基于PS 信號放大策略的SERS 適配體傳感器靈敏檢測恩諾沙星

李岑，王盼雪*，王麗，劉瑩，邢招娣，李國梁

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.譜尼測試集團(tuán)陜西有限公司，陜西西安 710018）

恩諾沙星是一種人工合成的氟喹諾酮類抗生素，通過抑制細(xì)菌DNA 回旋酶的活性，干擾DNA 雙鏈解聚、分割和整合來抑制細(xì)菌的增殖[1]。恩諾沙星在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，主要通過體外注射[2]、飼料投喂[3]和環(huán)境投放[4]等方式用于治療或預(yù)防動物疾病。然而，恩諾沙星在養(yǎng)殖業(yè)中的誤用和濫用，導(dǎo)致其在動物源食品中的殘留量超標(biāo)[5]。研究表明，人體長期攝入恩諾沙星殘留超標(biāo)的食物，輕則引起消化系統(tǒng)功能紊亂，產(chǎn)生過敏反應(yīng)；重則造成肝、腎功能性損傷[6-8]。此外，恩諾沙星也容易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)而影響氟喹諾酮類藥物對人類疾病的治療效果[9-10]。

目前，我國食品中恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是高效液相色譜法[11]，該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長、有機(jī)試劑用量大。近年來，研究人員開發(fā)了多種恩諾沙星的快速檢測方法，如酶聯(lián)免疫法[12]、比色法[13]、電化學(xué)法[14]等。這些快速檢測方法有效縮短了檢測時(shí)間，但存在費(fèi)用高、準(zhǔn)確性差等問題[15]。表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)具有操作簡便、指紋識別、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在抗生素殘留檢測方面發(fā)展前景廣闊[16]。然而，現(xiàn)有的恩諾沙星SERS 檢測方法易受樣品基質(zhì)的干擾，很難實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中恩諾沙星殘留量的準(zhǔn)確、靈敏檢測。因此，本研究利用SERS 技術(shù)結(jié)合磁分離和信號放大策略，開發(fā)一種信號放大型SERS 適配體傳感器，用于動物源食品中恩諾沙星殘留的特異性、高靈敏檢測，以期為動物源食品中抗生素殘留的快速檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-巰基苯甲酸、恩諾沙星（均為分析純）：上海阿拉丁生物科技有限公司；四水合氯金酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鈉、四氫呋喃（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚苯乙烯微球：蘇州知益微球科技有限公司；鏈霉素修飾磁珠：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛奶、豬肉：市售。

Apt 序列：5′-Biotin-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-3′；cDNA 序列：5′-NH2C6-TCC CCC TGA AAT AAC CCG-3′。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式拉曼光譜儀（BWS465-785）：美國B＆W Tek公司；納米粒度及Zeta 電位分析儀（Litesizer 500）：奧地利Anton Paar 公司；紫外可見分光光度計(jì)（Evolution 201）：美國賽默飛世爾科技有限公司；高速離心機(jī)（H1750）：湖南湘儀離心機(jī)有限公司；恒溫振蕩器（THZ-98A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器（MYP11-2A）：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；絞肉機(jī)（JR69）：浙江蘇泊爾生活電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拉曼探針4-MBA@PS@cDNA 的制備

向合成的cDNA 中加入適量無核酸酶水，渦旋混勻，配制100 μmol/L 溶液。分別取20 μL 聚苯乙烯（polystyrene，PS）微球（10%質(zhì)量濃度）與73 μL 去離子水，加入離心管中，渦旋1 min。隨后，加入50 μL 5 mmol/L 4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）的四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）-水溶液，渦旋5 min，使PS 溶脹并吸附4-MBA。吸附完成后，9 000 r/min 離心10 min，去除上清液，并用含有10 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl]與1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）混合緩沖液（pH7.4）洗滌沉淀物3 次，以去除多余的有機(jī)溶劑。隨后，加入40 μL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]（40 mmol/L）、40 μL N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（100 mmol/L）和120 μL 4-嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）（0.1 mol/L，pH6.0，0.5 mol/L NaCl），室溫孵育15 min，激活PS 表面的羧基。8 000 r/min 離心5 min 以除去上清液，向沉淀中加入1 μL 100 μmol/L cDNA 溶液，37 ℃振蕩孵育2 h。反應(yīng)結(jié)束后，棄去上清液，用Tris-HCl緩沖液洗滌并重懸制備的拉曼探針4-MBA@PS@cDNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 捕獲探針MB@Apt 的制備

