沒食子酸-磷脂復(fù)合物的制備與表征及其對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的影響

杜伊晗，何強(qiáng)，董怡

（四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）

核桃多酚具有多種健康功效與生物活性，主要存在于核桃內(nèi)種皮中，但它們大多為水溶性多酚，難以隨油被提取，大多殘留在副產(chǎn)物核桃餅粕中，故核桃油中多酚含量較低[1]。對(duì)作為核桃油副產(chǎn)物的核桃多酚加以利用，不僅可以減少原料浪費(fèi)，還可獲得良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益，近年來受到廣泛關(guān)注。

沒食子酸，亦稱五倍子酸或棓酸，其結(jié)構(gòu)如圖1a所示，是核桃多酚的重要組成成分。沒食子酸具有以抗炎、抗突變、抗氧化性為代表的多種生物活性，安全無毒[2]，可作為天然食品抗氧化劑[3]。然而，較差的脂溶性限制了沒食子酸在食品中的應(yīng)用。

圖1 沒食子酸(a)和磷酸甘油酯(b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of gallic acid and phospholipid

磷脂即含磷酸基團(tuán)的脂類化合物，是脂質(zhì)中非常重要的一部分，廣泛分布于動(dòng)植物細(xì)胞中，對(duì)維持正常生命活動(dòng)有至關(guān)重要的作用[4]，對(duì)人體還有護(hù)肝等健康作用，添加于食物中可提高食物的營養(yǎng)價(jià)值[5,6]。磷脂結(jié)構(gòu)如圖1b 所示，其分子具有雙親性，連接磷酸基團(tuán)的一端具有親水性，長烴基鏈一端則具有疏水性。

在一定條件下，磷脂的磷酸端與植物多酚可相互作用結(jié)合形成多酚磷脂復(fù)合物，在保持多酚良好生物活性的同時(shí)改善多酚的脂溶性，可有效提高多酚的生物利用度[7]，拓展多酚的應(yīng)用范圍。多酚磷脂復(fù)合物作為一種具有良好脂溶性的多酚類新型產(chǎn)品，已在化妝品與藥品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[8]，關(guān)于其生物活性與在食品中的應(yīng)用的研究卻較少。

本研究以沒食子酸和大豆卵磷脂為原料，制備沒食子酸-磷脂復(fù)合物，并通過研究沒食子酸-磷脂復(fù)合物的脂溶性、體外抗氧化活性以及對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的影響，為沒食子酸-磷脂復(fù)合物的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮榨核桃油，云南源臨尚品食品有限公司；沒食子酸（純度99%）、大豆卵磷脂（磷脂酰膽堿＞90%，分子量：758.06），上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

DF-101T 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ3200DE 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-6000PC 紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Synergy H1 多功能微孔板檢測(cè)儀，美國伯騰儀器有限公司；SHA-C 水浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，美國安捷倫；IRTracer-100 傅立葉紅外光譜儀，日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸-磷脂復(fù)合物的制備

采用溶劑蒸發(fā)法制備沒食子酸-磷脂復(fù)合物：按一定摩爾比稱取適量沒食子酸和大豆卵磷脂，溶解于無水乙醇中，一定溫度下持續(xù)攪拌一定時(shí)間，后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入適量二氯甲烷復(fù)溶，并使用0.45 μm 微孔濾膜過濾除去未與磷脂復(fù)合的游離沒食子酸沉淀，再將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，即得到?jīng)]食子酸-磷脂復(fù)合物產(chǎn)物。

1.2.2 復(fù)合物制備條件優(yōu)化

1.2.2.1 復(fù)合率測(cè)定

根據(jù)紫外全掃描光譜結(jié)果，沒食子酸-磷脂復(fù)合物與游離沒食子酸具有相同的特征吸收峰，且峰高并不會(huì)受復(fù)合影響，故使用紫外分光光度法測(cè)定復(fù)合物中沒食子酸含量。

以沒食子酸無水乙醇溶液為標(biāo)品，繪制吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將產(chǎn)物溶于10 mL 無水乙醇中，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物中沒食子酸含量，計(jì)算沒食子酸復(fù)合率。

