一測(cè)多評(píng)法測(cè)定茶飲料中咖啡因、茶多酚總量及其5種主要組分的含量

摘 要：目的：建立茶飲料中咖啡因、茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的一測(cè)多評(píng)法。方法：采用HPLC法，以咖啡因?yàn)閮?nèi)參物，計(jì)算茶多酚總量，其余5種多酚物質(zhì)的相對(duì)校正因子，并考察相對(duì)校正因子的穩(wěn)定性，比較外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法對(duì)茶飲料中7個(gè)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果：6種被測(cè)物質(zhì)的相對(duì)校正因子分別為兒茶素0.34、沒食子酸1.41、表兒茶素0.86、表沒食子兒茶素沒食子酸酯0.80、表沒食子兒茶素1.53、茶多酚總量133.91。相對(duì)校正因子在不同含量樣品下的RSD為2.95%～8.78%，均小于10%，穩(wěn)定性良好。一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法所得茶飲料中7個(gè)指標(biāo)的含量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異。結(jié)論：建立的一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確、可靠，可為茶飲料的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：茶飲料；色譜法；一測(cè)多評(píng)；茶多酚；咖啡因

Determination of Caffeine， Total Amount of Tea Polyphenols and Their Five Main Components in Tea Beverages by Using a One Test Multiple Evaluation Method

LI Yuhong， CHEN Jia*， WEI Zhichao， YU Zheyuan

（Zhangye Quality Inspection and Testing Institute， Zhangye 734000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of caffeine， total amount of tea polyphenols， catechin， gallic acid， epicatechin， epicatechin gallate and epicatechin in tea beverages. Method： HPLC was used to calculate the total amount of tea polyphenols and the relative correction factors of other 5 polyphenols， and to investigate the stability of the relative correction factors. The results of 7 indexes in tea beverage were compared between external standard method and one test and multiple evaluation method. Result： The relative correction factors of the 6 tested substances were catechin 0.34， gallic acid 1.41， epicatechin 0.86， epicatechin gallate 0.80， epicatechin 1.53， and total tea polyphenols 133.91， respectively. RSD of relative correction factors in different samples ranged from 2.95% to 8.78%， all of which were less than 10%， indicating good stability. There was no significant difference in the contents of 7 indexes in tea beverages obtained by one test and multiple evaluation method and external standard method. Conclusion： The established method is accurate and reliable， and can provide reference for the quality control of tea beverage.

Keywords： tea beverage; chromatography; one test with multiple evaluations; tea polyphenols; caffeine

茶文化在我國(guó)擁有悠久的歷史和豐富的內(nèi)涵，作為世界上最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)，我國(guó)茶資源十分豐富。隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，茶文化也得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。茶飲料在繼承我國(guó)傳統(tǒng)飲茶文化的前提下，作為一種飲用便捷，同時(shí)兼具傳統(tǒng)茶葉提神解渴功效的飲品，越來越受到消費(fèi)者的青睞。茶飲料一般是指采用茶葉的濃縮液、萃取液、茶粉為主要原料加工而成的飲料，具有茶葉的獨(dú)特風(fēng)味，其含有的茶多酚是重要的生理活性物質(zhì)，有抗氧化、抗癌、降低血糖血壓、防治心血管疾病以及抗衰老等多種保健功能[1-4]。根據(jù)《茶飲料》（GB/T 21733—2008）的規(guī)定[5]，茶飲料按產(chǎn)品風(fēng)味分為調(diào)味茶飲料、茶飲料（茶湯）、復(fù)（混）合茶飲料及茶濃縮液4類，目前市場(chǎng)上主要以調(diào)味茶飲料為主。該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同茶飲料中茶多酚類物質(zhì)總量以及咖啡因含量進(jìn)行了明確的規(guī)定。

茶多酚為混合物[6-7]，最主要的成分是多酚類化合物，還含有兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素等多酚類物質(zhì)。GB/T 21733—2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，茶多酚的測(cè)定采用分光光度法[5]。雖然該方法可以根據(jù)多酚類物質(zhì)與亞鐵離子的特異性顯色反應(yīng)對(duì)茶多酚進(jìn)行定量，但過程較為煩瑣，實(shí)驗(yàn)人員的操作方式、顯色時(shí)間和顯色條件等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生明顯影響，為大量樣品的檢驗(yàn)帶來不便。本文采用液相色譜法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)咖啡因、茶多酚中主要組分兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的定量分析，并找到了其與茶多酚總量間的定量關(guān)系，有效避免了紫外分光光度法帶來的試劑用量大、系統(tǒng)誤差大的弊端，提高了準(zhǔn)確度和檢驗(yàn)效率。

