東紫蘇精油對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成脂分化的影響及機(jī)制

張夢(mèng)媛，徐芳，柏樺，鄒偉，劉曉穎，王琦

（昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南昆明 650500）

肥胖癥（obesity）是由于能量攝取與消耗之間的不平衡而導(dǎo)致的可損害健康的異?；蜻^(guò)多的脂肪積累，脂質(zhì)代謝障礙可導(dǎo)致肥胖[1]。脂質(zhì)代謝異常也與某些疾病密切相關(guān)，如動(dòng)脈硬化、糖尿病、肥胖、老年癡呆癥（Alzheimer′s disease，AD）以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，天然植物中提取的活性成分如茶葉中多酚類化合物[3]、小?？Х戎锌Х纫騕4]、苦蕎黃酮[5]、槲皮素[6]等都有減脂功效，其成為減脂功能食品開發(fā)的重要研究方向。

東紫蘇（ElsholtizabodinieriVaniot），屬于唇形科（Lamiaceae）香薷屬（Elsholtzia）植物[7]，別名鳳尾茶、小山茶、云松茶、牙刷草、野山茶等，是源自云南的特色藥食兩用資源，滇南地區(qū)居民常將東紫蘇泡水作為一種日常飲用的茶類飲料，認(rèn)為其可以祛除火氣。東紫蘇含精油、黃酮類、三萜類、酚類等成分[8]，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病原微生物、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙攣、增強(qiáng)免疫力等功效[9]。東紫蘇精油作為其中的主要活性物質(zhì)之一，生物活性研究報(bào)道較少。課題組前期優(yōu)化提取條件并確定東紫蘇精油成分后，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲參與脂肪酸代謝的9 個(gè)基因發(fā)生了變化，其中D2063-1、acs-2、sodh-1、sodh-2、alh-5、acdh-76 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，acdh-1、F25C8-1、acox-533 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，改變的基因隸屬于NHR49 脂肪酸分解代謝通路[10]。為進(jìn)一步證明東紫蘇精油的減脂效果，本研究以C3H10T1/2 成脂細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討東紫蘇精油對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響和作用機(jī)理，以期為東紫蘇的食物開發(fā)和藥用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2：中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。干燥東紫蘇：云南省紅河州建水縣。東紫蘇精油由本實(shí)驗(yàn)室提取[東紫蘇全草打碎，過(guò)100 目篩，提取條件：料液比1∶6（g/mL）、浸泡2 h、600 W 微波無(wú)溶劑提取1 h]。

奧利司他：北京索萊寶科技有限公司；四季青無(wú)支原體優(yōu)級(jí)胎牛血清、蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液、0.25%胰酶：大連美侖生物技術(shù)有限公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、牛胰島素、地塞米松、羅格列酮、3，3′，5 三碘代-L-甲狀腺原氨酸（3，3′，5-triido-L-thyronine，T3）、吲哚美辛、谷氨酸酰胺、丙酮酸鈉溶液、非必需氨基酸：美國(guó)Sigma 公司；油紅O、MTT、最低必須培養(yǎng)基（minimum essentiamedium，MEM）培養(yǎng)液：武漢賽維爾生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triacylglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒、總RNA 抽提試劑（total RNA extraction reagent，TRizol）：南京建成生物工程研究所；SYBRPremixEXTaqⅡ：美國(guó)MCE 公司；cDNA 第1 鏈合成試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxideproliferator-activated receptorγ，PPARγ）兔抗、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer-bindingproteinsα，C/EBPα）兔抗、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fattyacid-bindingprotein4，F(xiàn)ABP4）兔抗、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗：山東華安科技生物有限公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）上游引物及下游引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nikon TS2R 研究級(jí)熒光倒置顯微鏡：日本尼康公司；Amersham GE 超靈敏多功能成像儀：美國(guó)GE 公司；LC96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀：瑞士Roche 公司；Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)寶特公司；DryDIST 植物精油提取儀：意大利milestone 公司；5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)

1）C3H10T1/2 細(xì)胞培養(yǎng)：將含有10%胎牛血清及谷氨酸酰胺、丙酮酸鈉100 mmol/L 溶液、非必需氨基酸的MEM 培養(yǎng)基置于37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化傳代。

