大豆-堅果奶酪類似物的制備及其性質研究

陳斗藝，邱曉敏，林美云，鄭倩望，葉志偉，郭麗瓊，林俊芳，鄒苑＊

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.汕頭市華樂福食品有限公司，廣東汕頭 515825）

傳統(tǒng)奶酪主要是以牛奶、羊奶等動物乳液為原料，通過添加發(fā)酵劑和凝乳酶使蛋白質絮凝聚集，析出部分乳清，繼續(xù)發(fā)酵使其成熟的一種奶制品，其含有豐富的蛋白質、鈣、脂肪、磷和維生素等成分，是一種營養(yǎng)豐富的天然乳制品[1]。由于我國面臨奶源不足、奶酪制作成本高等問題，奶酪制品仍得不到普及。此外，大規(guī)模生產奶酪會導致溫室氣體排放增加、占用大量耕地面積、水資源等一系列環(huán)境問題[2,3]。隨著人們對環(huán)境可持續(xù)發(fā)展、身體健康及動物保護意識的不斷提高，越來越多的人開始關注奶酪類似物[4]。

奶酪類似物通常指的是由植物基原料制成的，具有與動物奶酪制品相似的外觀、質地和口感[5]。目前，國內外有關奶酪類似物的研究還處于起步階段，市面上的產品仍然存在各種問題，如口感粗糙、風味不佳、加工過度等。這也引起了食品科研工作者及企業(yè)的廣泛關注。例如，Oyeyinka 等[6]采用40%的腰果乳替代豆乳生產奶酪類似物，干物質中的蛋白質含量達到63.99%，感官評分為7.0 分（滿分為9.0）。Adejuyitan 等[7]發(fā)現(xiàn)，50%:50%的大豆乳和椰奶制備的奶酪類似物（7.3 分）比100%大豆奶酪有更高的感官評分（5.7 分），可能是椰奶掩蓋了大豆的豆腥味。由此可知，豆類、谷物和堅果類可作為奶酪類似物的主要原料，并通過復配植物乳進一步改善奶酪類似物品質。然而，目前的研究主要是制備植物基奶酪類似物，很少系統(tǒng)研究奶酪類似物的質構、感官特性、消化特性、儲藏特性等。

大豆乳在我國素有“綠色奶?！敝Q，并且大豆乳是目前消費最廣泛，接受度最高的植物乳，含有大量的多不飽和脂肪酸，不含膽固醇，是高質量蛋白質的良好來源[8]。但是，豆類物質的不良風味限制了其在奶酪類似物中的廣泛應用。因此，有必要挖掘其他植物乳與大豆乳復配，以期在一定程度上降低或掩蓋豆類物質的不良風味。其中，堅果類植物乳營養(yǎng)豐富，且具有堅果類特殊香味，如腰果富含脂肪、纖維、礦物質、蛋白質、單寧和維生素C[9]；巴旦木富含蛋白質，并含有少量胡蘿卜素、維生素B1、B2 和消化酶[10]。基于此，本研究選用腰果乳和大豆乳復配再加入巴旦木蛋白制備具有高蛋白兼具優(yōu)良風味的大豆-堅果奶酪類似物；為了更好地迎合不同年齡段消費者的喜好，將樣品制備成攜帶食用方便的奶酪棒形式；以感官評分為主要評價指標，并通過單因素試驗結合響應面優(yōu)化確定最佳工藝配方；進一步對大豆-堅果奶酪類似物的理化性質、感官特性、儲藏穩(wěn)定性和消化特性進行系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

烘焙腰果、大豆、椰子油、葵花籽油、谷氨酰胺轉氨酶（TG 酶）、蔗糖購于淘寶；黃原膠、卡拉膠、刺槐豆膠、巴旦木蛋白由大昌華嘉化學國際貿易（上海）有限公司提供；商品化植物基奶酪1、2 分別購于Daiyafood、Violife；商品化動物奶酪1、2 分別購于淘吉奶酪棒、夏洛克奶酪棒；胰蛋白酶（酶活250 U/mg）、胃蛋白酶（酶活3 000 U/g）、胰脂肪酶（酶活30 000 U/mg）均購于上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），德國生物弗羅克斯；考馬斯亮藍R-250，上海源葉生物科技有限公司。使用的所有其他化學品都是分析級的。

