磷蝦油中有機(jī)砷脫除工藝優(yōu)化

方素瓊，朱東奇，林錦淮，楊繼國(guó)，3，4*

（1.仙樂(lè)健康科技股份有限公司，廣東汕頭 515041；2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東東莞 523808；3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室河源分中心，廣東河源 517000）

南極磷蝦油富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等對(duì)人體存在重要生理功能的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，其能調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝、預(yù)防心腦血管疾病、抗癌、降低體脂肪過(guò)度積累、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高幼體的成活率[1-3]，磷蝦油中DHA 和EPA 主要結(jié)合在磷脂上[4-6]，磷蝦油中磷脂型的DHA 和EPA 生物利用度高于甘油三酯型和乙酯型[7-9]，磷蝦油中還含有天然類胡蘿卜素、蝦青素[10-11]。考慮到磷蝦油中不飽和脂肪酸易氧化及蝦青素受熱易分解等特性，磷蝦油的加工應(yīng)盡量控制在較低溫度條件下進(jìn)行。亞臨界流體技術(shù)具有工作壓力低、工作溫度相對(duì)較低、運(yùn)作環(huán)境為真空狀態(tài)、溶劑易回收等特點(diǎn)，適于進(jìn)行磷蝦油脫砷工藝，可以對(duì)磷蝦油中熱敏性強(qiáng)、易氧化等的成分進(jìn)行保護(hù)[12-17]，而且，亞臨界狀態(tài)下的分子擴(kuò)散性能增強(qiáng)，傳質(zhì)速度加快[18-19]。

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，海水中砷含量增加，南極磷蝦又以海中浮游動(dòng)植物為食，這也導(dǎo)致其體內(nèi)的砷越來(lái)越多，且后續(xù)加工時(shí)也會(huì)在不同程度上使砷進(jìn)一步被富集，因此南極磷蝦制品尤其是南極磷蝦油中總砷含量較高。南極磷蝦中的砷主要是有機(jī)砷，對(duì)磷蝦油中砷形態(tài)分析可知，磷蝦油中無(wú)機(jī)砷主要為砷酸[arsenic acid，As（Ⅲ）]和亞砷酸[arsenious acid，As（Ⅴ）]，有機(jī)砷主要為砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）、一甲基砷（monomethylarsonic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsinic，DMA）砷糖和砷脂。砷甜菜堿是一種親水雙離子型四元烷基砷化合物，占總砷含量90%左右[20-22]，同時(shí)，磷蝦油中還含有一些脂溶性有機(jī)砷[23]。

目前，關(guān)于南極磷蝦精深加工的研究多集中于磷蝦油的提取、精煉、南極磷蝦中氟的脫除，或重點(diǎn)研究砷形態(tài)，而對(duì)磷蝦油中砷脫除方法鮮有研究[24]?；钚蕴炕瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，孔隙結(jié)構(gòu)豐富，比表面積大，吸附能力強(qiáng)，價(jià)格便宜[25]，現(xiàn)有研究表明，可利用活性炭吸附除去水體中的重金屬[26-27]。本研究以不含無(wú)機(jī)砷的南極磷蝦油為原料，選用椰殼活性炭吸附和水為脫除劑，對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷進(jìn)行脫除，以期為今后磷蝦油多種方式相結(jié)合脫除有機(jī)砷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷蝦油：青島康鏡海洋生物科技有限公司[總砷含量：（4.10±0.11）mg/kg，無(wú)機(jī)砷含量：未檢出]；椰殼活性炭：深圳市興萬(wàn)邦活性炭有限公司；正己烷、丙三醇、1，2-丙二醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；硝酸、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁烷（分析純）：佛山市科的氣體化工有限公司；砷（標(biāo)準(zhǔn)品）：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

BS201S Sartorius 精密天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；TGL20 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；700X 電感耦合等離子質(zhì)譜儀（IPC-MS）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；JTWB-16 密閉式智能微波消解儀：上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；CBE-1L 型亞臨界流體萃取設(shè)備（丁烷溶劑，1L 定制款）：河南亞臨界萃取技術(shù)有限公司；5GV-3-K 攪拌機(jī)：香港松下電機(jī)集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 磷蝦油中有機(jī)砷的脫除單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 脫除劑對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響

