紅甜菜根中類黃酮類差異代謝物的比較分析

白雯鈺，劉乃新*，韓廣源，于清濤,，周芹，陳百翠，李承欣

(1.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，黑龍江哈爾濱 150080)（2.哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱150023）（3.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江哈爾濱 150029)

近年來，隨著人們對高品質(zhì)蔬菜的需求日益提升，復合型多功能蔬菜逐漸出現(xiàn)在大眾視野，成為植物營養(yǎng)研究熱點。紅甜菜(Beta vulgarisL.)，藜科，是原產(chǎn)于地中海地區(qū)的重要蔬菜，在歐洲、北美洲和亞洲產(chǎn)量最高，全世界都有消費[1]。作為重要的健康食品，人們普遍以紅甜菜的紫紅色根部為主要食用部分。紅甜菜由于含有甜菜素、類黃酮和多酚等多種次生代謝產(chǎn)物而被用于醫(yī)藥領(lǐng)域，甜菜素是紅甜菜的主要次生代謝產(chǎn)物之一，是一種水溶性含氮天然色素，由于具有抗菌和抗病毒的特性，被廣泛用作食品工業(yè)的著色劑[2]。有研究表明，甜菜紅色素和酚類化合物具有抗菌、抗炎、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、抗細胞毒性和調(diào)節(jié)免疫和保護肝性能的作用[3-5]。甜菜根還對胃腸消化具有有益作用，與其膳食纖維的含量有關(guān)，可改善腸道蠕動，減少結(jié)腸病變發(fā)生率，并可調(diào)節(jié)腸道菌群[6]。

類黃酮類化合物是一類多酚類化合物，具有很強的抗細菌和抗真菌作用[7]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的黃酮種類已達到4 000 多種，因其在人類疾病治療中具有潛在抗菌作用，從而在醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應用[8]。類黃酮，目前是指由一個中心三碳連接的兩個苯環(huán)（a 環(huán)和C 環(huán)）形成C6-C3-C6 主母核的廣泛天然產(chǎn)物[9]。根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)被分為不同的類別，主要類別包括異黃酮、黃烷醇、黃酮、花青素和查爾酮[10]。在可食用植物中發(fā)現(xiàn)的具有豐富生物活性的成分是類黃酮類化合物和酚類化合物，它們在細胞中作為非酶抗氧化劑，以防止氧化應激的損害，是支持人體健康的代謝產(chǎn)物[11]。此外，這些植物化學物質(zhì)可以作為紫外線過濾器，保護植物免受紫外線輻射的傷害，還可作為信號分子、防御抗菌的化合物和有毒重金屬的螯合劑[12]。雖然人們對類黃酮類化合物抗氧化活性的研究較為深入和系統(tǒng)，但關(guān)于類黃酮類化合物的種類、含量及變化規(guī)律與紅甜菜塊根代謝間的內(nèi)在聯(lián)系卻鮮見報道。

本試驗以探究一品紅和俄羅斯紅甜菜塊根中類黃酮類次生代謝物質(zhì)作為切入點，分析兩種栽培型紅甜菜類黃酮類物質(zhì)的種類、含量及倍數(shù)差異。采用了高效液相色譜-二極管陣列法（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array，HPLC-DAD）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）[13]以及核磁共振光譜和超高效液相色譜-電噴霧電子-飛行時間-質(zhì)譜等方法，并通過上述方法評價了其中的抗氧化特性。利用主成分分析法（Principle Component Analysis，PCA），正交偏最小二乘法判別分析法（Orthogonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLSDA）[14]，對不同階段類黃酮類化合物進行判別分析，通過聚類分析不同模式條件下紅甜菜塊根中類黃酮類化合物的組成及含量的分布規(guī)律，并對關(guān)鍵黃酮代謝物進行篩選。目前己有報道，甜菜中含有較豐富的皂苷成分，并且在葉甜菜和根甜菜中現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)11 種三萜皂苷。甜菜中已被明確化學名稱的代謝產(chǎn)物有260 個，其中包括定性可靠的差異代謝物99種[16]。在前人的研究中，并沒有出現(xiàn)俄羅斯紅和一品紅甜菜塊根中具有顯著差異的代謝產(chǎn)物在人體健康方面的功效的推測與研究。而本研究則通過分析兩種紅甜菜間代謝產(chǎn)物的差異，尋找出具有顯著差異的代謝產(chǎn)物，為培育具有特殊活性成分的新的甜菜品種提供研究基礎(chǔ)，并對理解不同紅甜菜塊根中類黃酮類差異代謝產(chǎn)物的分析具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅甜菜塊根供試材料為東北地區(qū)主栽種一品紅（Two CK）及俄羅斯紅（Three CK），分別由哈爾濱工業(yè)大學程大友教授團隊和國家糖料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系東北育種崗位團提供。2022 年4 月28 日播種，同年10 月8 號收獲。種植于哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院試驗田。于收獲期各品種分別取長勢一致6 個塊根作為試驗材料，每個塊根斜45 度角取1 cm 直徑條后混合儲存于-80 ℃冰柜待用。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