式中：

D——復(fù)合率，%；

W0——投入沒食子酸質(zhì)量，mg；

W1——產(chǎn)物中沒食子酸質(zhì)量，mg。

1.2.2.2 復(fù)合條件的優(yōu)化

復(fù)合方法的選擇：按摩爾比1:4 將沒食子酸與大豆卵磷脂溶解于無水乙醇中，沒食子酸濃度為0.5 mg/mL，溶液分別于55 ℃下靜置或攪拌，反應(yīng)4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，提純得復(fù)合物產(chǎn)物，測(cè)定所得產(chǎn)物的復(fù)合率。

原料摩爾比：分別按摩爾比2:1、1:1、1:2、1:4、1:6將沒食子酸與大豆卵磷脂溶解于無水乙醇中，使沒食子酸質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，將溶液于55 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，提純得復(fù)合物產(chǎn)物，測(cè)定所得產(chǎn)物的復(fù)合率。

復(fù)合溫度：按摩爾比1:4 稱取沒食子酸與大豆卵磷脂，溶解于無水乙醇中，使沒食子酸質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將溶液分別于25、35、45、55 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，提純得復(fù)合物產(chǎn)物，測(cè)定所得產(chǎn)物的復(fù)合率。

沒食子酸質(zhì)量濃度：按摩爾比1:4 稱取沒食子酸與大豆卵磷脂，溶解于無水乙醇中，使沒食子酸質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、2.5 mg/mL，將溶液于45 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，提純得復(fù)合物產(chǎn)物，測(cè)定所得產(chǎn)物的復(fù)合率。

復(fù)合時(shí)間：按摩爾比1:4 稱取沒食子酸與大豆卵磷脂，溶解于無水乙醇中，使沒食子酸質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，將溶液于45 ℃下攪拌，分別反應(yīng)2、3、4、5 h，后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，提純得復(fù)合物產(chǎn)物，測(cè)定所得產(chǎn)物的復(fù)合率。

制備條件的驗(yàn)證：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的最優(yōu)制備條件，制備3 批沒食子酸-磷脂復(fù)合物，測(cè)定復(fù)合率。

1.2.3 沒食子酸-磷脂復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征與性能評(píng)價(jià)

1.2.3.1 紫外全吸收光譜

以無水乙醇為溶劑，配制一定質(zhì)量濃度的沒食子酸-磷脂復(fù)合物溶液；分別以復(fù)合物溶液中沒食子酸與磷脂的質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)，配置相同質(zhì)量濃度的沒食子酸溶液、大豆卵磷脂溶液和沒食子酸磷脂物理混合物溶液；測(cè)定各溶液在200～400 nm 范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.2.3.2 差示量熱掃描

取適量的沒食子酸、大豆卵磷脂、沒食子酸-磷脂復(fù)合物以及對(duì)應(yīng)的物理混合物2 mg，以空坩堝為參比，升溫速率定為10 ℃/min、溫控范圍50～300 ℃、N2流速為30 mL/min，對(duì)各待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行差示熱量掃描分析。

1.2.3.3 紅外光譜

分別以沒食子酸、大豆卵磷脂、沒食子酸-磷脂復(fù)合物及對(duì)應(yīng)的物理混合物為樣品，進(jìn)行紅外光譜分析。取樣品適量混合溴化鉀壓片，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為1 cm-1。

1.2.3.4 HPLC 測(cè)定油水分配系數(shù)

分別取過量的沒食子酸、沒食子酸-磷脂復(fù)合物于具塞試管中，加入10 mL 蒸餾水或脂性有機(jī)溶劑，密封后于20 ℃避光條件下振搖24 h，后取出，4 000 r/min 離心10 min，取上清液加流動(dòng)相稀釋混勻，按HPLC 條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算沒食子酸在不同溶劑中的溶解度。本實(shí)驗(yàn)使用的脂性有機(jī)溶劑為二氯甲烷。

HPLC 條件：色譜柱：Shiseido C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長268 nm，梯度洗脫（流動(dòng)相A 為色譜甲醇，流動(dòng)相B 為0.1%磷酸水溶液），洗脫時(shí)間20 min，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

梯度洗脫：0～10 min 內(nèi)，流動(dòng)相A 從100%變?yōu)?0%，流動(dòng)相B 從0%變?yōu)?0%；10～15 min 內(nèi)，流動(dòng)相A 變?yōu)?00%，并保持5 min。

