蝦青素立體異構(gòu)體與牛血清白蛋白的相互作用

鄭欽生，周樂(lè)松，張俊林，鄒曉君，曹庸，劉曉娟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

蝦青素（Astaxanthin，AST）是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，其分子結(jié)構(gòu)是一條兩端連接β-紫羅蘭酮環(huán)的共軛雙鍵長(zhǎng)鏈，并且環(huán)上各含有一個(gè)羥基和酮基（圖1）?；谶@些結(jié)構(gòu)特性，蝦青素被賦予超強(qiáng)的抗氧化特性[1]。在自然界中，AST 主要以全反式的形式存在。由于具有手性碳原子，AST 產(chǎn)生了左旋（3S,3’S）、右旋（3R,3’R）和內(nèi)消旋（3S,3’R）三種立體異構(gòu)體，并分別存在于不同的生物體中，如雨生紅球藻中主要存在左旋AST，而紅法夫酵母中主要存在右旋AST。此外，也發(fā)現(xiàn)了部分生物體（南極磷蝦、紅蟹、尼瓦利亞衣藻等）同時(shí)存在三種AST 立體異構(gòu)體。值得注意的是，這些AST 異構(gòu)體在抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)活性等方面表現(xiàn)出不同的健康效應(yīng)[2]。眾所周知，生物體內(nèi)的各種生理活動(dòng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì)的參與，活性物生理活性的發(fā)揮也需要通過(guò)與蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，AST 進(jìn)入血液后會(huì)與血清白蛋白發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)組織中并作用于靶蛋白來(lái)發(fā)揮功能活性[3]。若AST 異構(gòu)體與血清白蛋白之間的結(jié)合機(jī)制存在差異，則可能會(huì)觸發(fā)“結(jié)合-轉(zhuǎn)運(yùn)-功效”的鏈?zhǔn)接绊憽Ｇ耶?dāng)AST 異構(gòu)體在蛋白中具有相同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，還會(huì)表現(xiàn)出潛在的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這也會(huì)影響到最終功效的發(fā)揮[4,5]。因此研究AST 異構(gòu)體與血清白蛋白的相互作用機(jī)制具有重要意義。

圖1 AST立體異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of AST optical isomers

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）是研究最為廣泛的血清白蛋白之一，不僅因?yàn)槠渚哂袠?gòu)象清晰、成本低、易獲取等優(yōu)點(diǎn)，而且還與人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）有較高的結(jié)構(gòu)同源性（76%）[6]。BSA 的空間結(jié)構(gòu)由三個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域各包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A 和B），其中亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 和ⅢA 的疏水口袋是小分子配體的主要特異性結(jié)合位點(diǎn)[7]。作為一種模式結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，BSA 可以與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)發(fā)生相互作用，進(jìn)而起到儲(chǔ)存和運(yùn)輸作用。并且它自身的手性識(shí)別功能可以將活性物立體異構(gòu)體的微小結(jié)構(gòu)差異通過(guò)結(jié)合親和力、互作氨基酸殘基、相互作用力等指標(biāo)呈現(xiàn)出來(lái)。如在人參皂苷Rh2 與BSA 的相互作用中，左旋和右旋人參皂苷Rh2 在結(jié)合位點(diǎn)以及互作氨基酸殘基上表現(xiàn)出明顯的立體選擇性，并且左旋人參皂苷Rh 2 具有更高的結(jié)合常數(shù)[8]。另一項(xiàng)基于多光譜和分子對(duì)接的研究發(fā)現(xiàn)，相比于左旋地克珠利，右旋地克珠利與血清白蛋白具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力，并且它們的結(jié)合均會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生輕微變化[9]。由此可見(jiàn)，研究手性分子與BSA 的相互作用有助于闡明其立體選擇性結(jié)合機(jī)制。然而，目前對(duì)于AST立體異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合機(jī)制仍未有報(bào)道。

本研究系統(tǒng)地探究了AST 立體異構(gòu)體與BSA的相互作用。通過(guò)多光譜、表面等離子共振、分子對(duì)接等方法獲得AST-BSA 復(fù)合物的結(jié)合信息，包括熒光猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)、相互作用力、蛋白構(gòu)象變化和結(jié)合位點(diǎn)等。這些相互作用信息有助于闡明AST 立體異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合機(jī)制，并且對(duì)揭示AST 異構(gòu)體在血液循環(huán)中潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和代謝情況具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 原料