稱取100 g 磷蝦油置于亞臨界萃取罐內(nèi)，在脫砷溫度為45 ℃、脫砷時(shí)間為3 h 條件下，考察脫除劑單獨(dú)使用和同時(shí)使用對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響。設(shè)置只添加椰殼活性炭（添加量3%）、只添加水（添加量30%）、同時(shí)加入3% 椰殼活性炭和30% 水（各添加量均以磷蝦油計(jì)），關(guān)閉進(jìn)料口，抽真空至-0.1 MPa，加入丁烷溶劑，打開攪拌機(jī)攪拌至3 h 后停止攪拌，靜置，待分層后，將上層溶劑相通過(guò)管道輸送至溶劑回收罐內(nèi)，回收丁烷溶劑，用正己烷洗出萃取罐中的混合物，過(guò)濾除去吸附劑，除水，回收正己烷，得到除砷后的磷蝦油，檢測(cè)總砷含量，計(jì)算脫砷率。

1.3.1.2 脫砷溫度對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響

設(shè)置脫砷溫度為35、40、45、50、55 ℃，同時(shí)加入3%椰殼活性炭和30%水，后續(xù)處理參考1.3.1.1，考察不同脫砷溫度對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響.

1.3.1.3 椰殼活性炭添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響

設(shè)置脫砷溫度為45 ℃，加入30%水，再分別加入3%、5%、7%、9%、11% 椰殼活性炭，后續(xù)處理參考1.3.1.1，考察椰殼活性炭添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷的脫除的影響。

1.3.1.4 水添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響

設(shè)置脫砷溫度為45 ℃，加入9% 的活性炭，再分別加入25%、30%、35%、40%、45%、50% 水，后續(xù)處理參考1.3.1.1，考察水添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷的脫除的影響。

1.3.1.5 脫砷時(shí)間對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響

設(shè)置脫砷溫度為45 ℃，同時(shí)加入9%椰殼活性炭和40%水，脫砷時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，后續(xù)處理參考1.3.1.1，考察脫砷時(shí)間對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷的脫除的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考慮磷蝦油中含有熱敏性、易氧化等物質(zhì)，為確保磷蝦油脫砷后的品質(zhì)，脫砷溫度不宜過(guò)高，因此選取椰殼活性炭添加量（A）、水添加量（B）、脫砷時(shí)間（C）作為變量，脫砷率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.3 磷蝦油有機(jī)砷脫除率的計(jì)算

總砷的測(cè)定參照GB 5009.11—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》中的方法進(jìn)行測(cè)定。磷蝦油經(jīng)檢測(cè)，無(wú)機(jī)砷含量未檢出，為0 mg/kg，總砷含量即為有機(jī)砷含量。有機(jī)砷脫砷率（T，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為初始磷蝦油中總砷含量；At為脫除后磷蝦油中總砷含量，mg/kg。

1.3.4 有機(jī)砷脫除前后磷蝦油質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

色澤、透明度參考GB/T 5525—2008《植物油脂透明度、氣味、滋味鑒定法》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

磷脂含量參考GB/T 5537—2008《糧油檢驗(yàn)磷脂含量的測(cè)定》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

酸價(jià)參考GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價(jià)的測(cè)定》中的第二法進(jìn)行測(cè)定。

過(guò)氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》中的第一法進(jìn)行測(cè)定。

DHA、EPA 含量參考GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》中的第一法進(jìn)行測(cè)定。

蝦青素含量參考美國(guó)藥典《磷蝦油》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Design-Expert 13 進(jìn)行分析處理。運(yùn)用Design-Expert 13 進(jìn)行響應(yīng)面圖表繪制，其他圖表使用Origin 8.5 及Excel 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 脫除劑對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響結(jié)果

脫除劑對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的結(jié)果如圖1 所示。

圖1 脫除劑對(duì)磷蝦油脫有機(jī)砷的影響Fig.1 Effect of removal agent on removal of organic arsenic in krill oil

由圖1 可知，椰殼活性炭+水組、水組、椰殼活性炭組的脫砷率依次為32.43%、20.97% 和9.76%，椰殼活性炭與水同時(shí)使用脫砷效果最佳。于樹芳[26]、鐘福隆等[27]研究表明，活性炭可用于砷的脫除；砷甜菜堿是磷蝦油中有機(jī)砷的主要物質(zhì)，具有親水性[22]，水能脫砷可能是砷甜菜堿溶解于水中后被脫除，考慮到磷蝦油中砷的形態(tài)及脫除難度[23]，后續(xù)試驗(yàn)采用椰殼活性炭和水同時(shí)添加進(jìn)行脫除。

