恒溫隔絕式PCR快速檢測蠟樣芽孢桿菌方法的建立及應(yīng)用

寇肖迪，孟含，蘇雅航，湯承，胡瑜，唐俊妮,*

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610225）(2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041）（3.康美包（蘇州）有限公司，江蘇蘇州 215021）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于土壤、空氣、水、動物的腸道以及植物源和動物源食品中，尤其是蛋白質(zhì)和碳水化合物含量豐富的食品，如糧食制品、乳制品、肉類制品和豆制品等[1-3]。近些年發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌也能感染包括人在內(nèi)的多種動物，是一種人畜共生細菌，感染者癥狀主要表現(xiàn)為惡心甚至嘔吐、腹脹腹痛腹瀉等[4]。據(jù)文獻報道，我國發(fā)生的B.cereus食源性疾病主要是以嘔吐型為主，占75.9%[5]。食用含有超過105CFU/g 的蠟樣芽孢桿菌即可導(dǎo)致食物中毒[6]。因此，對食品是否污染蠟樣芽孢桿菌的檢測十分重要。目前，蠟樣芽孢桿菌的檢測方法主要有GB 4789.14-2014[7]、免疫學(xué)檢測方法如ELISA、免疫組化及實時熒光PCR 等技術(shù)[8-11]、PCR 技術(shù)[12,13]。傳統(tǒng)鑒定蠟樣芽孢桿菌的方法操作繁瑣、耗時長、檢出率低；ELISA、免疫組化以及PCR 等方法對儀器設(shè)備和操作人員要求高[14,15]。因此，建立一種快速、準確、簡捷檢測蠟樣芽孢桿菌的方法，具有十分重要的應(yīng)用價值。

恒溫熱隔絕式PCR（Insulated Isothermal PCR，iiPCR）是一種以Rayleigh-Benard 對流系統(tǒng)為原理的能夠通過反應(yīng)管底部液體持續(xù)加熱產(chǎn)生上下液體溫差，控制對流時間與散熱速率，使其在管內(nèi)形成穩(wěn)定溫度梯度，從而提供PCR 所需快速、低耗的核酸擴增平臺[16]。該技術(shù)最早在2002 年，由Krishnan 首次報道，結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀，體積小、自帶電源，加樣后一鍵操作，反應(yīng)僅需42 min 便可完成，結(jié)果以“+”、“-”、“?”直接顯示于液晶屏幕上，方便快捷，可達到現(xiàn)場快速檢測的目的[17]。如Tsen[18]等建立了iiPCR 方法檢測雞肉中沙門氏菌，樣品培養(yǎng)到5 h 即可檢測樣品是否含有沙門氏菌；楊若璇等[19]使用iiPCR 檢測食品中的沙門氏菌，其靈敏度較高，最低檢出限可達75 CFU/mL，在6 h 內(nèi)完成檢測；李傳友等[17]建立iiPCR 快速檢測技術(shù)對食品中的金黃色葡萄球菌進行檢測，檢出限為102CFU/mL，檢出時間為6 h 且具有較高穩(wěn)定性。

蠟樣芽孢桿菌的管家基因gyrB 基因具有高度保守性[20]，能夠編碼蠟樣芽孢桿菌旋轉(zhuǎn)酶B 亞基，可用于蠟樣芽孢桿菌PCR 快速檢測[21-23]。本研究利用iiPCR 技術(shù)，建立一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的新方法，該方法能在更短的時間內(nèi)完成高特異性和高靈敏性的擴增，儀器設(shè)備也簡易便攜，能夠?qū)ΜF(xiàn)場檢測提供有效穩(wěn)定準確快速的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源

蠟樣芽孢桿菌ATCC11778（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌ATCC6538（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌ATCC25922（Escherichia coli）、單增李斯特菌ATCC19115（Listeria monocytogenes）、腸炎沙門氏菌CICC 21482（Salmonellaenteritidis）等均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