左旋蝦青素（純度＞94%）、右旋蝦青素（純度＞96%）由實(shí)驗(yàn)室制備（圖2），分別從雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）和紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）中提?。慌Ｑ灏椎鞍祝兌?8%）、吲哚美辛（純度＞99%）、布洛芬（純度＞98%）、0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Solution，PBS），上海源葉生物科技有限公司；氨基偶聯(lián)試劑盒、10×PBS-P+溶液、CM5 芯片，美國(guó)GE Healthcare 公司；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），天津天茂化工試劑廠；無(wú)水乙酸鈉，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；其它化學(xué)品為試劑級(jí)；上述PBS 和10×PBS-P+的pH 值均為7.4。

圖2 左旋AST（a）、右旋AST（b）及其手性鑒定（c）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of (3S,3’S)-AST (a),(3R,3’R)-AST (b) and their chiral identification (c)

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(jì)RF-6000，日本島津公司；表面等離子共振儀Biacore T200，美國(guó)GE Healthcare公司；圓二色譜儀Chirascan，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)源熒光光譜

取BSA 溶解于0.01 mol/L PBS 中得到10 μmol/L BSA 溶液；用DMSO 配制200 μmol/L 的左旋和右旋AST 溶液并用0.45 μm 針孔濾膜過(guò)濾。取干凈離心管，依次加入600 μL BSA 溶液、2 250 μL PBS、30 μL 乙醇和0～120 μL 蝦青素溶液，充分渦旋混勻后，在303 K 和310 K 下孵育20 min，結(jié)束后立即采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。BSA 終濃度為2 μmol/L，蝦青素終濃度為0～8 μmol/L，溶液總體積為3 mL，所含有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)小于5%。儀器設(shè)置的激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～400 nm，狹縫寬度為5 nm，以200 nm/min 的掃描速率進(jìn)行測(cè)定。

由于小分子配體的存在會(huì)影響蛋白質(zhì)對(duì)激發(fā)光的吸收和發(fā)射光的傳播，這種現(xiàn)象稱(chēng)為內(nèi)濾效應(yīng)。因此需要利用方程（1）來(lái)校正熒光強(qiáng)度[10]。然后通過(guò)方程（2～5）對(duì)校正后的熒光強(qiáng)度進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算得到相互作用信息。

式中：

Fcor——校正后的熒光強(qiáng)度；

Fobs——實(shí)際測(cè)得的熒光強(qiáng)度；

Aex——蛋白質(zhì)配體復(fù)合物在激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度；

Aem——蛋白質(zhì)配體復(fù)合物在發(fā)射波長(zhǎng)處的吸光度。

式中：

F0——蛋白質(zhì)的原始熒光強(qiáng)度；

F——存在猝滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度；

Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)；

τ0——BSA 的熒光壽命，3×10-9s[11]；

Ksv——Stern-Volmer 淬滅常數(shù)，L/mol；

[Q]——淬滅劑的濃度，μmol/L；

KA——結(jié)合常數(shù)，L/mol；

n——結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；

R——?dú)怏w常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；

T——溫度，K；

ΔH——焓變，kJ/mol；

ΔS——熵變，J/(mol·K)；

ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol。

1.3.2 同步熒光光譜

按照1.3.1 節(jié)方法配制樣品，反應(yīng)溫度為303 K。儀器設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的間隔Δλ分別為15 nm（發(fā)射波長(zhǎng)280～330 nm）和60 nm（發(fā)射波長(zhǎng)310～380 nm），其他參數(shù)不變。

1.3.3 位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1 節(jié)方法配制BSA、AST 溶液和設(shè)置熒光分光光度計(jì)參數(shù)。布洛芬和吲哚美辛溶于無(wú)水乙醇中得到500 μmol/L 的溶液，采用0.45 μm 針孔濾膜過(guò)濾溶液。取干凈離心管，先加入600 μL BSA 溶液、2 250 μL PBS 和30 μL 布洛芬或吲哚美辛溶液，混勻后在303 K 下反應(yīng)20 min。之后加入0～120 μL AST 溶液，混勻后再次在303 K 下反應(yīng)20 min，孵育結(jié)束后立即檢測(cè)。布洛芬和吲哚美辛終濃度為3 μmol/L。