2.1.2 脫砷溫度對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響結(jié)果

脫砷溫度對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響如圖2所示。

圖2 脫砷溫度對(duì)磷蝦油脫有機(jī)砷的影響Fig.2 Effect of arsenic removal temperature on organic arsenic removal in krill oil

由圖2 可知，磷蝦油中有機(jī)砷的脫砷率隨著脫砷溫度的升高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)脫砷溫度為45 ℃時(shí)，有機(jī)砷脫砷率為32.43%，主要原因是活性炭隨著脫砷溫度的增加，導(dǎo)致吸附能力減弱，這與活性炭的吸附動(dòng)力學(xué)一致[26，28]。因此，選擇脫砷溫度為45 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 椰殼活性炭添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響結(jié)果

椰殼活性炭添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響如圖3 所示。

圖3 椰殼活性炭添加量對(duì)磷蝦油有機(jī)砷脫除的影響Fig.3 Effect of addition of coconut shell-activated carbon on removal of organic arsenic in krill oil

由圖3 可以看出，當(dāng)椰殼活性炭的添加量從3%增加至9%時(shí)，磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率從32.43%升至46.34%，繼續(xù)增加椰殼活性炭添加量，磷蝦油中有機(jī)砷不再減少，考慮到磷蝦油中有機(jī)砷存在多種形態(tài)，尤其還含有脂溶性有機(jī)砷，吸附脫除難度大，活性炭可能只會(huì)吸附某些形態(tài)的有機(jī)砷，當(dāng)可吸附形態(tài)的有機(jī)砷被吸附后，其他形態(tài)的有機(jī)砷因無(wú)法被吸附，隨著活性炭添加量過(guò)多，使得顆粒堆積并造成吸附位點(diǎn)的重疊與聚集，導(dǎo)致活性炭的總活性位點(diǎn)減少?gòu)亩鴮?dǎo)致吸附量減少[29]，所以無(wú)法進(jìn)一步將磷蝦油中其他形態(tài)的有機(jī)砷脫除。因此，選擇椰殼活性炭添加量7%、9%、11%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 水添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響結(jié)果

水添加量對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響如圖4所示。

圖4 水添加量對(duì)磷蝦油有機(jī)砷脫除的影響Fig.4 Effect of water addition on removal of organic arsenic in krill oil

由圖4 可知，隨著水添加量的增加，磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率升高，當(dāng)水添加量為40% 時(shí)，磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率達(dá)到58.39%，繼續(xù)增加水添加量，有機(jī)砷脫砷率不會(huì)繼續(xù)增高，這主要原因可能是磷蝦油中砷甜菜堿已經(jīng)溶解至水中，其他形態(tài)的有機(jī)砷，尤其是脂溶性的有機(jī)砷無(wú)法溶解至水中[23]，導(dǎo)致脫砷率不增加，因此，選擇水添加量35%、40%、45% 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.5 脫砷時(shí)間對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響結(jié)果

脫砷時(shí)間對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除的影響如圖5所示。

圖5 脫砷時(shí)間對(duì)磷蝦油有機(jī)砷脫除的影響Fig.5 Effect of arsenic removal removal time on removal of organic arsenic in krill oil

由圖5 可知，隨著脫砷時(shí)間的延長(zhǎng)，磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率升高，當(dāng)脫砷時(shí)間到5 h 后，脫砷率增加緩慢，一方面，可溶于水中的有機(jī)砷已經(jīng)被最大程度地溶解至水中，另一方面，活性炭吸附位點(diǎn)已經(jīng)被占領(lǐng)，導(dǎo)致有機(jī)砷無(wú)法進(jìn)一步被吸附，或者其他形態(tài)的有機(jī)砷無(wú)法溶解于水或無(wú)法被活性炭吸附，使整個(gè)脫砷過(guò)程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[27]。因此，選擇脫砷時(shí)間4、5、6 h 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 磷蝦油有機(jī)砷脫除響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)1.3.2 和Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了三因素三水平試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 建立回歸模型及方差分析

根據(jù)表2 的結(jié)果，利用Design-Expert 13 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，所得回歸方程為Y=68.39+1.60A+2.85B+3.04C+0.0250AB+1.18AC-0.1550BC-1.30A2-3.03B2-4.02C2。

對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除試驗(yàn)的回歸方程模型進(jìn)行方差分析，并檢驗(yàn)其模型系數(shù)的顯著性，其結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface model