取15 μL 磁珠（magnetic bead，MB）加入離心管中，磁分離除去上清液，使用Tris 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）（20 mmol/L Tris，0.137 mol/L NaCl，pH7.6）重復(fù)洗滌3 次并重懸于15 μL Tris-HCl 緩沖液中。然后，向MB 中加入1 μL 100 μmol/L Apt 溶液，37 ℃振蕩孵育30 min。孵育完成后，磁分離除去上清液，用Tris-HCl 緩沖液重復(fù)洗滌3 次并重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Au NPs 溶膠的制備

根據(jù)Wang 等[17]的方法制備Au NPs 溶膠。將300 μL HAuCl4·4H2O（1% 質(zhì)量濃度）和30 mL 去離子水加入100 mL 的錐形瓶中。使用磁力攪拌器以1 400 r/min 速度攪拌混合物溶液并快速加熱至沸騰。溶液沸騰后，立即加入質(zhì)量濃度為1%的180 μL 檸檬酸鈉溶液。繼續(xù)攪拌并加熱直至顏色變?yōu)榫萍t色后停止加熱。室溫冷卻后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 SERS 檢測

首先，將32 μL 拉曼探針4-MBA@PS@cDNA 和4 μL 捕獲探針MB@Apt 混合后置于恒溫振蕩器內(nèi)，37 ℃孵育60 min。然后，用Tris-HCl 緩沖液重復(fù)洗滌3 次。隨后，取40 μL 組裝的復(fù)合探針與10 μL 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液混合。37 ℃孵育60 min 后，利用外源磁鐵分離磁珠，收集上清液，并向其中加入40 μL THF 溶脹PS 微球從而釋放拉曼報(bào)告分子。緊接著，向混合物中加入8 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），渦旋5 min 使溶解的聚苯乙烯析出。8 000 r/min離心混合物10 min 后，取出50 μL 上清液與150 μL Au NPs 溶膠充分混勻，取5 μL 混合樣品滴在表面覆有平滑錫紙的玻璃片上，用便攜式拉曼光譜儀采集SERS 光譜。光譜采集條件：激發(fā)波長785 nm，激光功率320 mW，積分時(shí)間5 s，積分次數(shù)3 次。每個(gè)樣品采集5 條代表性SERS 光譜。

1.3.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

將豬肉樣品用絞肉機(jī)充分絞碎。首先，稱取5 g樣品置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入1 mL 不同濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中恩諾沙星的濃度分別為0.015、0.075、0.150 μg/g。隨后，加入20 mL Tris-HCl緩沖溶液，渦旋混勻，并超聲處理30 min。然后，在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、溫度為4 ℃條件下離心5 min。最后，取10 μL 上清液進(jìn)行SERS 檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用InsightMainApp 軟件進(jìn)行紫外吸收光譜數(shù)據(jù)分析，通過Origin 2021 軟件進(jìn)行拉曼光譜數(shù)據(jù)分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。誤差統(tǒng)計(jì)與計(jì)算采用Excel 2021 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號放大型SERS 適配體傳感器檢測恩諾沙星的原理

該研究利用SERS 技術(shù)結(jié)合磁分離和信號放大策略開發(fā)一種高靈敏SERS 適配體傳感器，用于恩諾沙星的快速檢測，原理如圖1 所示。

圖1 信號放大型SERS 適配體傳感器檢測恩諾沙星的原理圖Fig.1 Schematic diagram of detecting enrofloxacin using SERS signal amplification aptasensor

2.2 材料表征

利用紫外可見分光光度計(jì)和納米粒度及Zeta 電位分析儀表征了構(gòu)建的拉曼探針4-MBA@PS@cDNA和捕獲探針MB@Apt，結(jié)果見圖2。