2）C3H10T1/2 細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C3H10T1/2 細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)，5×104個(gè)/mL 接種，分為空白對(duì)照組、高脂模型組、精油處理組、陽(yáng)性對(duì)照奧利司他組，生長(zhǎng)5 d 中間不換液，第6 天空白對(duì)照組換培養(yǎng)液，剩余組加入誘導(dǎo)液I 液（含0.5 mol/L IBMX、2.5 mmol/L 地塞米松、344.38 μmol/L 胰島素、1mmol/L羅格列酮、30.72 μmol/L T3、125 μmol/L 吲哚美辛）培養(yǎng)2 d，第8 天空白對(duì)照組換培養(yǎng)液，剩余組換誘導(dǎo)液II 液（含344.38 μmol/L 胰島素、1 mmol/L 羅格列酮、30.72 μmol/L T3），繼續(xù)培養(yǎng)2 d，第10 天空白對(duì)照組換培養(yǎng)液，剩余組再次換誘導(dǎo)液II 液培養(yǎng)2 d，第12 天空白對(duì)照組、高脂模型組換培養(yǎng)液，精油處理組加含不同濃度精油的培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加含奧利司他的培養(yǎng)液，均處理48 h（成脂誘導(dǎo)劑包括誘導(dǎo)I、II液，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行配制）。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

1）東紫蘇精油、奧利司他對(duì)細(xì)胞增殖的影響：C3H10T1/2 細(xì)胞以1×104/mL 的密度、200 μL/孔接種于96 孔板，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度（0、100、200、400、800、1 600 μg/mL）的東紫蘇精油和不同濃度（0、1、5、25、125、625 μg/mL）的奧利司他繼續(xù)培養(yǎng)，各組3 個(gè)復(fù)孔，48 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT 孵育4 h，棄MTT，加入150 μL 二甲基亞砜（methyl sulfoxide，DMSO）低速振蕩10 min，在570 nm 波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，細(xì)胞存活率（X，%）計(jì)算公式如下。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)孔吸光度；A0為對(duì)照孔吸光度。

2）油紅O 染色分析：細(xì)胞經(jīng)上述方法誘導(dǎo)處理后棄上清，預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2～3 次，用4% 多聚甲醛固定液室溫下固定15 min，PBS 洗2～3 次。60%異丙醇通透30～60 s，PBS洗2～3 次，加油紅O 染液于室溫下避光染色30 min，PBS 洗2～3 次，拍照記錄分析。

3）甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）測(cè)定：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兩種細(xì)胞按5×104個(gè)/mL 接種于6 孔板，成脂誘導(dǎo)后加精油、奧利司他處理48 h，棄培養(yǎng)液后用PBS 洗2～3 次，每孔加入200 μL 裂解液并將細(xì)胞從培養(yǎng)板上刮下（以上操作在冰上進(jìn)行），超聲破碎勻漿后以2 000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的微量離心管（eppendorf micro test tubes，EP）中待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定甘油三酯、總膽固醇含量。

4）熒光定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)：培養(yǎng)方法同3），按照試劑盒說(shuō)明書步驟抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照試劑盒說(shuō)明書要求，反應(yīng)體系：上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 模板2 μL、ddH2O 6 μL、SYBRPremixEXTaqⅡ10 μL。94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，50～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。每組樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，2-ΔΔCt計(jì)算各基因轉(zhuǎn)錄水平差異。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

5）Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)處理一定時(shí)間后，加入含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）法檢測(cè)總蛋白濃度。蛋白上樣十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）后，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，無(wú)蛋白酶快速封閉液封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光液顯影，掃描成像保存分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPadPrism5.0 和SPSS17.0 兩種軟件，采用單因素方差分析組間差異，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞存活率的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)測(cè)不同濃度精油、奧利司他對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 東紫蘇精油、奧利司他對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of essential oil from Elsholtiza bodinieri Vaniot and orlista on survival of C3H10T1/2 cells

