大曲耐熱細(xì)菌富集及其在小曲白酒中的應(yīng)用

應(yīng)超，任志強(qiáng),2，曾波，黃治國(guó),2，張運(yùn)祺，衛(wèi)春會(huì),2＊

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）（2.中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

酒曲是白酒發(fā)酵生產(chǎn)的主要?jiǎng)恿?lái)源，它決定了白酒的質(zhì)量，想釀造出好酒，第一步就是要做好曲。近年來(lái)白酒企業(yè)對(duì)白酒釀造用曲中微生物群落結(jié)構(gòu)組成和功能的研究日益增多[1]，目前曲藥使用最多的是大曲和小曲。大曲是由小麥為主要原料制成的含有多種微生物菌群和功能酶的曲塊，是釀造濃香型大曲酒的糖化發(fā)酵劑，為釀造過(guò)程提供一些風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)[2]。小曲是用米粉或米糠為主要原料，在控制溫濕度的條件下，接一定量的母曲培養(yǎng)而成的體積較小的酒曲。小曲作為一種復(fù)合的糖化和發(fā)酵劑，主要依賴于其中含有的微生物群落，如酵母菌、霉菌、細(xì)菌，雖存在多種微生物，但也存在酒體單薄的問(wèn)題[3]。而且曾祖訓(xùn)等[4]在對(duì)川法小曲清香白酒的研究中發(fā)現(xiàn)，川法小曲酒還存在著高級(jí)醇含量高的問(wèn)題。

白酒的生產(chǎn)是利用群體微生物組合發(fā)酵的過(guò)程，優(yōu)質(zhì)的功能微生物菌群是發(fā)酵的關(guān)鍵之一[5]。鄭自強(qiáng)等[6]將從大曲中篩選出的高產(chǎn)糖化酶菌株制備成霉菌麩曲，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵釀造性能測(cè)試發(fā)現(xiàn)其有突出的發(fā)酵能力，顯著提高了出酒率。劉小改等[7]從大曲中篩選出具有產(chǎn)香功能的細(xì)菌菌株，將其應(yīng)用于麩曲白酒釀造，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣成分豐富，具有較強(qiáng)產(chǎn)香能力。大曲高溫制曲的工藝富集了大量耐熱細(xì)菌，保證了釀酒的糖化、生香、發(fā)酵過(guò)程，對(duì)白酒風(fēng)味有積極作用[8]。而目前鮮有利用大曲中耐熱細(xì)菌菌群應(yīng)用到小曲白酒釀造過(guò)程中的的研究。Xia 等[9]對(duì)大曲微生物群落進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，嗜熱芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬，在大曲中表現(xiàn)出較高的相對(duì)豐度，并且發(fā)現(xiàn)大曲不同微生物群落在不同參數(shù)培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出不同的能力。周平等[10]從中高溫大曲中分離出一株耐熱能力較好的NR2 細(xì)菌，通過(guò)發(fā)酵特性研究，發(fā)現(xiàn)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成與NR2 細(xì)菌的代謝特性有關(guān)。耐熱細(xì)菌是白酒釀造的重要功能菌群，其為白酒釀造過(guò)程提供蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等豐富的酶系，也對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有重要的影響[11,12]。其中地衣芽孢桿菌尤為重要，是小曲白酒中的重要產(chǎn)香功能微生物，理論上將大曲中的耐熱細(xì)菌運(yùn)用到小曲白酒釀造中能提升其酒體質(zhì)量。

本研究圍繞著大曲中耐熱細(xì)菌菌群在小曲白酒釀造中的應(yīng)用開(kāi)展試驗(yàn)，通過(guò)制成不同高溫條件下的富集液，篩選出目的耐熱細(xì)菌菌群。因?yàn)榇笄患毫可偾也灰妆４?，而麩皮因其含有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是制曲、培菌最優(yōu)良的原料，通過(guò)將功能耐熱細(xì)菌菌群制成麩曲結(jié)合16S rDNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)功能菌群進(jìn)行鑒定，通過(guò)改變水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)功能麩曲培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)小曲酒固態(tài)釀造試驗(yàn)，探究大曲中不同高溫條件下的耐熱細(xì)菌富集液制備的功能麩曲對(duì)小曲白酒的影響，為應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品：取自川南某濃香型酒廠某制曲車間。

麩皮和糯高粱：市售。

試劑及耗材：葡萄糖（分析純）、NaCl（分析純）、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；乙酸、乳酸、乙酸正丁酯（均為色譜純），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇（色譜純），南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲醇（色譜純），北京迪科馬科技有限公司；固相微萃取頭（30/50 cm DVB/CAR/PDMS），美國(guó)Supelco。

1.2 儀器與設(shè)備

JE2002 電子分析天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；CI54DS 立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋，致微儀器有限公司；LS-1201 生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；JJ-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；Labserv-LS-0610 電熱恒溫干燥箱，上海一恒科儀器有限公司；5430R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich 公司；7890A-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 值（7.3±0.1），121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集

樣品采集自中國(guó)西南部長(zhǎng)江流域一個(gè)濃香型酒廠，從該企業(yè)隨機(jī)采集六塊具有大曲典型感官特征的同批次大曲。

1.4.2 微生物群落分析

樣品DNA 的提取，根據(jù)改良的CTAB 法[13]進(jìn)行總DNA 提取，并通過(guò)NanoDrop 2000 進(jìn)行檢測(cè)，判斷DNA 是否存在RNA 和蛋白質(zhì)污染，檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量采用體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳。參照電泳初步定量結(jié)果，將產(chǎn)物送到上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行PCR-DGGE 高通量測(cè)序，用于后續(xù)分析。