圖2 材料表征結(jié)果Fig.2 Material characterization

如圖1 所示，利用4-MBA、PS 和cDNA 制備信號放大型拉曼探針4-MBA@PS@cDNA，利用生物素標(biāo)記的適配體和鏈霉親和素修飾的磁珠制備捕獲探針MB@Apt。拉曼探針和捕獲探針通過堿基互補(bǔ)配對組裝成復(fù)合探針4-MBA@PS@cDNA-MB@Apt。在沒有恩諾沙星的情況下，復(fù)合探針4-MBA@PS@cDNAMB@Apt 穩(wěn)定存在，樣品經(jīng)磁分離和THF 溶液處理后，上清液中4-MBA 濃度很低，SERS 信號強(qiáng)度弱。當(dāng)目標(biāo)分子恩諾沙星存在時(shí)，恩諾沙星與適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致拉曼探針4-MBA@PS@cDNA 從捕獲探針上釋放。釋放的拉曼探針加入THF 后，可以釋放出大量的4-MBA。因此，可以通過檢測4-MBA 實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中恩諾沙星的特異性靈敏檢測。

由圖2（a）可知，cDNA 修飾4-MBA@PS 后，PS 微球在200 nm 處的特征峰吸光值由0.61 下降至0.52，其原因是PS 微球表面修飾的cDNA 阻礙了PS 微球?qū)ψ贤夤獾奈?，結(jié)果證明了4-MBA@PS@cDNA 的成功制備。由圖2（b）可知，Apt 修飾MB 后，Zeta 電位從2.90 mV 降低至0.13 mV，這是因?yàn)檫m配體中磷酸鹽骨架的負(fù)電荷中和了部分MB 攜帶的正電荷[18]，結(jié)果證明了MB@Apt 的成功制備。

2.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 4-MBA 濃度的優(yōu)化

PS 負(fù)載的拉曼報(bào)告物的量直接影響SERS 適配體傳感器的靈敏度。分別利用1×10-4～1×10-2mol/L 的4-MBA 溶液制備了4-MBA@PS，并采集了經(jīng)THF 處理后上清液的SERS 光譜，結(jié)果見圖3。

圖3 拉曼報(bào)告物4-MBA 濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of the concentration of Raman reporter 4-MBA

由圖3（a）可知，4-MBA 的SERS 信號強(qiáng)度隨其添加量的變化而變化。從圖3（b）可以看出，濃度為1×10-4～1×10-2mol/L 時(shí)，4-MBA 位于拉曼位移1 078 cm-1和1 589 cm-1處特征SERS 信號的強(qiáng)度隨著濃度的增加先升高后趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)楫?dāng)4-MBA 濃度為5×10-3mol/L 時(shí)，單個(gè)PS 微球內(nèi)負(fù)載的4-MBA 達(dá)到飽和，特征峰SERS 信號強(qiáng)度進(jìn)入平臺期。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中將選擇5×10-3mol/L 4-MBA 制備拉曼探針。

2.3.2 制備拉曼探針的THF 與水體積比的優(yōu)化

THF 在PS 微球溶脹和拉曼報(bào)告物擴(kuò)散中起著關(guān)鍵作用。THF 與水的體積比決定了PS 微球的可逆溶脹程度，進(jìn)而影響PS 微球?qū)?-MBA 的負(fù)載能力。試驗(yàn)中采集了THF 與水的體積比為6∶1～14∶1 時(shí)PS 微球吸附和釋放的4-MBA 的SERS 光譜，結(jié)果見圖4。

圖4 制備拉曼探針的THF 與水體積比的優(yōu)化Fig.4 Optimization of the volume ratio of tetrahydrofuran to water used for preparation of Raman probe

從圖4（a）可以看出，4-MBA 位于1 078 cm-1和1 589 cm-1拉曼位移處的SERS 信號強(qiáng)度受到THF 與水體積比的影響。如圖4（b）所示，當(dāng)THF 與水的體積比為10∶1 時(shí)，4-MBA 的SERS 信號強(qiáng)度最高。這很可能是因?yàn)镻S 微球在THF 與水的體積比為10∶1 時(shí)擁有最好的可逆收縮能力，過低的THF 與水的體積比使得PS 微球不能充分溶脹，阻礙其對4-MBA 的吸附過程。而過高的THF 與水的體積比使PS 微球難以從膨脹中收縮，從而導(dǎo)致4-MBA 提前泄漏。因此，THF 與水的體積比為10∶1 是制備4-MBA@PS@cDNA 的最合適條件。

