)胞凋亡方面的檢測已經(jīng)比較成熟,可以實現(xiàn)對活細(xì)胞和死細(xì)胞的有效區(qū)分[8]。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞存在固有差異(如細(xì)胞的大小、細(xì)胞壁組成、細(xì)胞核的有無、染色質(zhì)狀態(tài)等),而流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分原核細(xì)胞(如細(xì)菌)生長狀態(tài)方面的研究還相對較少。近年來,隨著各類熒光染料的出現(xiàn)與流式細(xì)胞儀等技術(shù)的發(fā)展,通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光信號來分析細(xì)菌等微生物成為可能。李森[9]通過系統(tǒng)分析影響流式細(xì)胞儀定量檢測結(jié)果的各種因素,優(yōu)化進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣速率、SYBR GreenⅠ和碘化丙啶(PI)染料濃度、染色溫度和染色時間,建立了適用于水環(huán)境樣品細(xì)菌活性分析的快速定量檢測方法。鄧穎[10]通過研究染料熒光團(tuán)SYTO 9 和PI 的細(xì)菌染色特性、染色濃度和染色時間,評估流式細(xì)胞儀定量檢測大腸桿菌活性的效果。以上研究表明,利用流式細(xì)胞技術(shù)可實現(xiàn)細(xì)菌死活狀態(tài)的檢測,但是流式細(xì)胞技術(shù)在抗生素抑菌實驗中的研究幾乎沒有相關(guān)文獻(xiàn)。

    黃單胞菌屬病原細(xì)菌可以侵染超過400 種植物,是我國目前防治的重點病害微生物之一[11]。申嗪霉素(Shenqinmycin)是假單胞菌Pseudomonas 代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-Carboxylic Acid,PCA)的商業(yè)名稱,由上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院與上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司自主研發(fā)、具有廣譜抗菌活性的一種新型微生物源殺菌劑(農(nóng)用抗生素),前期研究表明申嗪霉素在黃單胞菌的防治中起到較好的作用[12-13]。因此,以申嗪霉素對黃單胞菌抑菌效果為例,利用流式細(xì)胞技術(shù)開發(fā)細(xì)菌凋亡的快速檢測方法,尤其精準(zhǔn)分析細(xì)菌的活力狀態(tài),為抗生素等藥物抑菌機理檢測提供支持。

    1 材料與方法

    1.1 申嗪霉素溶液配制和處理時間

    采用甲醇配制申嗪霉素母液(200 mg/mL),以最大水溶度進(jìn)行梯度稀釋:20、2、0.2、0.02 mg/mL,分別加入對數(shù)生長期的黃單胞菌培養(yǎng)液里,1 和2 h后分別取樣檢測。

    1.2 細(xì)菌樣品準(zhǔn)備

    取不同質(zhì)量濃度申嗪霉素、處理1 h和2 h后的黃單胞菌培養(yǎng)菌液,采用分光光度計檢測,在光密度值為1 的基礎(chǔ)上再稀釋10 倍,重懸的菌液顆粒含量為1 ×107個/mL。

    1.3 樣本制備

    樣本采用碧云天Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色處理。按照產(chǎn)品說明書將處理后的細(xì)菌離心,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次,再將試劑盒中組分Annexin-V-FITC 和PI 按照20∶1比例重懸,室溫避光孵育15 min后上機檢測。

    1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測方法及參數(shù)設(shè)置

    本實驗測試儀器是美國Beckman Coulter 公司的Cytoflex流式細(xì)胞儀。

    鑒于原核細(xì)胞的體積較小,設(shè)置反映細(xì)胞直徑大小的前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)的信號值為對數(shù)放大,同時設(shè)置FSC信號閾值為5 ×103。建立雙參數(shù)FSC-A和SSC-A散點圖以及雙參數(shù)FITC-A和PE-A散點圖(硫氰酸熒光素,F(xiàn)ITC;藻紅蛋白,PE;面積,A),采用未經(jīng)染色的對照樣品調(diào)節(jié)光電倍增管電壓,將Annexin-V-FITC和PI分別單獨染色的對照樣品調(diào)節(jié)熒光補償(通過互補矩陣?yán)锏膮?shù)設(shè)置),得到合適的流式細(xì)胞圖。在雙參數(shù)FSC-A 和SSC-A 散點圖中找到細(xì)菌最集中的區(qū)域設(shè)門P1,圈出所需分析的細(xì)菌(見圖1,F(xiàn)SC-A 和SSC-A 表示散射光強度的相對值)。收集1 ×104個細(xì)菌進(jìn)行流式分析。FITC 通道檢測波長為530/30 nm,PE 通道檢測波長為586/15 nm,F(xiàn)ITC 通道收集Annexin-V-FITC 綠色熒光,PE 通道收集PI紅色熒光,獲得FITC-A和PE-A散點圖。