由圖1 可知，精油及奧利司他濃度分別小于100 μg/mL 和25 μg/mL 時(shí)，對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞的增殖活性與空白對(duì)照組相比幾乎沒(méi)有影響（P＞0.05）；但濃度為200～1 600 μg/mL 的精油，125～625 μg/mL 奧利司他能降低C3H10T1/2 細(xì)胞的存活率且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。因此，選擇25、50、100 μg/mL 精油，25 μg/mL奧利司他進(jìn)行后續(xù)C3H10T1/2 細(xì)胞減脂試驗(yàn)研究。

2.2 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞脂滴變化的影響

精油和奧利司他作用于C3H10T1/2 細(xì)胞后，觀察其成脂分化后發(fā)現(xiàn)，成脂誘導(dǎo)劑會(huì)使C3H10T1/2 細(xì)胞的形態(tài)和體積發(fā)生不同程度的改變，脂滴增多，脂肪細(xì)胞增多。經(jīng)過(guò)不同濃度的精油、奧利司他處理并進(jìn)行油紅O 染色，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞脂滴變化的影響Fig.2 Effect of essential oil from Elsholtiza bodinieri Vaniot on lipid droplet of C3H10T1/2 cells

由圖2 可知，空白對(duì)照組未觀察到脂滴或脂肪細(xì)胞；高脂模型組經(jīng)油紅O 染色后，視野下呈現(xiàn)出深紅色的即為脂肪細(xì)胞；與高脂模型組相比，低濃度（25 μg/mL）精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化作用并不明顯，在中濃度（50 μg/mL）精油的作用下，油紅O 深染的脂肪細(xì)胞和脂滴依然可見(jiàn)，但脂肪細(xì)胞的體積在縮小，而高濃度（100 μg/mL）精油和陽(yáng)性對(duì)照奧利司他組與高脂模型組相比脂滴減少，脂肪細(xì)胞縮小。

2.3 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞TC、TG 的影響

精油和奧利司他對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞成脂分化后甘油三酯和總膽固醇含量的影響如圖3 所示。

圖3 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞甘油三酯、膽固醇含量的影響Fig.3 Effect of essential oil from Elsholtiza bodinieri Vaniot on triglyceride and cholesterols in C3H10T1/2 cells

由圖3 可知，高脂模型組甘油三酯、膽固醇含量較空白對(duì)照組極顯著增加（P＜0.01）；精油、奧利司他處理組與高脂模型組相比，C3H10T1/2 細(xì)胞中甘油三酯和總膽固醇的含量可以明顯降低，其中25 μg/mL 精油處理組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

2.4 東紫蘇精油調(diào)節(jié)C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化標(biāo)志因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)

精油和奧利司他對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞成脂分化標(biāo)志因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA 表達(dá)的影響如圖4 所示。

圖4 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of essential oil from Elsholtiza bodinieri Vaniot on expression of genes related to lipid metabolism in C3H10T1/2 cells

由圖4 可知，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組PPARγ、C/EBPα和FABP4mRNA 表達(dá)高度顯著增加（P＜0.001），精油、奧利司他處理組與高脂模型組相比，成脂分化標(biāo)志因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均有高度顯著降低（P＜0.001），且呈現(xiàn)一定劑量依賴的作用。

2.5 東紫蘇精油調(diào)節(jié)C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化標(biāo)志因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)

精油和奧利司他對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化標(biāo)志因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)的影響如圖5所示。

圖5 東紫蘇精油對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of essential oil from Elsholtiza bodinieri Vaniot on expression of proteins related to lipid metabolism in C3H10T1/2 cells

由圖5 可知，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組的成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα表達(dá)均有所上升，精油、奧利司他處理組與高脂模型組相比可明顯降低PPARγ、C/EBPα和FABP4蛋白的表達(dá)，其中在25 μg/mL 精油處理組中并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