2.3.3 釋放拉曼報(bào)告物的THF 與PBS 的體積比優(yōu)化

自從2016年起，我國健康管理已經(jīng)從經(jīng)典健康管理進(jìn)入了精準(zhǔn)健康管理的新高度。精準(zhǔn)健康管理是運(yùn)用精準(zhǔn)檢測，人工智能，電子健康檔案，動態(tài)檢測及大數(shù)據(jù)分析等，為人們提供精準(zhǔn)健康檢測、評估、分析及預(yù)測的等多種健康管理服務(wù)。這系列的服務(wù)不但需要技術(shù)支持，還需要提供服務(wù)者與接受服務(wù)者相互信任、相互配合、相互溝通才能完成。而高校教師群體文化程度高、相信科學(xué)、敢于嘗試新興事物。因此，對高校退休教師實(shí)施健康管理，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體或群體健康的精準(zhǔn)管理。

THF 在PS 微球溶脹中發(fā)揮著重要作用，不僅影響PS 微球?qū)?-MBA 的吸附，而且影響PS 微球中4-MBA 的釋放。此外，PS 微球在高濃度THF 中會發(fā)生單體間鏈裂解使其聚合度降低，產(chǎn)生的低聚物可溶解于溶劑，降低其對光的透射率，導(dǎo)致SERS 信號降低[19]。研究發(fā)現(xiàn)，PBS 中的Na+和K+可以降低低聚物的溶解度，使其析出，從而降低低聚物對檢測的干擾[20]。這可能是由于Na+和K+帶正電荷，降低了帶負(fù)電荷的低聚物在溶液中的溶解度。本研究比較了THF與PBS 的體積比為6∶1～10∶1 時(shí)上清液中拉曼報(bào)告物的SERS 信號強(qiáng)度，結(jié)果見圖5。

圖5 釋放拉曼報(bào)告物的THF-PBS 體積比的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the volume ratio of tetrahydrofuran to polybutylene succinate used for release of Raman reporter

從圖5 可以看出，在THF 與PBS 的體積比為8∶1時(shí)，SERS 信號強(qiáng)度最高。這可能是由于當(dāng)體積比在6∶1～8∶1 時(shí)，探針釋放的4-MBA 的濃度隨著THF 用量的增加而增加。而當(dāng)體積比在8∶1～10∶1 時(shí)，溶液中的聚苯乙烯的單體無法完全從檢測體系中析出，干擾了SERS 光譜的采集，導(dǎo)致采集的4-MBA 的SERS 信號強(qiáng)度降低。因此，后續(xù)將選擇體積比為8∶1 的THFPBS 體系釋放拉曼探針中的拉曼報(bào)告物。

2.3.4 制備捕獲探針的MB 添加量的優(yōu)化

利用生物素修飾的適配體和鏈霉親和素修飾的磁珠制備了恩諾沙星的特異性捕獲探針MB@Apt。通過比較在0～25 μL 時(shí)不同添加量的MB 與1 μL 100 μmol/L Apt 溶液反應(yīng)后上清液的紫外-可見光吸收光譜圖，優(yōu)化了MB 的添加量，結(jié)果見圖6。

圖6 制備捕獲探針時(shí)磁珠用量的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the amount of magnetic bead used for preparation of capture probe

從圖6（a）可以看出，磁分離后上清液在260 nm處的吸光度隨著MB 添加量的增加而逐漸下降，說明MB 吸附的適配體隨其添加量的增加而增加。由圖6（b）可知，在MB 的加入體積為15 μL 時(shí)，DNA 紫外吸收波長260 nm 處的吸光度略高于對照組，表明Apt充分修飾了MB 并存在少量剩余。為了盡可能提高Apt 的修飾率并降低Apt 的損耗，后續(xù)試驗(yàn)中將選用15 μL 10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）MB 與1 μL 100 μmol/L 的Apt溶液來制備捕獲探針。