甘露醇卵黃多粘素培養(yǎng)基（Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin Agar Base，MYP）、多粘素B、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB），購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；核酸染料GELVIEW、DL50 Marker、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、Taq PCR Master Mix（2x，blue dye），購于寶生物工程（大連）有限公司；G-10電泳凝膠瓊脂糖，購于Biowest 公司；各種食物樣品購于學(xué)校食堂、超市以及攤位。

1.1.3 設(shè)備與儀器

POCKITTM小型智能型核酸分析儀、R-tube（48），廈門金瑞鴻捷生物科技有限公司；CFX96 熒光定量PCR 儀、VerSaDoc 2000 凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad 有限公司；PCR 儀，TSNENEN031445基因（美國）有限公司；Galanz WD800B 型微波爐，順德市格蘭仕微波爐電器有限責任公司；SC-15 數(shù)控超級恒溫槽，寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf 5804R 型冷凍離心機，Eppendorf 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成

選取蠟樣芽孢桿菌的管家基因gyrB 基因作為靶基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計一對引物及探針，并進行BLAST 比對，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，探針由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物和探針序列信息見表1。

表1 用于iiPCR方法的gyrB特異性引物、探針基本信息Table 1 Basic information for iiPCR of gyrB specific primers and probes

1.2.2 菌株復(fù)蘇

從超低溫冰箱中取出保存的蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌于室溫解凍，分別吸取50 μL 菌液接種置5 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃（蠟樣芽胞桿菌）或37 ℃（其他細菌）恒溫震蕩培養(yǎng)12～18 h。

1.2.3 DNA模板提取

取1.2.2 中蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌等菌株過夜培養(yǎng)菌液1 mL 于1.5 mL 的無菌EP 離心管中，4 ℃，12 000 r/min 離心2 min，PBS 洗滌菌體2～3次，棄上清液收集菌體。參考周晏陽等[24]微波提取DNA 方法，向離心管中加入500 μL TE 緩沖液，渦旋震蕩30 s，取100 μL 于PCR 管中，Galanz WD 800B 型微波爐預(yù)熱1 min 后將PCR 管用微波爐加熱40～120 s；12 000 r/min 離心1 min 收集上清液即為模板DNA。

1.2.4 引物及探針驗證

采用實時熒光定量PCR 儀（CFX96）對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌及陰性對照進行擴增檢測，以驗證引物和探針的可行性。

反應(yīng)體系及條件參考崔溢和張貴海[25]，10 μL 2×Premix Ex Taq，2 μL 探針（10 μmol/L），上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），5 μL DNA 模板，無菌水補足至20 μL，利用無菌去離子水代替DNA 模板做無模板陰性對照。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 min；60 ℃ 1 min；40 個循環(huán)，在56 ℃結(jié)束開始收集熒光信號。

1.2.5 iiPCR反應(yīng)體系摸索

參考楊若璇等[19]方法，采用25 μL 體系分別對Taq 酶（預(yù)混酶）5 U/μL（11～13.5 μL）上下游引物10 μmol/μL（0.5～2 μL）、探針10 μmol/μL（0.25～1 μL）、模板DNA（原始濃度94.75 ng/μL）（1～4 μL）、無菌水的用量進行條件探索，確定各自用量的最佳值。

1.2.6 特異性實驗

采用本實驗建立的iiPCR 方法對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸炎沙門氏菌標準菌株基因組DNA 進行擴增，同時設(shè)置1.2.3 中的蠟樣芽孢桿菌DNA 為陽性對照，無菌ddH2O 為陰性對照。

1.2.7 靈敏度試驗

對濃度為1.5×108CFU/mL 的菌懸液進行10 倍的梯度稀釋，并對10 個梯度濃度的菌液進行DNA提取，測定DNA 濃度，采用已建立的iiPCR 方法進行檢測。同步進行常規(guī)PCR 靈敏性對比試驗，常規(guī)PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2×TSINGKE Master mix 10 μL；10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL；DNA 模板2 μL；無菌去離子水7.2 μL，陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s；循環(huán)35 次；所得產(chǎn)物進行4%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并對比常規(guī)PCR 擴增結(jié)果。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗

采用建立的iiPCR 方法對菌液的三個稀釋度（10-5、10-6、10-7）進行三組重復(fù)實驗，以評價該方法的穩(wěn)定性。

1.2.9 與其它蠟樣芽孢桿菌檢測方法比較

分別采用傳統(tǒng)PCR 方法和熒光定量PCR 對蠟樣芽胞桿菌DNA 和菌液不同稀釋梯度進行檢測。

常規(guī)PCR 方法參考高瑞等[26]的方法稍作修改，即常規(guī)PCR 反應(yīng)體系共20 μL：2×TSINGKE Master mix 10 μL；10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL；DNA模板1 μL；無菌去離子水8.2 μL，陰性對照利用無菌去離子水代替DNA 模板。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s；循環(huán)35 次；所得產(chǎn)物進行4%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

實時熒光定量PCR（SYBER Green Ⅰ熒光染料法）根據(jù)董歆[27]的方法稍作修改，反應(yīng)體系共15 μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 7.5 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 15 μL，陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)，在延伸時采集熒光信號。

實時熒光定量PCR（TaqMan 探針法）根據(jù)柯振華[28]的方法稍作修改，反應(yīng)總體系為25 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL；上下游引物各1 μL；探針0.5 μL；模板DNA 2 μL；ddH2O 8 μL，陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)，在延伸時采集熒光信號。

將上述實驗結(jié)果與1.2.6 結(jié)果做對比。

1.2.10 實際樣品檢測

從成都各大農(nóng)貿(mào)市場、路邊小攤、食堂、餐館等地購買糧食制品、肉制品、豆制品、乳制品以及熟食樣品共計42 份（詳見表3），并將食品樣品切成1 cm 長小段攪拌混勻，準確稱取各處理后的食品樣品25 g 至胰蛋白胨大豆肉湯中，振蕩培養(yǎng)2、4、6、8 h 取樣（通過預(yù)實驗iiPCR 需培養(yǎng)6 h，常規(guī)PCR 至少培養(yǎng)8 h），按1.2.3 方法提取基因組DNA，采用1.2.4 已建立iiPCR 方法和常規(guī)PCR 方法進行檢測，并分析蠟樣芽孢桿菌在食品中的流行情況。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2020 進行整理計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及探針驗證結(jié)果

采用實時熒光定量PCR 分別對不同標準菌株提取DNA 進行擴增，結(jié)果如圖1 所示，只有1 號蠟樣芽孢桿菌出現(xiàn)陽性，能夠得到特異性擴增，2～5號其他菌株為陰性，證明本研究根據(jù)選取的gyrB基因所設(shè)計的引物與探針具有良好特異性。

圖1 蠟樣芽胞桿菌引物、探針驗證結(jié)果Fig.1 The primer and probe verification for Bacillus cereus

2.2 優(yōu)化后的反應(yīng)體系

通過對Taq 酶、探針、引物、模板用量進行區(qū)間優(yōu)化（如圖2），最終確定的反應(yīng)體系如表2 所示。Taq 預(yù)混酶的用量確定為各2.5×106U/L，上、下游引物用量確定為各0.2 mol/L，探針用量確定為0.2 mol/L，DNA 模板用量確定為7.58 ng/μL。

圖2 iiPCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The optimization results of iiPCR

2.2 特異性評價

對純培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和沙門氏菌提取DNA 作為模板，按上述建立的方法進行iiPCR 擴增，結(jié)果如圖3a、b 所示，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上顯示只有蠟樣芽孢桿菌檢出為陽性（+），陰性對照和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌檢出均為陰性（-）。表示針對蠟樣芽孢桿菌所建立的iiPCR 檢測方法特異性良好。