1.2 主要儀器設備

主要儀器設備如表1 所示。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆-堅果奶酪類似物的制備

大豆-堅果奶酪類似物的制備工藝流程如下：

大豆、腰果打漿→大豆乳腰果乳混合→加入椰子油、葵花籽油、巴旦木蛋白→均質（1 500 r/min、10 min）→加入檸檬酸、乳酸酸化（45 ℃、2 h）→加入TG 酶交聯(lián)（45 ℃、2 h）→過濾乳清→凝乳→膠體蔗糖復合溶液加入凝乳→攪拌→奶酪漿液→裝?！鋮s成型

以感官評分作為大豆-堅果奶酪類似物品質的主要評價指標，探究油脂種類和含量、酸化劑、蛋白質含量、膠體、TG 酶含量對其品質的影響，確定響應面優(yōu)化最佳因素水平；進一步利用響應面的中心組合試驗優(yōu)化大豆-堅果奶酪類似物的最佳工藝配方。

1.3.2 感官評價

參照奶酪的食品安全國家標準GB 5420-2021 招募十名人員，五名男性，五名女性，年齡18～30 歲，培訓后對樣品進行感官評價。感官評分標準見表2，計算十名感官評分員的平均分即為樣品的最終得分。

表2 大豆-堅果奶酪類似物的感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria of soybean-nut cheese analogues

1.3.3 化學組分測定

對大豆-堅果奶酪類似物的粗脂肪（GB 5009.6-2016）、蛋白質（杜馬斯燃燒定氮法，蛋白質系數(shù)為6.25）、灰分（GB 5009.4-2016）、水分（GB 5009.3-2016）進行測定，差值法計算總碳水化合物[11]。

1.3.4 質構測定

將大豆-堅果奶酪類似物和商品化奶酪切塊成3 mm×3 mm×3 mm 的正方體，采用TPA 模式對樣品進行兩次壓縮。選用P/2 圓柱形探頭（直徑為5 mm），探頭在測試前、測試中和測試后的速率分別為2、1、2 mm/s，觸發(fā)力為0.20 N，將壓縮應變設為60%。

1.3.5 體外消化

根據(jù)Minekus 等[12]的方法建立體外模擬靜態(tài)消化模型，并略作改動，消化液組成用NaCl 代替NaHCO3[13]。將大豆-堅果奶酪類似物口腔咀嚼2 min 左右，直至適合吞咽的顆粒大小，取樣品。將樣品和唾液（SSF）1:1 混合，在pH 值7.0，37 ℃條件下消化2 min[14]。將口腔食糜與胃液（SGF）1:1混合，加入胃蛋白酶使其活性達到2 000 U/mL，調pH 值至3.0，在37 ℃消化2 h[15]。將上述胃消化后的食糜與腸液（SIF）1:1 混合，加入膽汁鹽溶液（最終濃度為10 mmol/L）、胰蛋白酶（活性100 U/mL）和胰脂肪酶（活性2 000 U/mL），調pH 值至7.0，消化2 h 后在100 ℃水浴5 min 將酶滅活，終止反應。分別在胃消化0、30、60、120 min，腸消化135、150、180、240 min 取樣進行SDS-PAGE，分析蛋白質消化情況。

1.3.5.1 SDS-PAGE

將消化液樣品離心取沉淀物并進行真空干燥，對干燥樣品進行SDS-PAGE 分析。將樣品稀釋液（質量分數(shù)為1%的蛋白溶液）與上樣緩沖液（體積分數(shù)為10%的甘油，質量分數(shù)為10%的SDS，1.0 mol/L pH 值6.8 的Tris-HCl 緩沖液，體積分數(shù)為1%的β-巰基乙醇，質量分數(shù)為0.1%的溴酚藍）混合，沸水浴5 min。制備體積分數(shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠，膠板厚度為1 mm，上樣量為15 μL，于恒壓下進行電泳。凝膠電泳后，用考馬斯亮藍（R-250）溶液染色1 h，然后在乙醇乙酸脫色液中脫色，直到觀察到清晰的背景。使用分子成像儀Gel DocXR 系統(tǒng)（Bio-Rad）掃描SDS-PAGE 凝膠并用Image J 軟件對譜帶強度進行分析[16]。