1.3.4 表面等離子共振

通過(guò)氨基偶聯(lián)法將BSA 固定在CM5 傳感器芯片的通道Fc2 上，獲得7 058.3 RU 的密度。然后活化并封閉通道Fc1，以其作為不偶聯(lián)蛋白的參比通道。在DMSO 中配制左旋和右旋AST 母液，然后用1.5×PBS-P+溶液進(jìn)行首次稀釋?zhuān)儆煤w積分?jǐn)?shù)5% DMSO 的1.5×PBS-P+溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)罱K濃度范圍為0～2.67 μmol/L，樣品溶液中DMSO體積分?jǐn)?shù)為5%。按照儀器操作說(shuō)明書(shū)將1.5×PBS-P+溶液和DMSO 混合配制校正溶液。以含體積分?jǐn)?shù)5%DMSO 的1.5×PBS-P+溶液為運(yùn)行緩沖液，在室溫、30 μL/min 流速下進(jìn)行檢測(cè)。利用儀器自帶軟件對(duì)所得曲線進(jìn)行擬合分析，得到結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd和解離平衡常數(shù)KD。

1.3.5 圓二色譜

按照1.3.1 節(jié)方法配制樣品，其中AST 終濃度為2 μmol/L，反應(yīng)溫度為298 K。儀器掃描范圍190～260 nm，掃描速度100 nm/min。相同溶劑組成的PBS 作為空白對(duì)照組。利用Pro-Data 和CDNN 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行擬合曲線和解析二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6 分子對(duì)接模擬

采用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬。BSA的原始晶體結(jié)構(gòu)文件在RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB ID：4F5S[12]）中下載，左旋AST（PubChem CID：5281224）和右旋AST（PubChem CID：12358421）在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。在對(duì)接開(kāi)始前，將BSA 的水分子和配體分子全部去除，并補(bǔ)充電荷和原子。為確定所有可能的結(jié)合位點(diǎn)，首先對(duì)AST進(jìn)行盲對(duì)接。在AutoDock Tool 界面，將對(duì)接范圍擴(kuò)大至覆蓋BSA 的所有氨基酸殘基，對(duì)接得到10個(gè)最優(yōu)的結(jié)合位點(diǎn)，它們可作為下一次對(duì)接的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。然后進(jìn)行第二次對(duì)接，將對(duì)接范圍覆蓋上一步盲對(duì)接所得到的10 個(gè)最優(yōu)位點(diǎn)，通過(guò)縮小范圍來(lái)獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。最后，從第二次對(duì)接的結(jié)果中選擇最優(yōu)結(jié)合模式的結(jié)果，通過(guò)Open Babel GUI、PyMOL 和Discovery Studio 軟件進(jìn)行處理，得到三維空間圖和二維相互作用力圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 25.0 和OriginPro 2022b 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。采用方差分析（ANOVA）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機(jī)制

由于BSA 內(nèi)部的色氨酸（Tryptophan，Trp）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）和苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）熒光團(tuán)對(duì)周?chē)h(huán)境的極性很敏感，因此可通過(guò)內(nèi)源熒光光譜（Intrinsic Fluorescence Emission Spectroscopy，IFES）得到關(guān)于分子間相互作用的可靠信息。如圖3 所示，在加入AST 異構(gòu)體后，334 nm 處的熒光發(fā)射峰明顯下降，并且表現(xiàn)出濃度依賴的猝滅效果，這表明AST 與BSA 發(fā)生相互作用導(dǎo)致BSA 的熒光猝滅。

為了進(jìn)一步闡明AST 異構(gòu)體和BSA 之間的熒光猝滅機(jī)制，采用Stern-Volmer 方程（2）進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)果如圖4 和表1 所示。隨著溫度從303 K升高到310 K，左旋和右旋AST 的Stern-Volmer 淬滅常數(shù)Ksv分別從1.95×104和2.11×104L/mol 下降到1.14×104和1.29×104L/mol（P＜0.05）。一般來(lái)說(shuō)，熒光猝滅機(jī)制可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種機(jī)制。若蛋白質(zhì)受體與小分子配體之間結(jié)合形成復(fù)合物，其Ksv會(huì)表現(xiàn)出隨溫度升高而降低的趨勢(shì)，稱(chēng)為靜態(tài)猝滅機(jī)制。而動(dòng)態(tài)猝滅是由于受體與配體之間發(fā)生運(yùn)動(dòng)碰撞引起的，表現(xiàn)為Ksv隨溫度升高而增加[13]。研究結(jié)果顯示，左旋和右旋AST 的Ksv都隨著溫度升高而下降，表明AST 異構(gòu)體與BSA發(fā)生結(jié)合，靜態(tài)猝滅是主要的熒光猝滅機(jī)制。此外，異構(gòu)體的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq均達(dá)到1012L/(mol·s)，遠(yuǎn)高于生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)[2.00×1010L/(mol·s)]，再一次支持靜態(tài)猝滅機(jī)制的結(jié)果[14]。