甲醇（Methanol）、乙腈（Acetonitrile）、醋酸銨（Ammonium Acetate）、氨水（Ammonium Hydroxide）純度都為LC-MS 級，CNW，L-2-氯苯內(nèi)氨酸（2-Chloro-L-Phenylalanine）純度大于等于98%。

安捷倫1290 UHPLC 超高效液相，色譜為購自Waters 的UPLC BEH Amide 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），UPLC BEH 酷胺柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，水）連接到Triple Tof5600（Q-TOF，AB Scicx），賽默飛世爾科技Heracus Fresco17 離心機，Sartorius 天平（BSA124S-CW），Merck Millipore純水儀（明澈D24 UV），深圳市雷德邦電子有限公司超聲儀（PS-60AL）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集和預處理

生物樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥；用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）直到粉末狀；稱取50 g 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每過30 min 就需要渦旋一次，每次持續(xù)30 s，渦旋6 次。離心（12 000 r/min，3 min）后，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm Pore Size）過濾樣品，再放入樣品瓶中保存，用UPLC-MS/MS 檢測[15]。

1.3.2 代謝物提取

本試驗中兩種類型甜菜代謝組測序由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成，相關(guān)分析在邁維云平臺完成[16]。樣品處理：不同甜萊樣品在冰上4 ℃解凍，再取100 μL 樣品置于EP 管中，用300 μL 甲醇萃取,然后加入20 μL 內(nèi)標物，旋渦30 s，以超聲處理10 min，-20 ℃放置1 h，蛋白質(zhì)沉淀，然后以13 000 r/min 的速度在4 ℃，離心15 min[16]，再將200 μL 上層清液轉(zhuǎn)移到新鮮的2 mL LC/MS 玻璃小瓶中，從每個樣品中各提取20 μL 作為質(zhì)控樣品，并收集上清液用于UHPLC-QTOF-MS 分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)評估

為了使實驗的數(shù)據(jù)準確可靠，我們會在檢測試驗樣品的同時檢測質(zhì)控樣本（Quality Control，QC），在數(shù)據(jù)代表相同的實驗條件下，得出儀器的穩(wěn)定性與精確性，以此來支持實驗得出的結(jié)論。本實驗采用了QC 樣本ESI-模式下的總離子流圖（Total Ion Chromatograph，TIC）比對和PCA 兩種方法對實驗中采集的QC 樣本數(shù)據(jù)進行分析[16]。

1.3.4 檢測分析

安捷倫1290 超高效液相，色譜為購自Waters公司的UPLC BEH Amide 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），使用UHPLC 系統(tǒng)（1290，安捷倫技術(shù)公司）進行LC-MS/MS 分析，將UPLC BEH 酷胺柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，水）連接到Triple Tof 5600（Q-TOF，AB Scicx）上，流動相由25 mmol/L NH4OAC 和25 mmol/L NH4OH 組成，在pH 值9.75的水中（a）和乙腈（b）進行洗脫，洗脫梯度如下：0 min，95% b；7 min，65% b；9 min，40% b；9.1 min，95% b；12 min，95% b，以0.5 mL/min 輸送[16]。注入量為3 μL。

電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）的溫度為500 ℃；離子噴霧電壓（IS）為5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式）；離子源氣體1（GS1），氣體2（GS2）和氣簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60 和25 psi，碰撞氣體（氮氣）設(shè)置為中等。然后使用去簇電壓（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）進行優(yōu)化，最后完成各個多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）離子對的DP 和CE。同時再依據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物來檢測每一組特定的MRM 離子對[17]。數(shù)據(jù)采集儀器主要包括UPLC 和串聯(lián)色譜（Tandem Chromatography，MS/MS）。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采取將P值、差異倍數(shù)和OPLS-DA 模型的VIP 值融合的方式來選擇差異代謝物，篩選的標準為FC＞2、FC＜0.5、Pvalue＜0.05 和VIP＞1[18]。通過主成分分析（PCA）分析樣本，了解各組樣本間總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。