由表3 可知，回歸模型P值＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.774 3，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明回歸模型良好。另外得出模型的決定系數(shù)R2=0.993 7，調(diào)整后決定系數(shù)R2Adj=0.985 5，表示回歸模型與預(yù)測(cè)值之間的擬合度好，在試驗(yàn)條件范圍內(nèi)能明確反映脫砷率的變化，因此可以利用上述方程模型對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷最優(yōu)脫除工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)中A、B、C，二次項(xiàng)中A2、B2、C2影響均極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)中AC影響顯著（P＜0.05），以及由F值大小可判斷出3 個(gè)單因素對(duì)脫砷率的影響順序?yàn)镃（脫砷時(shí)間）＞B（水添加量）＞A（椰殼活性炭添加量）；交互項(xiàng)影響大小為AC＞BC＞AB；二次項(xiàng)影響大小為C2＞B2＞A2。

2.2.3 響應(yīng)面分析

椰殼活性炭添加量、水添加量和脫砷時(shí)間的交互作用對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率的影響如圖6 所示。

圖6 因素間交互作用對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷脫除影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface diagram and contour diagram of interactions between factors on removal of organic arsenic in krill oil

圖6 反映了椰殼活性炭添加量、水添加量和脫砷時(shí)間相互作用對(duì)磷蝦油有機(jī)砷脫除的影響。在等高線圖中，如果兩個(gè)因素之間的交互作用較弱，則等高線更接近圓形；如果交互作用較強(qiáng)，則等高線更接近橢圓形。在響應(yīng)面圖中，如果曲面較陡峭，則響應(yīng)值的變化幅度較大，表明兩個(gè)因素之間的交互作用較強(qiáng)。磷蝦油有機(jī)砷脫砷率在三因素所設(shè)定的水平范圍內(nèi)均存在最高值。

2.2.4 最優(yōu)組合和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)模型預(yù)測(cè)，得到磷蝦油有機(jī)砷脫除的最佳工藝條件為椰殼活性炭添加量9.81%、水添加量39.25%、脫砷時(shí)間5.49 h，在此工藝條件下磷蝦油有機(jī)砷脫除率為68.71%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將最優(yōu)方案調(diào)整為活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脫砷時(shí)間5.5 h，在上述條件下測(cè)定有機(jī)砷脫砷率，重復(fù)5 次，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 磷蝦油中有機(jī)砷脫除最優(yōu)組合驗(yàn)證重復(fù)試驗(yàn)Fig.7 Repetitive verification of optimal combination of organic arsenic removal in krill oil

由圖7 可知，利用椰殼活性炭吸附同時(shí)加上水溶解脫除磷蝦油中有機(jī)砷，磷蝦油中的有機(jī)砷脫砷率達(dá)到（68.68±0.91）%，與預(yù)測(cè)值相近，重復(fù)性好，表明該模型達(dá)到預(yù)期效果，具有可行性。

2.3 磷蝦油有機(jī)砷脫除前后主要質(zhì)量指標(biāo)

脫除前后磷蝦油的主要質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果見表4。

表4 磷蝦油有機(jī)砷脫除前后質(zhì)量指標(biāo)Table 4 Quality indexes before and after removal of organic arsenic in krill oil

由表4 可知，利用椰殼活性炭與水同時(shí)添加的方式脫除磷蝦油中有機(jī)砷，脫除后磷蝦油樣品各項(xiàng)主要質(zhì)量指標(biāo)與脫除前沒(méi)有明顯變化，主要指標(biāo)磷脂和蝦青素并未因處理而有所損失，說(shuō)明在亞臨界流體丁烷體系下，對(duì)磷蝦油中的一些敏感物質(zhì)存在保護(hù)作用。

3 結(jié)論

本研究以不含無(wú)機(jī)砷的磷蝦油為原料，以有機(jī)砷脫的砷率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，得到最優(yōu)脫除有機(jī)砷的工藝條件為椰殼活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脫砷時(shí)間5.5 h。在最佳條件下，磷蝦油中有機(jī)砷由初始的4.10 mg/kg 降低至1.28 mg/kg。通過(guò)試驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，磷蝦油中有機(jī)砷脫砷率為68.68%，對(duì)脫砷前后磷蝦油主要質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，磷脂、蝦青素含量、酸價(jià)、過(guò)氧化值等指標(biāo)沒(méi)有明顯變化。本研究選用椰殼活性炭和水作為脫除劑、同時(shí)添加的方式，在不破壞磷蝦油主要質(zhì)量指標(biāo)前提下，可以對(duì)磷蝦油中有機(jī)砷進(jìn)行穩(wěn)定脫除，為磷蝦油中有機(jī)砷的脫除提供參考依據(jù)。