茶飲料中主要生物活性成分為咖啡因和茶多酚，在國(guó)標(biāo)GB/T 21733—2008中也將這兩種主要成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，咖啡因和茶多酚均是由茶葉天然代謝生成的物質(zhì)，所以可以預(yù)見，上述成分間存在相關(guān)性。一測(cè)多評(píng)法（QAMS法）[8]是利用天然樣品不同成分內(nèi)在含量關(guān)系和比例關(guān)系，通過只測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)的其他多個(gè)成分的同步測(cè)定。因此，為了提高茶飲料中茶多酚的分析效率，同時(shí)兼顧檢驗(yàn)成本，本研究嘗試采用一測(cè)多評(píng)法，通過對(duì)茶飲料中茶多酚總量，咖啡因及茶多酚主要組分兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素進(jìn)行定量分析，找到茶飲料中咖啡因與茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素之間存在的關(guān)系，從而得到相對(duì)校正因子，旨在以咖啡因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)物，建立茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的一測(cè)多評(píng)法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

現(xiàn)制現(xiàn)售綠茶飲料，購(gòu)買于本地市場(chǎng)。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品和表沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98%，阿拉丁試劑有限公司；福林酚試劑（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；甲醇（色譜純），上海麥克林；甲酸（色譜純），上海國(guó)藥集團(tuán)；無水乙醇（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水系統(tǒng)（美國(guó)）制得的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜（LC-20AD，配備二極管陣列檢測(cè)器與Labsolution工作站），日本島津；分析電子天平（賽多利斯GL323-1SCN），奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；超聲波清洗機(jī)（HN-30AL），上海漢諾；紫外-可見分光光度計(jì)（I9），海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶多酚總量的測(cè)定

（1）樣品制備。樣品按GB/T 21733—2008附錄A 3.1.2進(jìn)行制備。稱取25 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 95%乙醇，渦旋混勻。靜置15 min后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶并加水定容至刻度線，濾紙過濾后備用。

（2）茶多酚含量測(cè)定。按GB/T 21733—2008附錄A 3.2進(jìn)行測(cè)定。在540 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定試液底色的吸光度和試液顯色后的吸光度。茶多酚總量的計(jì)算公式為

X=（A1-A2）×1.957×2×K×1 000/m（1）

式中：X為樣品中茶多酚含量，mg·kg-1；A1為試液顯色后的吸光度；A2為試液底色的吸光度；1.957為用10 mm比色皿，當(dāng)吸光度等于0.50時(shí)，1 mL茶湯中的茶多酚含量相當(dāng)于1.957 mg；K為稀釋倍數(shù)；

m為測(cè)定時(shí)稱取試液的質(zhì)量，g。

1.3.2 兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的測(cè)定

（1）樣品制備。參照康明艷等[9]的方法，稱取20 g茶飲料于50 mL離心管中，加入80%乙醇稀釋并定容至刻度，渦旋1 min，過0.45 μm濾膜后，作為供試品溶液待用。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精密稱取兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液；分別用經(jīng)過檢定的合適規(guī)格移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL于進(jìn)樣小瓶中，用水稀釋至1 mL，制成5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1、20 μg·mL-1、25 μg·mL-1、30 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的上述組分混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。

1.3.3 HPLC二極管陣列色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；液相色譜柱：安捷倫-USHKB03750-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶冰醋酸∶水=230∶60∶2∶708；流速：1.0 mL·min-1；分析時(shí)間：18 min。

1.3.4 校正因子的確定

相對(duì)校正因子的確定借鑒了王敏等[10]的方法，根據(jù)茶飲料的成分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化以適用本次研究。按照1.3.2～1.3.3外標(biāo)法定量得到咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的濃度；1.3.1紫外法得到茶多酚總量的濃度。以咖啡因（純度≥98%）為標(biāo)準(zhǔn)物（s），建立兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素和茶多酚總量的相對(duì)校正因子（Relative Correlation Factor，RCF）。相對(duì)校正因子的計(jì)算公式為