1.2.3.5 體外抗氧化能力

分別對(duì)沒食子酸、沒食子酸-磷脂復(fù)合物及大豆卵磷脂的體外抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)Vayalil等[9]的方法，測(cè)定DPPH 自由基清除能力。參考蔡如玉等[10]的方法，測(cè)定ABTS+自由基清除能力。參考Josué 等[11]和常強(qiáng)等[12]的方法，并做適當(dāng)修改，測(cè)定氧自由基吸收能力（ORAC）。

1.2.4 沒食子酸-磷脂復(fù)合物對(duì)核桃氧化穩(wěn)定性的影響

1.2.4.1 核桃油樣品的制備及加速氧化試驗(yàn)

樣品的添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%（以沒食子酸當(dāng)量計(jì)，大豆卵磷脂以沒食子酸-磷脂復(fù)合物中的大豆卵磷脂當(dāng)量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)），將沒食子酸、沒食子酸-磷脂復(fù)合物和大豆卵磷脂樣品分別溶于核桃油中，分裝（每瓶30 g）后于60 ℃下恒溫保存。每12 h 振蕩一次，并改變其在恒溫箱中位置。分別在第0、3、6、9 和12 天取樣，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。以未添加任何物質(zhì)的核桃油為空白組。

1.2.4.2 氧化指標(biāo)測(cè)定

參照《GB5009.37-2003 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中比色法，進(jìn)行核桃油過氧化值的測(cè)定。參照《GB5009.37-2003 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，測(cè)定核桃油的酸價(jià)。

1.2.4.3 核桃油脂的同步熒光測(cè)定

參照馮蘇敏[13]的方法并做適當(dāng)修改。熒光分光光度計(jì)預(yù)熱20 min，使用四面透光石英比色皿，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫皆為5 nm，間隔為10 nm，激發(fā)波長范圍為200～800 nm，發(fā)射波長為210 nm，掃描速度為1 200 nm/min，光電倍增管PMT 為700 V，進(jìn)行同步激發(fā)-發(fā)射熒光掃描（注：用正己烷洗凈比色皿，再測(cè)量下個(gè)樣品）。

1.2.4.4 色澤

參照《GB/T 22460-2008 動(dòng)植物油脂羅維朋色澤的測(cè)定》和曹君[14]的方法測(cè)定油脂色澤，分別以L*值、a*值及b*值表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行三次平行操作，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OriginPro 2022b 軟件繪圖。在P＜0.05 時(shí)差異顯著。所有樣品均至少設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸-磷脂復(fù)合物的制備條件優(yōu)化

使用靜置和攪拌兩種方式進(jìn)行復(fù)合物的制備，攪拌制備的復(fù)合物復(fù)合率93.66%，顯著高于靜置組75.96%（P＜0.05），攪拌使沒食子酸和大豆卵磷脂更充分接觸，反應(yīng)更加充分，故選擇攪拌的方法進(jìn)行復(fù)合物的制備。

沒食子酸與大豆卵磷脂摩爾比對(duì)復(fù)合率的影響結(jié)果如圖2a 所示。隨著大豆卵磷脂占比的增大，復(fù)合率逐漸上升，投料比1:4 時(shí)達(dá)到最高93.84%，而大豆卵磷脂比例更大時(shí)復(fù)合率降低，這可能是由于大豆卵磷脂過量，使沒食子酸和大豆卵磷脂接觸面積較小，遮蔽了大豆卵磷脂上復(fù)合作用位點(diǎn)，導(dǎo)致復(fù)合率下降。投料比與復(fù)合物的復(fù)合過程密切相關(guān)，可能會(huì)影響到?jīng)]食子酸與大豆卵磷脂復(fù)合的結(jié)構(gòu)，1:4 時(shí)復(fù)合率最高說明該比例下形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，即選擇1:4 為最佳投料比。

復(fù)合溫度對(duì)復(fù)合率的影響結(jié)果如圖2b 所示。復(fù)合率隨著溫度的上升而逐漸上升，在45 ℃時(shí)達(dá)到峰值76.06%，后逐漸下降；可能是由于復(fù)合物不穩(wěn)定，過高的溫度易導(dǎo)致其分解，出現(xiàn)復(fù)合率下降的現(xiàn)象，故選擇45 ℃作為最佳復(fù)合溫度。