表1 AST異構(gòu)體與BSA相互作用的雙分子猝滅速率常數(shù)和Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Bimoecular quenching constant and Stern-Volmer quenching constant of interaction between AST isomers and BSA

圖4 左旋AST（a）和右旋AST（b）與BSA相互作用的Stern-Volmer方程擬合圖Fig.4 Stern-Volmer plot of BSA interacting with (3S,3’S)-AST(a) and (3R,3’R)-AST (b)

2.2 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)

為進(jìn)一步探究AST 異構(gòu)體和BSA 結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，使用雙對(duì)數(shù)方程（3）對(duì)上述所得熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，結(jié)果如表2 和圖5 所示。一般情況下，當(dāng)小分子配體-蛋白受體復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)KA在107～109L/mol 之間時(shí)代表較強(qiáng)的結(jié)合親和力，而低于106L/mol 時(shí)則代表較弱的結(jié)合親和力[15]。如表2 所示，AST-BSA 的KA均為103L/mol，可以推測(cè)BSA 對(duì)AST 異構(gòu)體具有較弱的結(jié)合親和力。其中左旋與右旋AST 在303 K 時(shí)的KA分別為8.14×103和8.53×103L/mol。雖然右旋AST 比左旋AST 具有更高的KA，但結(jié)果沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明二者對(duì)BSA 具有相似的結(jié)合親和力。此外，左旋和右旋AST 在303 K 時(shí)的n值分別為0.92 和0.93，它們均小于1，表明AST異構(gòu)體在BSA 中均只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表2 AST異構(gòu)體與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Number of binding sites and binding constants of interaction between AST isomers and BSA

圖5 左旋AST（a）和右旋AST（b）與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)方程擬合圖Fig.5 Double logarithmic plots of BSA interacting with(3S,3’S)-AST (a) and (3R,3’R)-AST (b)

雖然內(nèi)源熒光光譜具有研究結(jié)合常數(shù)的潛力，但該技術(shù)依賴于周?chē)h(huán)境對(duì)生色氨基酸的影響程度來(lái)計(jì)算結(jié)合常數(shù)，排除了其他氨基酸對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。因此，為進(jìn)一步確定AST 異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合參數(shù)，我們選擇表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasma Resonance，SPR）來(lái)測(cè)定AST-BSA 的結(jié)合親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。如圖6 所示，注入AST 溶液后，儀器的響應(yīng)值隨時(shí)間變化而逐漸增加，說(shuō)明AST 與偶聯(lián)在芯片上的BSA 發(fā)生結(jié)合。表3 顯示AST 異構(gòu)體與BSA 的解離平衡常數(shù)KD均達(dá)到10-7mol/L（KA=1/KD，相當(dāng)于106L/mol 的KA），說(shuō)明AST 與BSA 具有中等強(qiáng)度的結(jié)合親和力。其中右旋AST（3.91×10-7mol/L）與左旋AST（4.17×10-7mol/L）表現(xiàn)出相近的KD（P＞0.05），與前面IFES 的結(jié)果一致表明AST 立體異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的立體選擇性[16]。此前已有學(xué)者[17]研究了血清白蛋白對(duì)人工合成全反式AST（左旋:內(nèi)消旋:右旋=1:2:1）的結(jié)合親和力（1.47×10-6mol/L），與我們的SPR 結(jié)果（10-7mol/L）較為接近，進(jìn)一步證明了SPR 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。此外，從整體的動(dòng)力學(xué)曲線來(lái)看，AST 異構(gòu)體的結(jié)合和解離曲線較為相似，都呈現(xiàn)慢結(jié)合與慢解離狀態(tài)，但是左旋和右旋AST的結(jié)合速率常數(shù)[4.76×103和3.27×103L/(mol·s)]和解離速率常數(shù)（2.00×10-3和1.28×10-31/s）存在較大差異（P＜0.05）。并且當(dāng)AST 濃度為0.35、0.53、0.79、1.19 和1.78 μmol/L 時(shí)，左旋和右旋AST的最高結(jié)合響應(yīng)值分別為13.84、20.60、25.93、40.58、57.22 RU 和13.20、17.14、19.22、24.81、33.19 RU?？梢钥吹皆谙嗤珹ST 濃度下左旋AST的響應(yīng)值均高于右旋AST，這種由于手性結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的差異在其它研究中也有所發(fā)現(xiàn)[18]，表明左旋和右旋AST 與BSA 的結(jié)合存在差異。