RCF=Ci/Cs（2）

式中：Ci為相應(yīng)的多酚物質(zhì)的濃度，μg·mL-1；Cs為標(biāo)準(zhǔn)物的濃度，μg·mL-1。

在確定保留時(shí)間穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，采用絕對(duì)含量法，計(jì)算待測(cè)成分與標(biāo)準(zhǔn)物的絕對(duì)含量比值，并以此作為確定校正因子的依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

利用HPLC分析測(cè)定時(shí)，不僅要考慮兒茶素、沒食子酸和咖啡因之間的分離情況，還要考慮樣品中其他成分對(duì)待測(cè)組分的干擾，因此在色譜條件下，應(yīng)選擇合適的流動(dòng)相，使咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素在合理的時(shí)間內(nèi)與樣品中其他組分完全分離[11]。實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相的選擇參照《茶飲料和調(diào)味茶飲料中咖啡因和5種兒茶素類（兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素）含量的測(cè)定 高效液相色譜方法》（DB22/T 1671—2012）[12]，以甲醇-乙腈-冰醋酸-水作為流動(dòng)相，這是因?yàn)楸頉]食子兒茶素沒食子酸酯在甲醇中的穩(wěn)定性較差，24 h后會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他兒茶素類化合物[13]，而乙腈可以減小表沒食子兒茶素沒食子酸酯的降解速度，使表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠分離出來；而冰醋酸可以抑制共聚物的生成，減少樣品中其他組分的干擾，進(jìn)一步改善分離效果。

2.1.2 色譜波長(zhǎng)的選擇

借鑒莫燕霞等[14]的方法，選擇280 nm作為兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的定量波長(zhǎng)。混合標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖1。

2.1.3 線性關(guān)系

取“1.3.2（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的峰面積，用外標(biāo)法進(jìn)行定量，以組分濃度（X）與峰面積（Y）建立線性回歸方程。由表1可知，6種被測(cè)組分在5～100 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.4 重復(fù)性與精密度

按照“1.3.2樣品制備”處理6份樣品溶液，“1.3.3色譜條件”進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，分別計(jì)算咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的峰面積，試驗(yàn)測(cè)定6次。結(jié)果表明，被測(cè)樣品中各組分峰面積的RSD分別為咖啡因4.31%、兒茶素4.36%、沒食子酸3.79%、表兒茶素4.21%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯3.11%、表沒食子兒茶素2.98%，各組分的RSD均≤5.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。根據(jù)樣品中各組分的含量，確定取30 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“1.3.3”色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)量精密度。結(jié)果表明，

6次測(cè)定中各組分峰面積的RSD分別為咖啡因2.04%、兒茶素1.99%、沒食子酸1.79%、表兒茶素2.14%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯2.31%、表沒食子兒茶素1.37%，各組分的RSD均≤5.0%，表明該方法的精密度良好。

2.1.5 回收率與準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取20 g已知各組分含量的茶飲料，加入1 mL濃度為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成相當(dāng)于含本底值基礎(chǔ)上增加100 μg的加標(biāo)樣品，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法對(duì)上述加標(biāo)樣品進(jìn)行處理后，上機(jī)測(cè)量，回收率結(jié)果如表2所示。

由表2可知，各組分的回收率在90.0%～95.0%，平均值為93.2%，各組分回收率在90.0%～105.0%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.2 一測(cè)多評(píng)法的評(píng)價(jià)

2.2.1 相對(duì)校正因子的評(píng)價(jià)

按“1.3.2（1）”項(xiàng)制備4份樣品，定容體積分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL，制成4份不同稀釋倍數(shù)的樣品，測(cè)定咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素；按“1.3.1（1）”項(xiàng)制備4份樣品，定容體積分別為50 mL、100 mL、150 mL和200 mL，制成4份不同稀釋倍數(shù)的樣品，測(cè)定茶多酚總量。按“1.3.4”項(xiàng)方法確定相對(duì)校正因子，考察其不同稀釋倍數(shù)下校正因子的穩(wěn)定性。由表3可知，6種被測(cè)組分的RSD值分別為兒茶素6.35%、沒食子酸2.95%、表兒茶素8.44%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯8.78%、表沒食子兒茶素5.91%、茶多酚總量4.33%；其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的RSD值最大，為8.78%，沒食子酸的RSD值最小，為2.95%，得到各組分的RSD均≤10.0%，說明在不同含量的樣品中，該校正因子具有穩(wěn)定性。