圖3 特異性試驗Fig.3 Specific test

2.3 靈敏度試驗結(jié)果

將制備好的菌懸液梯度10 倍稀釋，分別選擇100 μL 不同梯度的稀釋菌液，均勻涂于營養(yǎng)瓊脂平板上，在（30±1）℃下倒置過夜培養(yǎng)，當培養(yǎng)基上生長出清晰的單個菌落，并統(tǒng)計典型菌落數(shù)，取平均值后得到第10-5稀釋梯度的菌落平均數(shù)為1 500 CFU/mL，經(jīng)計算得出所制得菌懸液的原始濃度為1.5×108CFU/mL。

對所稀釋的10 個梯度濃度的蠟樣芽孢桿菌的菌懸液采用微波法提取DNA，采用上述擴增體系進行檢測，結(jié)果如圖4 所示，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上濃度為1.5×103CFU/mL 和1.5×102CFU/mL均顯示為陽性（+），濃度為15 CFU/mL 和陰性對照顯示為陰性（-），說明建立的iiPCR 檢測方法對蠟樣芽孢桿菌純培養(yǎng)菌液的最低檢出限為150 CFU/mL。

圖4 蠟樣芽胞桿菌不同濃度菌液檢出結(jié)果Fig.4 Detection results of Bacillus cereus in different concentrations of bacterial solution

注：1～4 泳道分別為1.5×103、1.5×102、1.5×10 CFU/mL、陰性對照。

2.4 穩(wěn)定性評價

分別對純培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌菌懸液的10-5、10-6、10-7，3 個稀釋梯度即1.5×103、1.5×102、1.5×10 CFU/mL，分別提取DNA 作為模板，通過上述建立的iiPCR方法對其擴增，進行三次重復(fù)性平行試驗，結(jié)果如圖5a、b、c 所示，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上陰性對照和1.5×10 CFU/mL 顯示為陰性（-），1.5×103、1.5×102CFU/mL 顯示為陽性（+），三次重復(fù)檢測結(jié)果一致，表示本研究所建立的iiPCR 方法具有良好的穩(wěn)定性。

圖5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.5 Stability evaluation test results

2.5 與其他檢測方法比較結(jié)果

將純培養(yǎng)的濃度為1.5×108CFU/mL 蠟樣芽孢桿菌菌懸液經(jīng)10 倍梯度稀釋，采用傳統(tǒng)PCR 方法、實時熒光定量PCR（熒光染料SYBR Green Ⅰ和TaqMan 探針法）技術(shù)擴增對其靈敏性進行檢測。檢測結(jié)果如圖6 所示。

圖6 傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量菌液濃度靈敏度試驗結(jié)果Fig.6 Traditional PCR,real-time fluorescence quantitative PCR Concentration sensitivity test results

結(jié)果表明，傳統(tǒng)PCR 方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為1.5×103CFU/mL；實時熒光定量PCR方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為1.5×102CFU/mL；與2.3 中結(jié)果比較分析可知，本研究建立的iiPCR方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限與實時熒光檢測技術(shù)相同，均比常規(guī)PCR 技術(shù)檢測結(jié)果高出一個數(shù)量級。

iiPCR 方法無需凝膠電泳檢測，總檢測流程僅需7～8 h 即可得到結(jié)果，擴增時間40 min 即可顯示檢測結(jié)果。

2.6 實際樣品檢測結(jié)果分析

為驗證已建立方法對食品中蠟樣芽胞桿菌的檢測效果，采集實際食品樣品42 份進行方法的檢驗。采用上述研究建立的iiPCR 方法對采集的42 份實際食品樣品中蠟樣芽孢桿菌進行檢測，結(jié)果如圖7 所示，從圖中可以看出，當培養(yǎng)到6 h 時，42 份食品樣品中共檢測出蠟樣芽孢桿菌陽性有19 份，總檢出率為45.23%（19/42），其中米面制品的檢出率為23.81%（10/42），乳制品的檢出率為4.76%（2/42），熟食類（肉制品及涼拌菜）檢出率分別為4.76%（2/42）和2.38%（1/42），豆制品檢出率為9.52%（4/42）。如果按米面制品細分，其檢出率為62.50%（10/16）。