表3 AST異構(gòu)體與BSA相互作用的結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)及解離平衡常數(shù)Table 3 Association rate constant,dissociation rate constant and equilibrium constants values of AST isomers interacting with BSA

圖6 左旋AST（a）和右旋AST（b）與固定化BSA相互作用的傳感圖Fig.6 Sensing diagram of immobilized BSA interacting with(3S,3’S)-AST (a) and (3R,3’R)-AST) (b)

對(duì)比以上兩種方法所得到的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用SPR（106L/mol）得到的結(jié)合親和力約為IFES（103L/mol）的103倍。這是由于除生色氨基酸之外，SPR 還可以同時(shí)檢測(cè)到BSA 其它氨基酸的相互作用信息[19]。由此可見(jiàn)，SPR 獲得的結(jié)合親和力更加真實(shí)，在Afkham 等[20]和Maleki 等[21]研究中也得到一致的看法。雖然IFES 受限于檢測(cè)原理，但這個(gè)方法可作為SPR 的輔助驗(yàn)證手段，并且它還可以獲得其它方面的相互作用信息，如蛋白質(zhì)構(gòu)象變化、相互作用力等，這些結(jié)果將在以下實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。

2.3 熱力學(xué)參數(shù)和主要相互作用力

AST 具有多種官能團(tuán)，如芳香環(huán)、酮基和羥基，因此AST 異構(gòu)體可能會(huì)以不同的結(jié)合模式與BSA發(fā)生相互作用，并在熱力學(xué)參數(shù)上表現(xiàn)出差異。此外，熱力學(xué)參數(shù)是判斷相互作用力的重要依據(jù)。為了確定AST 異構(gòu)體與BSA 結(jié)合的相互作用力，我們使用了方程（4）和（5）分析了第2.2 節(jié)中IFES的結(jié)合親和力。

左旋和右旋AST 與BSA 相互作用的焓變?chǔ)分別為-175.09 和-149.42 kJ/mol，熵變?chǔ)分別為-502.72 和-417.65 J/(mol·K)（表4）。AST 立體異構(gòu)體均呈現(xiàn)負(fù)值的ΔH和ΔS，表明驅(qū)使它們與BSA 發(fā)生結(jié)合的主要相互作用力是氫鍵和范德華力[22]，這與之前關(guān)于類(lèi)胡蘿卜素-BSA 相互作用的報(bào)道一致[23]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要是因?yàn)锳ST 異構(gòu)體具有的相同官能團(tuán)，而手性結(jié)構(gòu)的差異并不會(huì)改變主要相互作用力類(lèi)型，這在其它異構(gòu)體的研究中也有相同的結(jié)果[24]。盡管如此，左旋AST 比右旋AST 具有更小的ΔH和ΔS表明二者存在結(jié)合差異。

表4 AST異構(gòu)體與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters of AST isomers interacting with BSA

2.4 蝦青素異構(gòu)體結(jié)合位點(diǎn)的確定

現(xiàn)有研究表明，BSA 與小分子配體結(jié)合的主要位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA（位點(diǎn)Ⅰ）和ⅢA（位點(diǎn)Ⅱ）的疏水腔內(nèi)，而吲哚美辛和布洛芬分別是位點(diǎn)Ⅰ或Ⅱ的典型配體[23]。因此選擇這兩種典配體進(jìn)行位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)（Site Marker Experiments，SME），并通過(guò)方程（3）來(lái)計(jì)算存在位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)時(shí)AST-BSA的結(jié)合常數(shù)，以此來(lái)確定AST 異構(gòu)體在BSA 上的結(jié)合位點(diǎn)。