2.2.2 一測(cè)多評(píng)法（QAMS）和傳統(tǒng)方法的比較

如表4所示，15批綠茶飲料樣品（S1～S15）按照傳統(tǒng)方法“1.3.1”項(xiàng)進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算茶多酚含量，“1.3.2～1.3.3”項(xiàng)進(jìn)行分析測(cè)定，分別計(jì)算咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的含量。再對(duì)15批綠茶飲料樣品按照QAMS法進(jìn)行分析測(cè)定，其中標(biāo)準(zhǔn)物咖啡因按“1.3.2～1.3.3”項(xiàng)進(jìn)行分析測(cè)定，其他待測(cè)組分按照QAMS方法進(jìn)行計(jì)算（計(jì)算公式為Ci=RCF×Cs）。兩種方法結(jié)果無明顯差異。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）適用于綠茶飲料中咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素和茶多酚總量的測(cè)定。

3 結(jié)論與討論

3.1 傳統(tǒng)法和一測(cè)多評(píng)法（QAMS）的結(jié)果分析

通過比較兩種方法發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)法存在以下缺點(diǎn)。①對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品可能存在干擾物質(zhì)，使部分組分不能完全分離，而影響測(cè)定結(jié)果。②吸收指數(shù)法對(duì)顯色時(shí)間要求嚴(yán)格，部分樣品本身存在顏色干擾，準(zhǔn)確性不如液相色譜外標(biāo)法定量。因此，選擇QAMS法更加準(zhǔn)確、高效，適合大批量樣品的快速測(cè)定，為茶飲料的市場(chǎng)監(jiān)控帶來便利。

3.2 內(nèi)標(biāo)物、測(cè)定指標(biāo)及檢測(cè)方法的選擇

茶多酚作為混合物，主要包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，其中主要的揮發(fā)性成分兒茶素類化合物占60%～80%，包括兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、沒食子酸和咖啡因等一系列具有相似結(jié)構(gòu)的成分。因表兒茶素沒食子酸酯含量較低，本次研究選擇兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、沒食子酸和咖啡因作為茶多酚含量測(cè)定指標(biāo)。根據(jù)被測(cè)物性質(zhì)，咖啡因相對(duì)更穩(wěn)定，所以選擇咖啡因作為QAMS法的標(biāo)準(zhǔn)物。相對(duì)于紫外分光光度法，采用液相色譜對(duì)上述成分進(jìn)行定量，可以更為準(zhǔn)確、高效地判定綠茶飲料品質(zhì)。

3.3 QAMS法用于茶飲料的質(zhì)量評(píng)價(jià)

本研究以咖啡因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)物，建立5種多酚類物質(zhì)和茶多酚總量的一測(cè)多評(píng)方法，并通過評(píng)價(jià)校正因子的穩(wěn)定性和實(shí)際樣品的測(cè)定，驗(yàn)證了該方法的可行性。研究結(jié)果顯示，各組分相對(duì)校正因子穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%?？梢姼鞒煞值南鄬?duì)校正因子的穩(wěn)定性均較好。

HPLC法與質(zhì)譜法[15]相比，其優(yōu)勢(shì)在于使用了二極管陣列檢測(cè)器，經(jīng)濟(jì)適用性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，適合大范圍推廣，同時(shí)結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器可以測(cè)量光譜的特性，在檢測(cè)中也可以起到輔助定性的作用。

本研究所建立的QAMS法相較于傳統(tǒng)方法[15-16]有以下優(yōu)勢(shì)。①用一種組分作為內(nèi)標(biāo)物去定量分析其他組分，節(jié)省了標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)成本降低。②省去了配制混合標(biāo)準(zhǔn)品過程，不再借助指數(shù)吸收法對(duì)茶多酚總量進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)效率大幅提升。③由計(jì)算多種成分變?yōu)橛?jì)算一種成分，降低了計(jì)算錯(cuò)誤率，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。綜上所述，QAMS測(cè)定綠茶飲料生物活性成分穩(wěn)定性良好，為現(xiàn)制現(xiàn)售綠茶飲料的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有益參考。

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基金項(xiàng)目：2021年度甘肅省市場(chǎng)監(jiān)督管理局重點(diǎn)科研項(xiàng)目（SSCJG-SP-202116）。

作者簡(jiǎn)介：李玉紅（1990—），女，甘肅張掖人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)及品質(zhì)評(píng)價(jià)。

通信作者：陳佳（1990—），女，甘肅張掖人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)及品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail：305117349@qq.com。