如圖2c 所示，當(dāng)沒食子酸質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，復(fù)合率達(dá)86.33%，顯著高于其他質(zhì)量濃度的復(fù)合率，可能由于溶液中的底物反應(yīng)須經(jīng)碰撞發(fā)生，適當(dāng)?shù)牡孜餄舛瓤商峁┝己玫姆磻?yīng)環(huán)境而有利于反應(yīng)的發(fā)生[15]，故選擇1 mg/mL 為沒食子酸的最佳制備質(zhì)量濃度。

復(fù)合時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響結(jié)果如圖2d 所示。反應(yīng)時(shí)間為3 h 組的復(fù)合率最高，可達(dá)94.08%，2 h組復(fù)合率為91.85%；然而2 h 組與3 h 組無顯著差異，說明在2 h 時(shí)反應(yīng)已接近完全，為節(jié)約時(shí)間，選擇2 h 為最適宜的復(fù)合時(shí)間。

綜上所述，優(yōu)化所得最佳制備條件為：將沒食子酸與大豆卵磷脂按摩爾比1:4 溶于無水乙醇，使沒食子酸質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在45 ℃下攪拌反應(yīng)2 h。按優(yōu)化所得的沒食子酸-磷脂復(fù)合物最優(yōu)制備條件制備3 批復(fù)合物，所得平均復(fù)合率為94.65%。

2.2 復(fù)合物結(jié)構(gòu)表征與性能評(píng)價(jià)

2.2.1 光譜特征

如圖3a 所示，磷脂在213 nm 處具有最大吸收峰，沒食子酸、沒食子酸-磷脂復(fù)合物及對(duì)應(yīng)物理混合物的吸收?qǐng)D譜形狀則十分相近，均在227 nm 和268 nm 處有兩個(gè)最大吸收峰出現(xiàn)，且峰高基本一致，說明與大豆卵磷脂復(fù)合并不會(huì)影響沒食子酸的紫外吸收，復(fù)合前后沒食子酸的發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，而大豆卵磷脂中的發(fā)色團(tuán)則發(fā)生了變化。因此可使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定復(fù)合物溶液中沒食子酸含量；且由于磷脂在213 nm 處有吸收峰，易對(duì)沒食子酸在227 nm 處的吸收峰造成干擾，選擇268 nm處作為沒食子酸的最大吸收波長，進(jìn)行沒食子酸含量的測(cè)定。

圖3 沒食子酸、大豆卵磷脂及其物理混合物和沒食子酸-磷脂復(fù)合物的紫外全吸收光譜（a）和紅外光譜（b）Fig.3 UV absorption spectrum (a) and Infrared spectrum (b)of gallic acid,soy lecithin,their physical mixture and gallic acid phospholipid complex

如圖3b 所示，沒食子酸紅外光譜圖中有-OH的特征峰（3 500 cm-1，3 280 cm-1處），C-O 特征峰（1 670 cm-1處），苯環(huán)骨架振動(dòng)峰（1 430，1 540，1 610 cm-1處），HCR=CRH 苯環(huán)峰（687 cm-1）處，以及酚羥基的特征峰（1 030 cm-1）；而大豆卵磷脂紅外光譜圖中的特征吸收峰有不飽和C 上H 的伸縮振動(dòng)峰（3 010 cm-1），飽和C 上H 的伸縮振動(dòng)（2 920 和2 850 cm-1處），C=O 碳氧雙鍵特征峰（1 730 cm-1處）。