結(jié)果如表5 所示，左旋和右旋AST 與BSA的結(jié)合常數(shù)分別為8.14×103和8.53×103L/mol。當(dāng)加入吲哚美辛后，左旋和右旋AST 的結(jié)合常數(shù)分別降低至0.55×103和0.14×103L/mol。在加入布洛芬后，左旋和右旋AST 的結(jié)合常數(shù)分別為0.54×103和0.57×103L/mol?？梢钥吹竭胚崦佬粱虿悸宸业拇嬖跁?huì)使AST 異構(gòu)體的結(jié)合常數(shù)顯著降低（P＜0.05），這個(gè)現(xiàn)象表明兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)都會(huì)影響B(tài)SA 與AST 異構(gòu)體的結(jié)合。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)布洛芬和吲哚美辛在兩種AST 異構(gòu)體中的結(jié)合常數(shù)都沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異。由此可推斷左旋和右旋AST 的結(jié)合位點(diǎn)均位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 和ⅢA 之間的交界處，在Li 等[25]課題組的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，原因可能是受到AST 長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的影響。

表5 競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)中AST異構(gòu)體與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Table 5 Binding constants for the interaction of BSA with AST isomers in competitive experiments

2.5 蝦青素異構(gòu)體對(duì)牛血清白蛋白構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)（特別是血清白蛋白）是動(dòng)態(tài)柔性物體，它能夠根據(jù)自身所處環(huán)境的微小變化，自發(fā)地進(jìn)行分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變。因此，小分子與蛋白質(zhì)的相互作用不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)在結(jié)合口袋處的結(jié)構(gòu)，而且對(duì)其整體二級(jí)結(jié)構(gòu)也可能造成較大影響[26]。為了探究AST 異構(gòu)體對(duì)BSA 結(jié)構(gòu)的影響，采用了圓二色譜（Circular Dichroism，CD）和同步熒光光譜（Synchronous Fluorescence Emission Spectra，SFES）進(jìn)行測(cè)定。CD 可以在190～260 nm 波長(zhǎng)下直接分析BSA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果如圖7 和表6 所示。天然BSA 的CD 光譜分別在209 nm 和221 nm附近出現(xiàn)α-螺旋的波谷，解析得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為56.83%α-螺旋、8.63%β-折疊、13.70%β-轉(zhuǎn)角和22.27%無(wú)規(guī)則卷曲，表明BSA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋[27]。當(dāng)加入左旋和右旋AST 后，BSA的CD 波谷僅輕微下降，α-螺旋分別變?yōu)?6.80%和57.23%。然而二級(jí)結(jié)構(gòu)含量并沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），表明AST 異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合不會(huì)明顯改變蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果有助于BSA 維持其原有的生理功能。

表6 存在和不存在AST異構(gòu)體時(shí)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 6 Secondary structure content of BSA in the presence and absence of AST isomers

圖7 存在和不存在AST異構(gòu)體時(shí)BSA的CD光譜Fig.7 CD spectra of BSA in the absence and presence of AST isomers

對(duì)于SFES，光譜中最大發(fā)射波長(zhǎng)位置的變化可以反映生色氨基酸周?chē)h(huán)境極性的變化，以此來(lái)觀察AST 異構(gòu)體對(duì)BSA 微環(huán)境的影響。當(dāng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的間隔Δλ固定為15 或60 nm 時(shí)，可以分別獲得Tyr 或Trp 殘基的微環(huán)境信息[28]。對(duì)于天然BSA，Tyr 和Trp 的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在300 和340 nm（圖8）。隨著左旋和右旋AST 的加入，Tyr和Trp 的最大發(fā)射波長(zhǎng)均沒(méi)有發(fā)生位移變化，說(shuō)明AST-BSA 相互作用不會(huì)改變BSA 的微環(huán)境。由此可見(jiàn)，CD 和SFES 一致表明AST 與BSA 的相互作用不會(huì)明顯改變蛋白構(gòu)象。從第2.4 節(jié)中可以得到一個(gè)合理的解釋?zhuān)碅ST 沒(méi)有結(jié)合到BSA 內(nèi)部的疏水口袋，因此對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響較小。

圖8 左旋AST（a）和右旋AST（b）與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.8 Synchronous fluorescence emission spectroscopy of BSA interacting with (3S,3’S)-AST (a) and (3R,3’R)-AST (b)