1.3.5.2 游離脂肪酸的測定

腸消化階段，使用自動滴定儀通過pH-Endpoint方法監(jiān)測H+的產生，測定游離脂肪酸（FFA）釋放速度。采用0.1 mol/L 的NaOH 自動滴定，保持消化過程中pH 值為7.0，記錄全程NaOH 的體積消耗曲線，參考Hu 等[17]的方法計算游離脂肪酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗重復3 次，結果為平均值±標準誤差，使用Origin 2018 作圖；采用SPSS 26 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 大豆-堅果奶酪類似物的制備

以感官評分為參考指標，研究油脂含量、不同油的比例、酸化劑含量、TG 酶含量、膠體含量及蛋白質含量對大豆-堅果奶酪類似物品質的影響（皆為質量分數(shù)），結果如圖1 所示。當植物油3.60%、蛋白質1.80%、TG 酶0.40%，酸化劑0.20%（其中檸檬酸0.10%，乳酸0.10%）以及親水膠體1.10%（其中卡拉膠0.60%，黃原膠0.20%，刺槐豆膠0.30%）時，大豆-堅果奶酪類似物的感官評分最高，分別為81.70、85.65、80.20、82.00、85.20 分。依據(jù)此結論，進一步以大豆-堅果奶酪類似物感官評分作為響應值，采用對其感官評分有顯著影響的油含量、蛋白含量、TG 酶含量和膠體含量為4 因素，進行4 因素3 水平的響應面分析實驗，試驗因素水平見表3。運用響應面軟件共設計29 組試驗，結果如表4 所示。驗證這四個因素彼此之間的交互作用，從而得出最優(yōu)配方組合為油脂3.09%，蛋白2.01%，TG 酶0.33%，膠體1.08%（其中卡拉膠0.60%，黃原膠0.20%，刺槐豆膠0.28%）。后續(xù)對該最佳配方制備的大豆-堅果奶酪類似物的理化、質構、感官及消化特性進行系統(tǒng)性研究。

圖1 油脂含量（a）、不同油比例（b）、酸化劑含量（c）、TG酶含量（d）、膠體含量（e）及蛋白質含量（f）對大豆-堅果奶酪類似物感官評價的影響Fig.1 The effects of oil content (a),proportion of different oils (b),acidifier content (c),TG enzyme content (d),colloid content (e),protein content (f) on sensory evaluation scores of soybean-nut cheese analogues

表3 響應面優(yōu)化實驗的因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface optimized experiments

表4 響應面分析方案及結果Table 4 Response surface analysis and results

2.2 大豆-堅果奶酪類似物的化學組成

大豆-堅果奶酪類似物與商品化動物/植物基奶酪化學組成如表5 所示?？芍蠖?堅果奶酪類似物的蛋白質含量遠高于商品化植物基奶酪制品，甚至是優(yōu)于商品化動物奶酪制品；碳水化合物含量顯著低于商品化植物基和動物基奶酪；脂肪含量也相對較低。另外，大豆-堅果奶酪類似物蛋白質含量顯著高于張琦[18]報告的大豆奶酪（7.10%～13.60%），脂肪含量低于Vs 等[19]報告的豆乳-椰奶制作的奶酪類似物（25.61%～27.10%）與Ali 等[20]的牛奶-豆乳奶酪（43.51%～47.33%）。這些結果表明本研究所制備的大豆-堅果奶酪類似物具有高蛋白、低碳水化合物、低脂肪的特點，這也正是符合當代消費者對健康食品的理念。

表5 大豆-堅果奶酪類似物與商品化動物/植物基奶酪制品的化學組成表Table 5 Chemical compositions of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.3 大豆-堅果奶酪類似物的質構

奶酪的質構與奶酪的組成和結構密切相關，是評價奶酪品質的一項重要指標。圖2 是大豆-堅果奶酪類似物和商品化動物和植物基奶酪制品的硬度值比較。結果發(fā)現(xiàn)，大豆-堅果奶酪類似物的硬度為0.88 N，與商品化植物基奶酪1（0.98 N）和動物奶酪2 硬度值（0.94 N）沒有顯著性差異，但明顯低于商品化動物奶酪1（1.41 N）和植物奶酪2 的硬度值（2.18 N）。可能原因是大豆-堅果奶酪類似物含有較低的脂肪和碳水化合物含量，形成的凝膠網絡結構要弱于其它商品化奶酪產品。這與前人研究結果一致，Rogers 等[21]提到在奶酪中脂肪小球占據(jù)蛋白質基質的空間，在奶酪中隨著脂肪含量的增加，脂肪顆粒會破壞蛋白質的網絡結構，從而導致硬度值下降。此外，有文獻提到在凝乳中加入多糖，凝膠機械強度會隨碳水化合物（多糖）濃度的增加而增加，侯俊杰[22]采用大豆球蛋白（SG）-甜菜果膠（SBP）制備凝膠，隨著SBP 含量的增加，凝膠的破裂應力從11.13 N 增加到31.39 N。