沒食子酸與大豆卵磷脂的物理混合物的紅外光譜為沒食子酸和大豆卵磷脂兩者特征峰的并集，既有沒食子酸中-OH 的特征峰（3 500 cm-1），也有大豆卵磷脂中P-O-C 的特征峰（1 060 cm-1處），但峰強(qiáng)度減弱，且-OH 的特征峰（3 280cm-1處）消失，可能為沒食子酸被大豆卵磷脂部分包裹遮蔽導(dǎo)致的。而沒食子酸-磷脂復(fù)合物的紅外光譜與物理混合物的光譜相近，也保留了沒食子酸和大豆卵磷脂的部分特征峰，但峰強(qiáng)度較物理混合物更低，可能由于復(fù)合物中大豆卵磷脂對(duì)于沒食子酸的包裹程度更高。此外，復(fù)合物光譜還發(fā)生了幾處改變：沒食子酸中苯環(huán)鄰二取代的特征峰（735 cm-1處）以及-OH 的特征峰（3 280 cm-1處）消失；3 500 cm-1處同樣代表-OH 的特征峰大幅減弱，且平移至3 460 cm-1處，可能為氫鍵導(dǎo)致的波動(dòng)[16]。原存在于大豆卵磷脂中代表P-O-C 的1 060 cm-1處特征峰消失，1 170 cm-1處特征峰出現(xiàn)波數(shù)變小的平移，說明大豆卵磷脂中此結(jié)構(gòu)有所改變，推測(cè)是該結(jié)構(gòu)與沒食子酸的羥基間發(fā)生相互作用，形成了氫鍵的結(jié)果[17]。即大豆卵磷脂的極性端與沒食子酸的極性端相結(jié)合，形成沒食子酸-磷脂復(fù)合物，這與前人研究[18]結(jié)果相符。

綜合紫外與紅外光譜分析，復(fù)合物中無新化學(xué)鍵生成，但沒食子酸中苯環(huán)上中間位置的-OH 可能與大豆卵磷脂中的P-O-C 結(jié)構(gòu)形成了氫鍵，標(biāo)志并驗(yàn)證了復(fù)合物的形成。

2.2.2 差示量熱掃描

沒食子酸、大豆卵磷脂、沒食子酸-磷脂復(fù)合物及其物理混合物的差示量熱掃描圖如圖4 所示，沒食子酸在263 ℃處有明顯吸熱峰，此峰對(duì)應(yīng)其熔點(diǎn)；而大豆卵磷脂為非晶體，無固定熔點(diǎn)，其在230 ℃有吸熱峰，在289 ℃、332 ℃處有放熱峰；沒食子酸與大豆卵磷脂的物理混合物的圖譜基本為兩者的DSC 圖譜的簡單疊加，沒食子酸原在263 ℃的吸熱峰以及大豆卵磷脂在230 ℃的吸熱峰合并為一個(gè)吸熱峰，移至了238 ℃處，可能是由于混合物“熔點(diǎn)降低”的現(xiàn)象，混合物的熔點(diǎn)會(huì)低于兩純凈物熔點(diǎn)的平均值。而沒食子酸-磷脂復(fù)合物的圖譜不同于沒食子酸、大豆卵磷脂和混合物的圖譜，原沒食子酸和大豆卵磷脂單體的吸熱峰未合并，而是出現(xiàn)小范圍的平移，且在255 ℃、270 ℃出現(xiàn)了新的吸收峰，具有其獨(dú)特的特征曲線，故認(rèn)為復(fù)合物是不同于沒食子酸、大豆卵磷脂及兩者物理混合物的新物質(zhì)。

圖4 沒食子酸、大豆卵磷脂、兩者物理混合物和沒食子酸-磷脂復(fù)合物的差示量熱掃描圖Fig.4 DSC of gallic acid,soy lecithin,their physical mixture and gallic acid phospholipid complex

2.2.3 復(fù)合物的油水分配系數(shù)

分別測(cè)定沒食子酸及其復(fù)合物在水相和有機(jī)相中的溶解度，計(jì)算油水分配系數(shù)，結(jié)果如表1 所示。與沒食子酸相比，復(fù)合物在水中的溶解度降低，但其在有機(jī)相中的溶解度明顯增加，油水分配系數(shù)出現(xiàn)了明顯的增大，結(jié)合紅外光譜結(jié)果推斷，沒食子酸極性基團(tuán)與大豆卵磷脂的極性基團(tuán)通過氫鍵結(jié)合且被磷脂脂肪鏈包裹，呈現(xiàn)親脂性外層[19]，使復(fù)合物可溶于低極性溶劑，因而顯著提高了沒食子酸的脂溶性，拓展了其應(yīng)用范圍。

表1 沒食子酸及其復(fù)合物的油水分配系數(shù)Table 1 The oil-water partition coefficients of gallic acid and gallic acid phospholipid complex