圖7 食品樣品iiPCR 檢出結(jié)果Fig.7 Food samples iiPCR detection results

2.7 實際樣品iiPCR與普通PCR方法檢出結(jié)果比較

采用常規(guī)PCR 方法對上述采集的食品樣品檢測加以驗證iiPCR 方法的準確性，當樣品增菌培養(yǎng)到8 h 時提取DNA（前增菌6 h 常規(guī)PCR 未能檢測出），通過常規(guī)PCR 進行擴增，結(jié)果如圖8 所示，由圖可以看出此時常規(guī)PCR 方法可對19 份樣品均檢出陽性結(jié)果，將兩種方法的檢出結(jié)果進行比較，比較結(jié)果如表3 所示，常規(guī)PCR 方法與iiPCR 方法的檢測結(jié)果一致?？梢姡狙芯克ο灅友挎邨U菌檢測的iiPCR 方法比傳統(tǒng)PCR 方法具有耗時更短、操作更簡便的優(yōu)勢，在實際食品樣品的現(xiàn)場檢測應(yīng)用方法中，建立的iiPCR 方法更加快捷、實用。

表3 iiPCR與常規(guī)PCR檢測結(jié)果的比較Table 3 Comparison of iiPCR and traditional PCR results

本研究所采集的食品樣品蠟樣芽孢桿菌的總檢出率為45.23%（19/42），與田萬帆等[29]（24.00%）、李芳等[30]（26.56%）、權(quán)玉玲等[31]（13.03%）、畢宇涵等[32]（30.51%）的研究檢測結(jié)果偏高，可能的原因是本研究所采集的食品樣品集中在7～9 月，夏季氣溫高導(dǎo)致大部分食源性致病菌生長繁殖快。糧食制品是蠟樣芽孢桿菌最易感染的食品來源，本研究中米面等糧食制品的小類檢出率最高，為62.50%（10/16），連國平等[33]在分析四類不同食品中蠟樣芽孢桿菌的分布規(guī)律時，也得出熟制米面制品最易感染蠟樣芽孢桿菌的結(jié)論，且檢出率最高，與本研究結(jié)論相同。

食品中蠟樣芽孢桿菌含量超過105CFU/g 即可作為食物中毒的判斷依據(jù)[34]，但由于本次所采樣品未進行蠟樣芽孢桿菌含量及是否含有能夠產(chǎn)生嘔吐及腹瀉毒素的毒力基因檢測，雖所檢出樣品含有蠟樣芽孢桿菌，但無法斷定其含量是否會導(dǎo)致食物中毒癥狀發(fā)生，以后我們會進一步針對食品中細菌的含量及毒素進行定量檢測。

3 結(jié)論

本研究建立了快速檢測蠟樣芽孢桿菌的iiPCR方法，選擇gyrB 基因作為檢測靶基因，通過iiPCR方法與傳統(tǒng)檢測方法以及熒光PCR 等方法對不同致病菌的對比得出iiPCR 方法蠟樣芽孢桿菌最低檢出限僅為1.5×102CFU/mL，且耗時僅為7～8 h，此結(jié)果遠遠低于傳統(tǒng)PCR 方法與熒光PCR 方法的檢測結(jié)果，說明該方法靈敏度高、耗時短、操作便捷；通過重復(fù)試驗及對實驗室其他保藏菌進行試驗對比，說明已建立方法穩(wěn)定性好、特異性強；采用已建立方法與常規(guī)PCR 方法做實際樣品檢測驗證，結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果一致，iiPCR 方法可以用于食品的檢測。

綜上，本研究建立的基于恒溫熱隔絕式PCR 技術(shù)檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌，可應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測，不僅節(jié)省時間還提高了檢測效率，降低了微生物檢測工作的部分難度。