圖2 大豆-堅果奶酪類似物與商品化動物/植物基奶酪制品的質構Fig.2 Texture properties of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.4 大豆-堅果奶酪類似物的感官評價

對大豆-堅果奶酪類似物進行感官評價，并與商品化動物/植物基奶酪進行比較，結果見圖3。從圖3a 可知大豆-堅果奶酪類似物的外觀與商品化動物奶酪兩者皆表皮均勻、無損傷，色澤呈乳白色、有光澤，商品化植物基奶酪表皮無光澤、粗糙，存在裂縫。從圖3b 可知商品化動物奶酪整體感官評分8.00 分、口感氣味8.50 分，大豆-堅果奶酪類似物在色澤、外形和組織狀態(tài)可與商品化動物奶酪相媲美但整體感官為7.71 分不及動物奶酪，因為在口感及氣味（7.98 分）上不夠理想，仍存在少量的豆類風味，乳脂感較差。植物基奶酪1、2 的色澤（5.65 分、5.27 分）、外形（5.98 分、5.24 分）評分最低，與圖3a 相對應。其質地粗糙呈顆粒狀，因為大量使用碳水化合物來取代脂肪使產品具有顆粒狀質地[23]，同時存在一種令人不愉快的味道，這可能與調味劑用量過多有關[24]，因此感官評分最低（6.31分、5.18 分）?？偟膩碚f，大豆-堅果奶酪類似物比商品化植物基奶酪接受度更高，但對比動物奶酪其口感、風味略有不足。

圖3 大豆-堅果奶酪類似物與商品化動物/植物基奶酪制品的外觀（a）和感官評價雷達圖（b）Fig.3 The appearance (a) and sensory evaluation radar map(b) of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.5 大豆-堅果奶酪類似物的儲藏穩(wěn)定性

本研究還考察了大豆-堅果奶酪類似物在4 ℃貯藏條件下的外觀和硬度變化，結果如圖4 所示。樣品隨著儲藏時間的增加光澤度略微降低，出現(xiàn)輕微析水的現(xiàn)象，硬度值緩慢增加，貯存20 d 其硬度從0.94 N 增加到1.15 N。這個結果可能與儲藏過程中水分的析出和脂肪氧化有關，增強了體系內蛋白質、脂肪和碳水化合物之間的相互作用。Ramos等[25]發(fā)現(xiàn)了類似的結果，未涂層奶酪在儲藏20 d 后硬度值從0.25 N 增加到2.00 N。

圖4 大豆-堅果奶酪類似物在4 ℃貯藏條件下的外觀和硬度變化Fig.4 The appearance and hardness of soybean-nut cheese analogues during storage at 4 ℃

2.6 大豆-堅果奶酪類似物的消化特性

樣品在消化過程中的外觀變化圖如圖5 所示，圖5a 可觀察到在胃消化初始階段，消化液有明顯的大顆粒，到120 min 胃消化結束，在胃液、胃蛋白酶作用下，消化液固體內容物明顯減少；隨著腸道消化的進行，肉眼可見消化液渾濁，腸道消化結束時大顆粒不存在。

圖5 大豆-堅果奶酪類似物在靜態(tài)消化過程中的消化產物（a）、SDS-PAGE圖譜（b）、條帶灰度值（條帶對應于SDS-PAGE結果，c）Fig.5 The photos of digestive product (a),SDS-PAGE profile(b),band intensity (c) of soybean-nut cheese analogues during digestion in vitro