2.2.4 體外抗氧化能力

分別測(cè)定相同沒食子酸當(dāng)量濃度下不同物質(zhì)對(duì)DPPH、ABTS+以及氧自由基吸收能力（ORAC），結(jié)果如表2 所示。大豆卵磷脂對(duì)于DPPH 和ABTS+兩種自由基的清除能力均較弱，遠(yuǎn)低于另外兩組；沒食子酸與復(fù)合物對(duì)于DPPH 和ABTS+兩種自由基的清除率無顯著差異。樣品的ORAC 值越高，即相對(duì)應(yīng)Trolox 的當(dāng)量越大，說明其氧自由基吸收能力越強(qiáng)。由表2 可知，沒食子酸-磷脂復(fù)合物的氧自由基吸收能力與沒食子酸無顯著差異，而大豆卵磷脂幾乎無氧自由基吸收能力。綜上，與磷脂復(fù)合并未影響沒食子酸的抗氧化能力，沒食子酸-磷脂復(fù)合物依舊具有較強(qiáng)的抗氧化能力，有作為抗氧化劑的潛力。

表2 沒食子酸、大豆卵磷脂及其復(fù)合物的體外抗氧化能力Table 2 The in-vitro antioxidant activity of gallic acid,phospholipid and gallic acid phospholipid complex

2.3 核桃油加速氧化

2.3.1 氧化指標(biāo)

如圖5a 所示，各組核桃油的過氧化值均隨儲(chǔ)藏時(shí)間而增加，表明加速氧化儲(chǔ)藏期間，油脂初級(jí)氧化階段生成的氫過氧化物大量積累，油脂氧化持續(xù)發(fā)生；沒食子酸-磷脂復(fù)合物組的核桃油在第0 天的過氧化值明顯高于其他各組，這可能是由于復(fù)合物所含的磷脂在復(fù)合物制備過程中發(fā)生輕微氧化[19]，引入部分氫過氧化物，導(dǎo)致核桃油的過氧化值升高。而儲(chǔ)藏12 d 后空白組、大豆卵磷脂組、沒食子酸、沒食子酸-磷脂復(fù)合物組酸價(jià)的增加量分別為0.025 5、0.025 0、0.023 0、0.013 0 meq/kg，其中沒食子酸組增量小于空白組，復(fù)合物組的增量顯著低于其余三組（P＜0.05），表明沒食子酸和復(fù)合物對(duì)核桃油氧化具有抑制作用，其中復(fù)合物的抑制能力顯著強(qiáng)于游離沒食子酸。12 d 儲(chǔ)藏期內(nèi)，各組核桃油的過氧化值均未超過GB2716-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物油》所要求的0.25 meq/kg。

圖5 加速氧化實(shí)驗(yàn)期間核桃油氧化指標(biāo)變化Fig.5 Changes of walnut oil during accelerated oxidation experiments

各組核桃油酸價(jià)隨儲(chǔ)藏時(shí)間變化如圖5b 所示，沒食子酸組和沒食子酸-磷脂復(fù)合物組的核桃油在第0 天的酸價(jià)明顯高于另外兩組，這可能是由于沒食子酸結(jié)構(gòu)中有羧基，呈酸性，導(dǎo)致油脂酸價(jià)上升，但未影響油脂中游離脂肪酸含量；而在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中，空白、大豆卵磷脂、沒食子酸、復(fù)合物各組均隨儲(chǔ)藏時(shí)間增加而上升，是因?yàn)殡S時(shí)間變化油脂氧化程度升高，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物游離脂肪酸含量升高；其中沒食子酸組在第3 天的酸價(jià)有所下降，可能是由于沒食子酸氧化降解速度大于油脂氧化生成脂肪酸的速度，導(dǎo)致油脂酸性略有降低，但不顯著。12 d 儲(chǔ)藏期內(nèi)，各組增量分別為0.169 6、0.173 4、0.136 5、0.109 4 mg/g，增量大小順序?yàn)椋簭?fù)合物組＜沒食子酸組＜空白組＜大豆卵磷脂組（P＜0.05），說明大豆卵磷脂對(duì)核桃油酸價(jià)升高并無抑制作用，而沒食子酸及其復(fù)合物可有效抑制核桃油酸價(jià)的升高，復(fù)合物的抑制效果優(yōu)于沒食子酸。12 d 儲(chǔ)藏期內(nèi)各組核桃油酸價(jià)均未超過GB2716-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物油》所要求的3.0 mg/g。