2.3.5 樣品與金溶膠增強(qiáng)基底體積比的優(yōu)化

圖7 4-MBA 與Au NPs 體積比的優(yōu)化Fig.7 Optimization of the volume ratio of 4-MBA to Au NPs

從圖7 可以看出，隨著4-MBA 與Au NPs 體積比的增加，4-MBA 的特征SERS 信號強(qiáng)度先升高后降低，在體積比為1∶3 時(shí)特征峰處的SERS 信號強(qiáng)度最高。這可能是因?yàn)樵隗w積比1∶1～1∶3 范圍內(nèi)，Au NPs 的增強(qiáng)效果隨著其占比增大而增強(qiáng)。在1∶3～1∶5 時(shí)，過多的Au NPs 導(dǎo)致檢測體系中4-MBA 濃度降低，SERS 信號強(qiáng)度也隨之降低。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，4-MBA 與Au NPs 的最佳體積比設(shè)定為1∶3。

2.3.6 拉曼探針與捕獲探針體積比的優(yōu)化

拉曼探針4-MBA@PS@cDNA 與捕獲探針MB@Apt的體積比直接影響SERS 適配體傳感器的靈敏度。試驗(yàn)比較了利用不同體積比（1∶3～6∶1）的4-MBA@PS@cDNA與MB@Apt 組裝的復(fù)合探針對1 μmol/L 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)信號，結(jié)果見圖8。

圖8 4-MBA@PS@cDNA 與MB@Apt 體積比的優(yōu)化Fig.8 Optimization of the volume ratio of 4-MBA@PS@cDNA to MB@Apt

由圖8 可知，4-MBA@PS@cDNA 與MB@Apt 體積比在1∶3～4∶1 時(shí)，SERS 信號強(qiáng)度隨著4-MBA@PS@cDNA占比的增加而增強(qiáng)，而隨著4-MBA@PS@cDNA 占比的進(jìn)一步增加，SERS 信號強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定，說明4-MBA@PS@cDNA 與MB@Apt 的體積比為4∶1 時(shí)，捕獲探針結(jié)合的拉曼探針基本飽和。因此，拉曼探針與捕獲探針的體積比為4∶1 是構(gòu)建復(fù)合探針的最佳比例。

2.4 利用建立的信號放大型SERS 適配體傳感器檢測恩諾沙星

為了評價(jià)構(gòu)建的SERS 適配體傳感器的靈敏度和定量性能，在最優(yōu)條件下，利用建立的SERS 適配體傳感器檢測了不同濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，采集的SERS 光譜見圖9。

圖9 信號放大型SERS 適配體傳感器對不同濃度恩諾沙星的檢測結(jié)果Fig.9 Detection of enrofloxacin at different concentrations using SERS signal amplification aptasensor

從圖9 中可以看出，隨著恩諾沙星濃度的增大，4-MBA 位于1 078 cm-1和1 589 cm-1拉曼位移處的SERS信號強(qiáng)度逐漸升高。而且，在1 nmol/L～1 μmol/L 的范圍內(nèi)，4-MBA 在1 078cm-1拉曼位移處的特征SERS 信號強(qiáng)度與恩諾沙星濃度的對數(shù)值具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，線性回歸方程為y=1 209.15x+4 812.83，決定系數(shù)（R2）為0.956 6。利用回歸方程計(jì)算的最低檢出限（limit of detection，LOD）為0.71 nmol/L。以上結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的SERS 適配體傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

2.5 特異性分析

通過比較構(gòu)建的信號放大型SERS 適配體傳感器對恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）和另外3 種氟喹諾酮類抗生素[環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、司帕沙星（sparfloxacin，SPX）、依諾沙星（enoxacin，ENO）]的檢測性能，評估其特異性。結(jié)果見圖10。

圖10 特異性評價(jià)結(jié)果Fig.10 Specificity evaluation

由圖10 可知，建立的SERS 適配體傳感器對ENR的SERS 信號響應(yīng)強(qiáng)度最高，對SPX 和ENO 的幾乎無響應(yīng)，而對CIP 樣品溶液的信號響應(yīng)略高于對照組。推測是由于CIP 和ENR 具有相似的喹啉結(jié)構(gòu)，即ENR 分子中喹啉的7 號位的哌嗪基對位上的氫原子被乙基取代，CIP 則是完整的喹啉環(huán)，導(dǎo)致ENR 適配體對CIP 也表現(xiàn)出了較低的識別性。