1.3.6 代謝物定性定量方法

依據(jù)邁維代謝MWDB 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜得到的信息對物質(zhì)進行定性分析。代謝物的定量是通過三重四級桿質(zhì)譜的MRM 來進行分析。以代謝物色譜峰的峰面積積分獲得各成分的相對含量，并對同一個代謝物在各個樣品中的質(zhì)譜出峰進行面積積分的矯正。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控分析

由此圖我們可以看出總離子流圖當中的峰值純度很高，能夠達到實驗數(shù)據(jù)后期的分析要求。

圖1 QC 樣品正離子流圖Fig.1 Sample positive ion flow diagram

圖2 QC 樣本負離子流圖Fig.2 Sample negative ion flow diagram

2.2 主成分分析（PCA）

通過對樣本的質(zhì)控組樣品的主要因素研究，能夠進一步掌握各樣品間的總體代謝物變化以及各樣品間的變化率等。PCA 結(jié)果顯示各組之間代謝組呈現(xiàn)出分離的趨勢，這可以提示樣品組內(nèi)代謝組是否存在差異，PCA 得分如圖3 所示。

圖3 PCA 得分圖Fig.3 PCA score plot

圖4 OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score chart

2.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA 結(jié)合OSC 和PLS-DA 方法，把X 矩陣數(shù)據(jù)分解成和Y 有關(guān)和不相關(guān)的2 個數(shù)據(jù)，通過消除不相關(guān)的差異來篩選不同變量。

2.4 一品紅和俄羅斯紅甜菜塊根中類黃酮類代謝產(chǎn)物分析

我國在之前的研究中很少出現(xiàn)對紅甜菜塊根中的次生代謝物的研究，如黃酮、多酚類、皂苷和萜類化合物等，但國外對此的研究卻較為豐富。皂苷成分在抗氧化[19]、消除炎癥[20]和降低血糖[21]等多方面的具有良好的作用。本研究明確了兩種紅甜菜塊根中具有代表性的代謝產(chǎn)物，分別為亞二甲氧基黃酮、芹菜素、木犀草素、槲皮素、楊梅素、山奈酚等，其中側(cè)鏈含有亞二甲氧基的類黃酮類化合物含量最多。一品紅與俄羅斯紅中黃酮的代謝產(chǎn)物共有69 種，分成六大類，分別是查爾酮、黃酮、其他類黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、橙酮類。其中查爾酮共有2 個，黃酮31 個，其他類黃酮10 個，黃酮醇23 個，二氫黃酮2 個，橙酮類1 個為6-O-β-D-葡萄糖基海生菊（(Z)-6-O-β-D-glucopranosyl-6,7,3,,4,-tetrahydroxyaurone）。以下兩種紅甜菜之間的比對均以P值作為闕值標準，可判斷出差異代謝產(chǎn)物共29種，差異代謝產(chǎn)物中下調(diào)的共有17 個（見表1），上調(diào)的共12 個（見表2），無差異的成分有40 種（見表3）。

2.4.1 不同品種紅甜菜塊根中查爾酮類代謝產(chǎn)物分析

查爾酮具有由兩個酚環(huán)組成的三碳α,β-不飽和羰基體系。許多查爾酮類化合物具有廣譜的生物活性，可用于治療腫瘤[22]，抗宮頸癌等[23]，對多種疾病具有臨床應用潛力。它們通常大量存在于大多數(shù)可食用植物的種子、果皮、樹皮和花中[24]。兩種紅甜菜品種中有2 種查爾酮成分，分別是3,4,2’,4’,6’-五羥基查耳酮-4’-O-葡萄糖苷和醌式紅花苷*。一品紅塊根中3,4,2’,4’,6’-五羥基查耳酮-4’-O-葡萄糖苷含量顯著高于俄羅斯紅甜菜（log2FC:-4.64E+00）。