綜上，大豆卵磷脂對(duì)于核桃油氧化穩(wěn)定性無顯著影響，而復(fù)合物有效提高了核桃油的氧化穩(wěn)定性，且表現(xiàn)出比沒食子酸更優(yōu)的抗氧化效果。而由于沒食子酸-磷脂復(fù)合物與沒食子酸相比，脂溶性增加，但體外抗氧化能力無顯著差異，故認(rèn)為是沒食子酸-磷脂復(fù)合物通過提高沒食子酸在核桃油中的溶解度，使其作用濃度更高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化效果，且與大豆卵磷脂復(fù)合在一定程度上增強(qiáng)了沒食子酸的穩(wěn)定性，延長了其在核桃油中的作用時(shí)間[21]，在儲(chǔ)藏期內(nèi)充分發(fā)揮了其抗氧化作用，更有效地提高核桃油的氧化穩(wěn)定性。

2.3.2 同步熒光光譜

儲(chǔ)藏期間各組核桃油同步熒光光譜如圖6 所示。由空白組熒光光譜（圖6a）可知，核桃油在256、356、386、439 和667 nm 處有明顯吸收峰，認(rèn)為是核桃油的特征吸收峰[22]。研究顯示，植物油同步熒光光譜中熒光強(qiáng)度的減弱通常與植物油中酚類抗氧化物質(zhì)及色素的氧化降解有關(guān)，熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)與植物油中不飽和脂肪酸降解所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物有關(guān)[23]。

圖6 加速氧化實(shí)驗(yàn)期間核桃油同步熒光光譜變化Fig.6 Changes in synchronous fluorescence spectra of walnut oil during accelerated oxidation experiments

在儲(chǔ)藏過程中，空白組（圖6a）386 nm 處吸收峰的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，可能是由于油脂氧化時(shí)，脂肪酸里的C=O 鍵斷裂[24]，熒光基團(tuán)的數(shù)量隨之改變，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度出現(xiàn)波動(dòng)；而439 nm 處吸收峰熒光強(qiáng)度隨儲(chǔ)藏時(shí)間增長而增強(qiáng)，通常與油脂氧化產(chǎn)物：游離脂肪酸、氫過氧化物、酮醛類物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[14]，說明儲(chǔ)存過程中，核桃油持續(xù)發(fā)生氧化，氧化產(chǎn)物隨氧化進(jìn)程積累。大豆卵磷脂組（圖6c）同步熒光光譜形狀及變化趨勢(shì)與空白組相似，認(rèn)為大豆卵磷脂對(duì)核桃油熒光光譜影響較小，即對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性影響較小。

復(fù)合物組（圖6d）熒光光譜與沒食子酸組（圖6b）較相似，除了與空白組（圖6a）相同的256、356、386 和649 nm 處核桃油的特征吸收峰，還在361～381 nm 和421～507 nm 處有吸收峰群，認(rèn)為可能是沒食子酸的特征吸收峰；沒食子酸組和復(fù)合物組的361～381 nm 和421～507 nm 處吸收峰群隨時(shí)間變化峰值逐漸下降，可能是沒食子酸在氧化過程中發(fā)生降解，含量降低，其特征吸收峰熒光強(qiáng)度隨之下降[25]。

所有組別核桃油均在256 nm 和670 nm 處有吸收峰。有研究表明，256 nm 附近吸收峰為生育酚的熒光吸收峰[26]，且其隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長出現(xiàn)輕微波動(dòng)，可能是由于生育酚在多不飽和脂肪酸含量高的油脂中可作為共同氧化底物[14]，隨油脂氧化部分消耗；而670 nm 處的吸收峰屬于葉綠素類特征吸收峰的熒光區(qū)[27]，且其熒光強(qiáng)度不隨儲(chǔ)藏時(shí)間而變化，表明核桃油中含有少量葉綠素，且未參與油脂氧化。

2.3.3 色澤

各組核桃油色澤隨儲(chǔ)藏時(shí)間變化，如圖7 所示。

圖7 加速氧化實(shí)驗(yàn)期間核桃油色澤變化Fig.7 Changes in color of walnut oil during accelerated oxidation experiments