    圖1 基于FSC-A和SSC-A散點圖的細(xì)菌設(shè)門

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對照設(shè)置和染色分析

    在細(xì)菌凋亡早期,細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面,Annexin-V-FITC與之結(jié)合呈現(xiàn)陽性,此時細(xì)胞膜還是完整的,PI 無法穿透細(xì)胞膜染色而呈現(xiàn)陰性;在細(xì)菌凋亡晚期,細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失,Annexin-V-FITC和PI 都可以對細(xì)胞染色而呈現(xiàn)雙陽性;已經(jīng)死亡的細(xì)菌因細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞、Annexin-VFITC無法結(jié)合磷脂酰絲氨酸而呈現(xiàn)陰性,PI可以對細(xì)胞染色而呈現(xiàn)陽性。因此,取未經(jīng)染色的菌體PBS 懸液作為雙陰性對照,經(jīng)申嗪霉素處理(20 mg/mL 處理1 h)的細(xì)菌用Annexin-V-FITC單獨染色作為單陽性對照,質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理30 min 的細(xì)菌用PI 單獨染色作為另一單陽性對照。FITC-A 和PE-A 散點圖(FITC-A 和PE-A 代表熒光強度的相對值)分析結(jié)果表明:未經(jīng)染色雙陰性細(xì)菌位于四象限的左下象限Q1-LL[見圖2(a)],經(jīng)申嗪霉素處理和Annexin-VFITC染色為陽性的細(xì)菌位于四象限的右下象限Q1-LR[見圖2(b)],經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理30 min和PI染色為陽性的細(xì)菌位于四象限的左上象限Q1-UL[見圖2(c)]。結(jié)果表明,流式細(xì)胞技術(shù)能夠較好地區(qū)分凋亡不同階段或不同狀態(tài)的黃單胞菌。

    圖2 對照組的FITC-A和PE-A散點圖分析

    2.2 時間和梯度分析

    為了進(jìn)一步探究流式細(xì)胞儀在檢測黃單胞菌凋亡中的靈敏度和準(zhǔn)確度,采用2 個處理時間和4 個梯度質(zhì)量濃度的雙因素疊加分析(見圖3)。橫向?qū)Ρ炔煌|(zhì)量濃度的抑菌效果。結(jié)果表明:處理1 h 后,隨著申嗪霉素質(zhì)量濃度的逐漸增加(0.02 ~20 mg/mL),Annexin-V-FITC和PI 雙陽性的細(xì)胞位于四象限的右上象限Q1-UR,凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比逐漸增加,從4.30%、6.18%、12.81%增加到20.61%[見圖3(a)~(d)];處理2 h后得到類似的結(jié)論,凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比從18.82%、23.43%,29.64%增加到37.95%[見圖3(e)~(h)]。這表明申嗪霉素質(zhì)量濃度越高,抑菌(黃單胞菌)能力越強。

    圖3 實驗組的FITC-A和PE-A散點圖

    進(jìn)一步兩兩縱向分析相同質(zhì)量濃度和不同處理時間下的效果[見圖3(a)、(e),圖3(b)、(f),圖3(c)、(g),圖3(d)、(h)]。結(jié)果表明:相同申嗪霉素質(zhì)量濃度時,隨著處理時間的增加,Annexin-V-FITC 和PI 雙陽性細(xì)胞凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比相應(yīng)增加,0.02 mg/mL下為4.30% ~18.82%[見圖3(a)、(e)],0.2 mg/mL 下為6.18% ~23.43%[見圖3(b)、(f)],2 mg/mL下為12.81% ~29.64%[見圖3(c)、(g)],20 mg/mL下為20.61% ~37.95%[圖3(d)、(h)]。以上數(shù)據(jù)表明,相同質(zhì)量濃度下,隨著處理時間的延長,申嗪霉素抑菌(黃單胞菌)能力越強。

    3 討 論

    經(jīng)典的平板抑菌圈法檢測申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果難以量化[14-15],而且也難以快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)菌的生長狀態(tài)。本研究基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜完整性和通透性的改變所導(dǎo)致的Annexin-V-FITC和PI染色差異,提出通過流式細(xì)胞技術(shù)建立細(xì)胞凋亡的快速檢測方法,可以有效地解決細(xì)胞凋亡快速檢測問題。

    本研究重點分析時間和濃度雙層因素下,流式細(xì)胞技術(shù)檢測申嗪霉素對黃單胞菌抑制的變化。相同處理時間下,申嗪霉素質(zhì)量濃度越高,凋亡晚期的壞死細(xì)胞越多,但是死亡細(xì)胞的比例(Q1-UL)變化不明顯(見圖3)。以處理時間1 h 和2 h 為例,隨著申嗪霉素質(zhì)量濃度(0.02 ~20 mg/mL)的逐漸增加,Annexin-VFITC陰性而PI 陽性的細(xì)胞位于四象限的左上象限Q1-UL,死亡細(xì)胞百分比變化不明顯(見圖3)。相同申嗪霉素質(zhì)量濃度下,隨著處理時間的增加(1 h 和2 h),死亡細(xì)胞百分比(Q1-UL)明顯增加(見圖3)。本研究進(jìn)一步量化了不同質(zhì)量濃度和不同處理時間下申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果,也為實際用藥量和作用時間提供了數(shù)據(jù)支撐。

    4 結(jié) 語

    流式細(xì)胞儀在動物細(xì)胞研究領(lǐng)域使用頻率很高,但在微生物領(lǐng)域使用較少。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院儀器共享與技術(shù)服務(wù)平臺依托微生物代謝國家重點實驗室,進(jìn)一步拓展了流式細(xì)胞儀在微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用,以期為抗生素等藥物抑菌機理研究檢測技術(shù)提供支持。

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