圖5b 是樣品消化內容物的SDS-PAGE 圖譜。消化內容物具有五條清晰條帶（a、b、c、d、e），其中a 條帶主要是小分子蛋白和多肽，bc 條帶主要包括11S 球蛋白堿性亞基B（20～25 ku）和2S 白蛋白（18～22 ku），d 條帶主要是11S 球蛋白酸性亞基A（30～37 ku），e 條帶是7S 球蛋白，由α亞基（72 ku）、α′亞基（85 ku）和β亞基（53 ku）三種亞基組成。大豆蛋白中11S 和7S 的含量最高，達到了總蛋白含量的70%～75%[26]，腰果蛋白中包括7S 球蛋白[27]，但e 條帶在SDS-PAGE 圖譜上不清晰，主要是因為對大豆和腰果進行熱處理會使7S 蛋白完全變性[28,29]，同時在凝乳過程中TG 酶使7S 蛋白交聯(lián)形成更大分子量的蛋白，可以觀察到樣品槽中存在少量大分子聚集體無法進入濃縮膠[30]，造成7S條帶變淺。

在胃消化階段，所有條帶從30～60 min 顏色逐漸加深，這可能是蛋白質先從基質中釋放出來導致的，之后隨著消化的進行，b、c、d、e 的蛋白條帶明顯變淺，同時a 條帶顏色加深，說明隨著消化時間延長蛋白質逐漸被水解成6～15 ku 的多肽和小分子蛋白，在腸道消化180 min 后所有條帶消失，說明蛋白被水解成更小的短肽或氨基酸。進一步分析條帶灰度值，灰度值越大蛋白質含量越高。如圖5c 所示所有條帶在胃消化30～60 min 灰度值增加，之后隨著消化時間的增加，b、c、d、e 條帶的灰度值急劇降低，條帶a 灰度增加，在180 min 時灰度值趨近0，與圖5b 結果一致。這與傳統(tǒng)奶酪中酪蛋白水解動力學一致，在胃消化120 min 時，凝膠上看不到完整的酪蛋白，但仍可見約4～6 ku 的大片段酪蛋白和多肽，在腸道消化180 min 后，酪蛋白已經完全消失[31]。

脂肪主要在小腸被水解為甘油、脂肪酸等，通過記錄NaOH 的體積消耗曲線，能夠計算出產生的游離脂肪酸含量，從而分析樣品脂肪消化速率。圖6 顯示了腸消化過程中游離脂肪酸的釋放行為。大豆-堅果奶酪類似物在消化初期FFA 釋放速率緩慢，1 h 后釋放速率快速增長，在腸消化結束時，F(xiàn)FA 釋放速率為60%，說明脂肪沒有被完全消化。Lamothe 等[32]比較不同動物干酪在胃腸道環(huán)境中脂肪酸釋放的動力學，了解到不同動物干酪的脂肪酸釋放率平均為80%。由此說明，大豆-堅果奶酪類似物脂肪具有一定抗消化能力且相較于動物奶酪具有更低的脂肪消化率。

圖6 大豆-堅果奶酪類似物消化中游離脂肪酸的釋放行為Fig.6 Release of FFA from soybean-nut cheese analogues during digestion

3 結論

在大豆乳50.00%和腰果乳50.00%混合的基礎上，以植物乳質量為基準，依次添加3.09%植物油（椰子油與葵花籽油比例為7:3）、2.01%巴旦木蛋白、0.33% TG 酶、0.10%檸檬酸、0.10%乳酸；以凝乳質量為基準添加1.08%膠體，4.00%蔗糖，可制備出最佳品質的大豆-堅果奶酪類似物（以上皆為質量分數(shù)）。該大豆-堅果奶酪類似物含有蛋白質20.05%，脂肪13.83%，水分62.53%，灰分0.43%，碳水化合物3.16%，具有高蛋白、低脂肪、低碳水化合物的優(yōu)點，符合現(xiàn)代消費者對健康食品的追求。大豆-堅果奶酪類似物的硬度為0.88 N，整體感官評分為7.71 分，質構特性和感官特性與商品化動物奶酪相似，但口感和氣味略遜色。隨著儲藏時間的延長，大豆-堅果奶酪類似物硬度從0.94 N 上升到1.15 N，有輕微上升，主要是由于有少量水從奶酪凝膠中析出。體外靜態(tài)消化結果發(fā)現(xiàn)蛋白電泳條帶在消化180 min 時消失，說明其蛋白質易于被消化，F(xiàn)FA釋放速率為60%，脂肪未被完全消化。綜上所述，大豆-堅果奶酪類似物可以作為動物奶酪的替代品。