加入沒食子酸和復(fù)合物的核桃油L*值較低，說明沒食子酸的加入導(dǎo)致了核桃油的澄清度一定程度的降低。從第0 天到第12 天，所有樣品的L*值逐漸上升，即隨時(shí)間變化，油脂氧化程度升高，油脂的清亮程度隨之升高，但這種變化在肉眼上不易察覺。

從第0 天到第12 天，所有樣品的a*值均為負(fù)值，表明核桃油顏色偏綠；空白組a*絕對(duì)值逐漸下降后又上升，大豆卵磷脂和沒食子酸組a*絕對(duì)值逐漸上升，說明核桃油變綠；可能是氧化造成色素的變化，復(fù)合物組有先上升后下降的波動(dòng)，但整個(gè)加速氧化過程中，a*值的總體變化較小，在肉眼上很難察覺。

所有樣品組的b*值從第0 天到第18 天均逐漸下降，說明油脂黃色變淡，可能是由于黃色色素隨氧化進(jìn)程而被分解，但數(shù)值變化量較小，此變化肉眼幾乎無法察覺。計(jì)算儲(chǔ)藏前后b*值的差值可知，大豆卵磷脂、沒食子酸及其復(fù)合物均可以有效減緩油脂b*值的下降趨勢(shì)。

2.3.4 相關(guān)性分析

計(jì)算各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)，如表3 所示。

表3 各組別核桃油不同指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients between indicators of walnut oil in various groups

所有組別中AV 與b*值的相關(guān)系數(shù)均為負(fù)數(shù)且絕對(duì)值均大于0.8，即油脂的酸價(jià)與黃藍(lán)色度兩者呈負(fù)相關(guān)。所有組別中，POV 值與b*的相關(guān)系數(shù)均為負(fù)值，認(rèn)為兩者呈負(fù)相關(guān)，且大豆卵磷脂與沒食子酸組的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.9，空白組相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于0.8，認(rèn)為油脂的黃藍(lán)色度與過氧化值呈負(fù)相關(guān)。故油脂黃藍(lán)色度可以作為油脂氧化程度的判斷指標(biāo)，油脂b*值越小，偏黃色程度降低，油脂的氧化程度越高。

由于沒食子酸抗氧化性強(qiáng)于常見的抗氧化劑維生素C[28]，而沒食子酸-磷脂復(fù)合物和沒食子酸相比，能更有效地提高核桃油的氧化穩(wěn)定性，且對(duì)油脂色澤影響較為輕微，故沒食子酸-磷脂復(fù)合物抗氧化性能較強(qiáng)，非常具有作為油脂抗氧化劑的潛力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用大豆卵磷脂為原料，使用溶劑蒸發(fā)法制備沒食子酸-磷脂復(fù)合物。以復(fù)合率為指標(biāo)，使用單因素試驗(yàn)方法優(yōu)化并獲得了一種沒食子酸-磷脂復(fù)合物的制備工藝：以無水乙醇為溶劑，按沒食子酸質(zhì)量濃度1 mg/mL，沒食子酸:大豆卵磷脂摩爾比為1:4 投料，在45 ℃下攪拌反應(yīng)2 h；該工藝下所得復(fù)合物復(fù)合率可達(dá)94.65%。通過對(duì)該工藝下制備所得的復(fù)合物進(jìn)行表征，驗(yàn)證了復(fù)合物的形成；復(fù)合物的油水分配系數(shù)較沒食子酸明顯提高，表現(xiàn)出良好的脂溶性，且其體外抗氧化活性強(qiáng)，與沒食子酸無顯著差異。加速氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸-磷脂復(fù)合物能有效抑制核桃油氧化，提高了核桃油的氧化穩(wěn)定性；且在儲(chǔ)藏期間（12 d）較游離沒食子酸具有更好的抗氧化效果，具有做抗氧化劑的潛力。這可能是由于復(fù)合物增加了沒食子酸在油中的溶解度，使其作用濃度更高，且復(fù)合結(jié)構(gòu)增加了其穩(wěn)定性，延長了沒食子酸在油中的作用時(shí)間。綜上，沒食子酸-磷脂復(fù)合物脂溶性良好，抗氧化能力強(qiáng)，極具作為抗氧化劑的潛力，在脂類食品基質(zhì)中具有良好應(yīng)用前景。

致謝

特別感謝由云南源臨尚品食品有限公司慷慨提供的鮮榨核桃油樣品。