3 討論與結(jié)論

植物精油（essential oil）是由植物天然合成的、具有揮發(fā)性的化合物所構(gòu)成的混合油狀成分。植物精油具有抗氧化、抗腫瘤、殺蟲、抗炎、降血脂等作用[12-14]。課題組前期采用微波無(wú)溶劑萃取方法提取東紫蘇精油，氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測(cè)化學(xué)成分，結(jié)果顯示：主要成分為乙酸松油酯（56.25%）、β-氧化石竹烯（4.41%）、α-松油醇（2.91%）、1，8-桉葉油醇（0.51%）等。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)東紫蘇精油通過(guò)降低C3H10T1/2 細(xì)胞中成脂基因和成脂蛋白的表達(dá)來(lái)減少脂滴的積累，表明東紫蘇精油能夠抑制C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化。結(jié)合其化學(xué)成分，推測(cè)東紫蘇精油的降脂功能可能是其中一些活性成分共同作用的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)α-松油醇改善了高脂飲食大鼠的營(yíng)養(yǎng)參數(shù)，重建胰島素敏感性，并降低血清促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 水平[12]。此外，α-松油醇還有抗氧化、抗高血壓、抗炎、抗肥胖和抗病毒活性[13-14]。石竹烯為雙環(huán)倍半萜型天然產(chǎn)物，主要包括α-石竹烯和β-石竹烯。β-石竹烯及其氧化物具有抗炎、抗癌、抑菌、抗氧化、止痛及降脂等生物活性；可抑制高糖環(huán)境下大腸癌細(xì)胞CT26 的增殖并促進(jìn)其凋亡；在預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝及其相關(guān)代謝紊亂方面具有潛在的功效[15-16]。1，8-桉葉油醇是東紫蘇精油的主要成分之一，具有抗炎、抑菌、抗氧化作用，桉葉油醇能減弱活性氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)提高超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等抗氧化酶的表達(dá)[17-19]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymstemcells，MSCs）主要來(lái)自發(fā)育早期的中胚層。最初發(fā)現(xiàn)于骨髓中，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉和肝細(xì)胞[20]，成脂分化是MSCs 的一個(gè)重要分化方向，也是成體脂肪細(xì)胞更新的主要來(lái)源。間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化機(jī)制研究，可以幫助了解與脂肪代謝異常有關(guān)的疾病。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARs是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員之一，包括氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxideproliferator-activatedreceptor，PPARα）、氧化物酶體增殖物激活受體β/σ（peroxideproliferator-activatedreceptorβ/σ，PPARβ/σ）和PPARγ，是脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)脂肪酸和葡萄糖代謝、骨穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)和其他過(guò)程有不同的影響。PPARγ能夠調(diào)控脂蛋白酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰輔酶A 合成酶等基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控脂代謝和脂肪酸氧化過(guò)程。在MSCs 分化過(guò)程中，PPARγ刺激脂肪細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化[21-23]，被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ在脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴積累中起關(guān)鍵作用。C/EBPα是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個(gè)亞家族，是增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員。有研究報(bào)道當(dāng)C/EBPα的表達(dá)量增加時(shí)，可使前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化速度加快，反之亦然。FABP4在脂肪細(xì)胞分化的后期表現(xiàn)極高，是細(xì)胞成脂分化的標(biāo)志物之一[24-27]。

在脂肪細(xì)胞分化初期，C/EBPβ因子通過(guò)激活C/EBPα、PPARγ等因子，進(jìn)入細(xì)胞分化期[28-30]，C/EBPα結(jié)合并激活特異基因啟動(dòng)子，脂肪細(xì)胞進(jìn)入終末分化階段[31]。C/EBPα、PPARγ、FABP4的較高轉(zhuǎn)錄促使前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，最終促使脂肪細(xì)胞增生。東紫蘇精油處理后在細(xì)胞分化初期C/EBPβ 激活并下調(diào)C/EBPα、PPARγ等因子，在進(jìn)入脂肪細(xì)胞終末分化階段時(shí)下調(diào)FABP4，抑制前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，最終抑制脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到降脂目的。

本研究以C3H10T1/2 細(xì)胞建立高脂模型，從基因和蛋白質(zhì)水平初步探討東紫蘇精油降脂機(jī)理。結(jié)果表明高脂模型組PPARγ、C/EBPα、FABP4mRNA 及蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比均明顯升高，東紫蘇精油、奧利司他作用后與高脂模型組相比則降低。不同濃度東紫蘇精油均可抑制C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化，且高濃度的抑制效果更好；東紫蘇精油可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ/C/EBPα信號(hào)通路發(fā)揮作用，但其具體機(jī)理及是否可以通過(guò)其他方式來(lái)達(dá)到降低脂肪的目的還需要后續(xù)深入系統(tǒng)的研究。