2.4.2 不同品種紅甜菜塊根中黃酮代謝產(chǎn)物分析

由圖5 可知，兩種紅甜菜品種中有31 種黃酮成分，這31 種黃酮成分大體分為金圣草黃素、甲氧基黃酮、香葉木素、芹菜素、牡荊素、高車前素、川陳皮素、買麻藤乙素、卷柏石松素等物質(zhì)的衍生物。根據(jù)成分差異分析表明：一品紅塊根中高于俄羅斯紅塊根的類黃酮類成分有4 種，分別是金圣草黃素、甲氧基黃酮類衍生物、香葉木素、買麻藤乙素。一品紅中金圣草黃素和側(cè)鏈含有亞二甲氧基黃酮類衍生物的含量都高出俄羅斯紅5 倍以上，因金圣草黃素其具有抗過敏、抗炎、抗癌等活性[25]，可推測出一品紅在此方面的功效優(yōu)于俄羅斯紅。有研究表明，側(cè)鏈含有亞二甲氧基的類黃酮類衍生物在植物中廣泛分布，在抑菌[26]、抗炎[27]、抗氧化[28]等方面有顯著的生物活性，因此可推斷此成分在這兩種紅甜菜塊根中產(chǎn)生較為明顯的影響。芹菜素存在于蔬菜、植物及多數(shù)飲料中，芹菜、歐芹中含有大量的芹菜素，有顯著的抗菌、抗炎和抗痙攣作用，芹菜素還可以抑制變形鏈球菌從而降低患齲齒的發(fā)生概率[29]。木樨草素與芹菜素類似，存在于蔬菜和水果中，可作為一種清除活性氧（ROS）的抗氧化劑和擁有自動氧化的能力而作為一種促氧化劑，木樨草素具有抗炎、抗癌、抗過敏等作用，可抑制化膿性鏈球菌[30]。

圖5 黃酮類差異代謝物條形圖Fig.5 Bar chart of flavonoid differential metabolites

一品紅塊根中低于俄羅斯紅塊根的黃酮類成分有12 種，大體為6 種葡萄糖苷、2 種木糖苷、異牡荊素、川陳皮素、甲氧基黃酮類衍生物、香葉木苷等。由圖可看出俄羅斯紅中有4 種葡萄糖苷和香葉木苷的含量高出一品紅3 倍以上，其中差異倍數(shù)最大的成分是香葉木苷。香葉木苷是一種半合成藥物，可用于治療慢性靜脈功能不全、靜脈曲張等靜脈疾病[31]，可推測出俄羅斯紅在此方面的功效優(yōu)于一品紅。

2.4.3 不同品種紅甜菜塊根中其他類黃酮代謝產(chǎn)物分析

由圖6 可知，兩種紅甜菜品種中有其他類黃酮成分10 種，這10 種其他類黃酮成分大體為二甲氧基類衍生物、蒽酮、杧果苷、二氫色原酮、異芒果苷、半乳糖苷等物質(zhì)的衍生物。二甲氧基類化合物具有優(yōu)良的抗腫瘤活性,側(cè)鏈含有二甲氧基的化合物具有抗前列腺癌、抗肺癌、抗乳腺癌等功能[32]。根據(jù)成分差異分析表明一品紅中二甲氧基類衍生物含量高出俄羅斯紅3 倍以上，可推測一品紅在上述功能方面較俄羅斯紅更為突出。

圖6 其他類黃酮代謝物條形圖Fig.6 Bar chart of other flavonoid metabolites

2.4.4 不同品種紅甜菜塊根中黃酮醇代謝產(chǎn)物分析

兩種紅甜菜品種中有23 種黃酮醇成分，這23種黃酮醇成份大體為桑色素、楊梅素、山柰酚、槲皮素、鼠李素、異鼠李素、萬壽菊素、檸檬素、檉柳苷等物質(zhì)的衍生物。在黃酮醇差異倍數(shù)條形圖中（見圖7），差異倍數(shù)最大的是甲氧基槲皮素和異鼠李素糖苷。異鼠李素是一種天然類黃酮，具有廣泛的藥理活性[33]和健康益處，并且異鼠李素及其不同糖苷因其結(jié)構(gòu)不同而具有不同的生物學效應[34]，包括抗腫瘤作用[35,36]、抑制脂肪生成[37]、保護心腦血管器官[38,39]、藥用作用[40]等。在一品紅中的異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-4,-O-葡萄糖苷含量相較于俄羅斯紅大約高出10 倍以上，由此可推測一品紅在上述方面較俄羅斯紅效果更好。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以清除自由基并且具有抑制氧化呼吸鏈的擴散，抗癌、抗腫瘤及降血脂等多重功效[41]。俄羅斯紅中槲皮素含量則高出一品紅10 倍以上，可推測出俄羅斯紅在上述的功能和效果中比一品紅更為突出。山柰酚能抑制大腸桿菌[42]。

圖7 黃酮醇類差異代謝物條形圖Fig.7 Bar chart of flavonol differential metabolites

槲皮素具有高抗氧化和抗炎活性，對牙齦卟啉單胞菌有顯著的抑制作用[43]。楊梅素以游離和糖苷結(jié)合的形式天然存在，難溶于水，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎癥、抗血小板聚集、抗凋亡和肝保護活性[44]。由此可推測出兩種紅甜菜塊根在抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌和抗過敏等方面可能具有顯著功效。