2.6 蝦青素異構(gòu)體與牛血清白蛋白的模擬結(jié)合

分子對(duì)接（Molecular Docking，MD）可以預(yù)測(cè)小分子與蛋白質(zhì)的相互作用信息并呈現(xiàn)出可視化的結(jié)果，有助于進(jìn)一步了解AST 異構(gòu)體與BSA 之間的結(jié)合機(jī)制。表7 顯示左旋AST、右旋AST 與BSA 的結(jié)合自由能均為-8.9 kcal/mol，表明二者具有相等的結(jié)合親和力。如圖9 所示，最優(yōu)的對(duì)接模式表明AST 異構(gòu)體具有相似的結(jié)合模式，二者均結(jié)合在BSA 三個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界處，并且與BSA 結(jié)合的相互作用力類(lèi)型為氫鍵、范德華力和疏水相互作用力。這與第2.2～2.4節(jié)的研究結(jié)果較為一致，在理論層面提供了進(jìn)一步的支持。雖然左旋和右旋AST 在上述方面具有相似的結(jié)果，但在形成氫鍵的數(shù)目和鍵長(zhǎng)方面表現(xiàn)結(jié)合差異。其中左旋AST與Lys504、Thr190殘基形成鍵長(zhǎng)為2.0 ?、2.7 ? 的氫鍵，而右旋AST 與Arg435 殘基形成鍵長(zhǎng)為2.9 ? 的氫鍵。此外，還發(fā)現(xiàn)AST 立體異構(gòu)體都是通過(guò)酮基或羥基與氨基酸形成氫鍵，可見(jiàn)這兩個(gè)官能團(tuán)對(duì)AST 的結(jié)合起到重要作用。

表7 AST異構(gòu)體與BSA的分子對(duì)接結(jié)合參數(shù)Table 7 Binding parameters of BSA with AST isomers obtained by molecular docking

圖9 左旋AST（a）和右旋AST（b）與BSA相互作用的分子對(duì)接結(jié)果及對(duì)比分析（c、d）Fig.9 Molecular docking results of BSA interacting with (3S,3’S)-AST (a) as well as (3R,3’R)-AST (b) and comparative analysis (c,d)

左旋和右旋AST 與BSA 相似的結(jié)合自由能再一次反映出它們之間的結(jié)合沒(méi)有明顯的立體選擇性，這種情況可以從AST 的分子結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)兩方面來(lái)解釋。AST 立體異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)差異在于兩端環(huán)上的羥基，由于AST 的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)限制了它們可選擇的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致無(wú)法像其他小分子異構(gòu)體那樣自由調(diào)整分子朝向來(lái)選擇最合適的結(jié)合口袋[8,29]。此外，結(jié)合位點(diǎn)處芳香族氨基酸殘基（Trp、Tyr 和Phe）的存在對(duì)手性分子的立體選擇性具有較大影響[30]，然而分子對(duì)接結(jié)果顯示AST-BSA 的互作氨基酸殘基中僅出現(xiàn)一個(gè)Tyr 殘基，這不利于展現(xiàn)AST 立體異構(gòu)體的立體選擇性作用。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)IFES、SFES、SME、CD、SPR 和MD 方法研究了AST 立體異構(gòu)體與BSA 的相互作用。SME 表明AST 異構(gòu)體的結(jié)合位點(diǎn)均位于BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 和ⅢA 的交界處，相同的結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致AST 異構(gòu)體具有相似的相互作用力（氫鍵和范德華力）和結(jié)合親和力，這在IFES 和SPR 中得到了證明。SPR 還表明AST-BSA 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)都表現(xiàn)為慢結(jié)合、慢解離狀態(tài)，左旋AST 的最高結(jié)合響應(yīng)值高于右旋AST。IFES 的結(jié)果還顯示左旋AST 具有更低的ΔH和ΔS。MD 模擬結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高符合度，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)AST 立體異構(gòu)體在氫鍵數(shù)目和鍵長(zhǎng)上表現(xiàn)結(jié)合差異。此外，CD 和SFES一致證明AST 與BSA 的相互作用不會(huì)對(duì)蛋白構(gòu)象造成較大影響?？傊笮陀倚鼳ST 對(duì)BSA 的結(jié)合沒(méi)有明顯的立體選擇性，但在最高結(jié)合響應(yīng)值、熱力學(xué)參數(shù)和氫鍵數(shù)表現(xiàn)出結(jié)合差異。這些相互作用參數(shù)有助于闡明AST 立體異構(gòu)體與BSA 的結(jié)合機(jī)制，并為AST 異構(gòu)體在血液循環(huán)中潛在的藥代動(dòng)力學(xué)提供重要的理論指導(dǎo)信息。