2.6 穩(wěn)定性與重現(xiàn)性分析

通過采集在4 ℃保存0～30 d 的復(fù)合探針與1 μmol/L ENR 反應(yīng)的SERS 光譜評價(jià)了該方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖11。

圖11 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性分析Fig.11 Stability and reproducibility

從圖11（a）可以看出，低溫儲存2～10 d 的復(fù)合探針在拉曼位移1 078 cm-1和1 589 cm-1處的SERS 信號強(qiáng)度沒有明顯差異。對兩個(gè)特征峰處的SERS 強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明15 d 后特征峰SERS 信號強(qiáng)度分別降低15.38%和15.62%，30 d 后分別降低22.89%和23.90%。說明SERS 適配體傳感器在0～10 d 內(nèi)仍能保持良好的穩(wěn)定性，但長期儲存會導(dǎo)致SERS 傳感器靈敏度下降。其原因是長時(shí)間儲存使PS 微球負(fù)載的4-MBA 提前泄露，從而導(dǎo)致SERS 響應(yīng)強(qiáng)度降低。此外，試驗(yàn)還比較了3 個(gè)獨(dú)立批次共計(jì)15 組的復(fù)合探針用于檢測濃度為1 μmol/L 的恩諾沙星溶液的SERS光譜圖。從圖11（b）可以看出，不同樣品的SERS 光譜沒有明顯差異，說明所建立的信號放大型SERS 適配體傳感器檢測恩諾沙星具有較高的重現(xiàn)性。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

通過對牛奶和豬肉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，評價(jià)了所建立的信號放大型SERS 適配體傳感器對實(shí)際樣品中恩諾沙星的檢測性能。在最優(yōu)條件下，檢測了恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液添加濃度為0.015、0.075、0.150 μg/g 的牛奶和豬肉樣品。SERS 光譜圖見圖12，檢測結(jié)果見表1。

表1 牛奶和豬肉中恩諾沙星的檢測結(jié)果Table 1 Detection of enrofloxacin in milk and pork

圖12 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Fig.12 Spiked recovery

由表1 可知，該傳感器檢測牛奶和豬肉中恩諾沙星的回收率為86.67%～128.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～1.3%（n=3）。以上結(jié)果表明，所建立的信號放大型SERS 適配體傳感器對于動物源中恩諾沙星含量的測定具有較高的準(zhǔn)確度和良好的穩(wěn)定性，為食品中抗生素殘留的快速檢測提供了新思路。

3 結(jié)論

本研究利用PS 微球的可控溶脹性能，制備了信號放大型拉曼探針，通過Apt 和cDNA 互補(bǔ)雜交將磁性捕獲探針和信號放大型拉曼探針組裝為復(fù)合探針，結(jié)合SERS 技術(shù)，建立了一種高靈敏SERS 適配體傳感器，用于動物源食品中恩諾沙星的快速檢測。當(dāng)恩諾沙星存在時(shí)，恩諾沙星與捕獲探針特異性結(jié)合，釋放出拉曼探針，溶脹拉曼探針釋放出拉曼報(bào)告物4-MBA。在最佳的試驗(yàn)條件下，4-MBA 位于1 078 cm-1拉曼位移處SERS 信號強(qiáng)度與恩諾沙星濃度的對數(shù)值在1～100 nmol/L 時(shí)存在良好的線性相關(guān)關(guān)系，R2為0.956 6，LOD 為0.71 nmol/L。該方法檢測牛奶和豬肉中恩諾沙星的加標(biāo)回收率為86.67%～128.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～1.3%（n=3）。此外，本研究制備的復(fù)合探針穩(wěn)定性好，可以在1.5 h 內(nèi)完成恩諾沙星的定量檢測。因此，本研究建立的PS 微球介導(dǎo)的信號放大型SERS 適配體傳感器檢測恩諾沙星靈敏度高、特異性好，為動物源食品中抗生素殘留的檢測提供了新的思路。