2.4.5 不同品種紅甜菜塊根中二氫黃酮和橙酮代謝產(chǎn)物分析

兩種紅甜菜的二氫黃酮類成分有新橙皮苷和橙皮苷兩種,均為橙皮素糖苷化合物。橙皮素是從柑橘類水果中提取的一種天然化合物，其抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌和神經(jīng)保護活性已被充分證實[45]。

在兩種紅甜菜品種當中，只含有一種橙酮成分為6-O-β-D-葡萄糖基海生菊，一品紅紅甜菜中橙酮俄羅斯紅甜菜橙酮的差異倍數(shù)為（log2FC:2.35E-01）。橙酮在醫(yī)用方面，具有抗癌[46,47]、抗真菌[48]、抗炎[49]、抗病毒[50]等重要作用。

2.5 差異代謝物KEGG pathway綜合比對及特征代謝物分析

所有黃酮類物質(zhì)主要富集于黃酮、黃酮醇和其他類黃酮合成的代謝通路中。將一品紅和俄羅斯紅已知的7種代謝物映射到兩個代謝通路中（圖8、9）。依據(jù)log2FC 差異倍數(shù)從高到低及代謝產(chǎn)物類型建議將檉柳苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-4’-O-葡萄糖苷、山柰酚-4’-O-葡萄糖苷、6,7,8-三羥基-5-甲氧基黃酮、金圣草黃素、7-甲氧基-3-[1-(3-吡啶基)亞甲基]-4-二氫色原酮、異鼠李素-3-O-(2’’-O-葡萄糖基)半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷列為一品紅（紅甜菜）的特征性代謝物。5,2’-二羥基-7,8-二甲氧基黃酮葡萄糖苷*、槲皮素-3-O-(6’’-O-乙酰)半乳糖苷、香葉木苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷*、香葉木素-7-O-半乳糖苷*、6-甲基山柰酚-3-O-葡萄糖苷*、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素-2’’-O-木糖苷、異牡荊素列為俄羅斯（紅甜菜）的特征性代謝物。

圖8 黃酮和黃酮醇生物合成途徑Fig.8 Biosynthetic pathways of flavonoids and flavonols

圖9 其他類黃酮生物合成途徑Fig.9 Other flavonoid biosynthetic pathways

3 結(jié)論

兩種甜菜塊根共檢測出類黃酮類代謝物69 個，分成黃酮、黃酮醇、查爾酮、二氫黃酮、橙酮類和其他類黃酮六種類型，其中黃酮類代謝物31 種，占44.93%；黃酮醇類代謝物有23 種，占33.33%；其他四種類型分別占比：2.90%、2.90%、1.45%和14.45%。差異代謝物29 種，在一品紅（紅甜菜）塊根中12 種差異代謝物含量高于俄羅斯（紅甜菜）塊根，17 種差異代謝物含量低于俄羅斯紅甜菜塊根。根據(jù)代謝物log2FC 判定差異倍數(shù)較大的成分主要是五羥基查耳酮類、異鼠李素、二甲氧基黃酮、蒽酮、多甲氧基黃酮、槲皮素、山柰酚、香葉木素、高車前素等成分的衍生物。一品紅（紅甜菜）塊根較俄羅斯（紅甜菜）塊根類黃酮類代謝產(chǎn)物相對含量高的成分是多甲氧基黃銅類衍生物、高車前苷、異鼠李素等。俄羅斯紅較一品紅塊根類黃酮代謝產(chǎn)物相對含量較高的成分有：金圣草黃素、香葉木素、買麻滕乙素等。被注釋到KEGG 通路上的代謝物有7 種：在黃酮和黃酮醇的生物合成途徑上，分別為3-O-甲基槲皮素(3-O-Methylquercetin)、木犀草甙（Luteoloside）、3’-O-甲基木犀草素（3’-O-Methylluteolin），蘆?。≧utin）、異槲皮苷（Isoquercitrin）、異牡荊素（Isovitexin）、三葉豆甙（Trifolin）。目前國內(nèi)對紅甜菜的類黃酮類代謝產(chǎn)物研究較少。雖然甜菜塊根中的類黃酮類化合物的代謝通路中含有這些物質(zhì)，但是還沒有具體的研究表明這些物質(zhì)是否能更有效的和紅甜菜一起運用到人們的餐桌食品和營養(yǎng)健康上，同時這對我們之后的研究也提供了一個新方向新思路。

通過分析發(fā)現(xiàn)2 種甜菜材料中存在具有明顯差異的類黃酮類代謝物，建議可作為特征代謝物做進一步分析。