1.4.3 耐熱細(xì)菌的富集

大曲耐熱細(xì)菌最適溫度在55 ℃左右，最高溫度一般不會(huì)超過(guò)70 ℃，所以本實(shí)驗(yàn)富集55、60、65 ℃三個(gè)溫度下的耐熱細(xì)菌。分別稱取三份粉碎后的大曲樣品10.0 g，在無(wú)菌條件下加入到帶有90 mL 無(wú)菌水的錐形瓶中，搖勻，分別置于設(shè)置溫度為55、60、65 ℃的恒溫水浴搖床，振蕩培養(yǎng)24 h，制成大曲富集液。

1.4.4 大曲中耐熱細(xì)菌的應(yīng)用

1.4.4.1 麩曲的制作

麩曲的制作工藝流程[14]如下：

麩皮→加水→拌曲→蒸麩→冷卻→接種→拌勻→培養(yǎng)→干燥→粉碎→保存

原料處理：稱取麩皮原料于容器中，按需加入無(wú)菌水，讓麩皮充分吸水，混合均勻后，使用蒸汽處理30～60 min。

麩曲制作：將大曲高溫富集液，按一定的添加量，接種于蒸煮后的麩皮中，自然升溫至頂溫，在該溫度范圍保持1～5 d，至麩曲微黃，有光澤，略帶氨味，進(jìn)行通風(fēng)干燥至質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%～12%的含水量，粉碎，制成耐熱細(xì)菌麩曲。

1.4.4.2 麩曲細(xì)菌生物量

麩曲培養(yǎng)完成后，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[15]進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，操作步驟如下：

（1）稱取1 g 粉碎曲樣加到含有100 mL 無(wú)菌水的250 mL 無(wú)菌三角瓶中，無(wú)菌封口膜封口，4 ℃水浴搖床震蕩30 min。

（2）吸取100 μL 菌液到1.5 mL 無(wú)菌EP 管，加入900 μL 無(wú)菌水，取稀釋倍數(shù)為104～107進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（3）吸取100 μL 稀釋菌液在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，倒置培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)，每組3 個(gè)平行。有效結(jié)果區(qū)間為30～300 CFU。

以細(xì)菌生物量說(shuō)明耐熱微生物是否能夠利用麩皮得以生存和繁殖，并以生物量對(duì)麩曲質(zhì)量進(jìn)行評(píng)判，生物量越大越有利于實(shí)際生產(chǎn)節(jié)約成本。

1.4.4.3 含水量對(duì)耐熱細(xì)菌的影響

按照麩曲的制作工藝，將潤(rùn)料后的麩曲含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別控制在45%、50%、55%、60%、65%、于35 ℃、濕度90%的條件下培養(yǎng)，每天觀察其生長(zhǎng)情況，5 d 后裝入托盤(pán)，低溫干燥后粉碎并計(jì)算麩曲中的生物量，確定麩曲制作最佳含水量[16]。

1.4.4.4 釀酒試驗(yàn)

工藝流程為：

高粱→挑選→清洗、去雜→粉碎→潤(rùn)糧→初蒸→悶糧→復(fù)蒸→攤涼→下曲→25 ℃培菌→密封→30 ℃發(fā)酵→蒸餾

參照小曲清香型白酒釀造工藝[17]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及條件，以高粱為原料，5 L 保溫桶為發(fā)酵容器，每桶3 kg 高粱，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%某市售小曲，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%耐熱細(xì)菌麩曲，發(fā)酵15 d，發(fā)酵結(jié)束蒸餾后，參照《釀酒分析與檢測(cè)》中的方法測(cè)定出酒率[18]。

下曲：由于麩曲主要以細(xì)菌為主，缺乏霉菌和酵母的作用，淀粉可能無(wú)法正常進(jìn)行糖化發(fā)酵。因此添加市售小曲，并按曲與糧重之比接種下曲，設(shè)計(jì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%某市售小曲和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的耐熱細(xì)菌麩曲為試驗(yàn)組，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%某市售小曲和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%蒸煮過(guò)后的麩皮為對(duì)照組。

1.4.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分測(cè)定

1.4.5.1 氣相色譜質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：DB WAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，載氣為高純He，流量1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度230 ℃，升溫程序：初始溫度為40 ℃，保留1 min，然后以5 ℃/min 升溫至230 ℃，保持30 min。

質(zhì)譜條件：電子離子源（EI），70 eV 電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～550 u，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃[19]。

1.4.5.2 樣品測(cè)定

取樣液900 μL 于進(jìn)樣瓶中，加入2 mg/mL 的2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液、3 mg/mL 的乙酸戊酯內(nèi)標(biāo)溶液各50 μL，混勻，上機(jī)進(jìn)樣。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin、Excel 作圖以及SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲、大曲富集液及麩曲菌群結(jié)構(gòu)

2.1.1 大曲、大曲富集液及麩曲菌群的α-多樣性

多樣性分析主要研究樣本的群落多樣性，對(duì)樣品微生物群落進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，可以獲得環(huán)境群落中物種的豐富度、多樣性等信息[20-22]。本研究分析了大曲、大曲富集液及麩曲菌群的α-多樣性，結(jié)果如表1 所示，所有樣品序列數(shù)均超過(guò)30 000 條，大曲、大曲富集液及麩曲的序列數(shù)無(wú)顯著差異，檢測(cè)結(jié)果能夠體現(xiàn)各樣品群落多樣性的真實(shí)情況。從樣品物種豐富度（Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)）可以看出，大曲物種豐富度最高，65 ℃的大曲富集液物種豐富度最低，在不同高溫的大曲富集液制成的麩曲當(dāng)中，來(lái)源于大曲55 ℃菌群的麩曲物種豐富度最高。從樣品群落多樣性（Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)）可以看出，大曲以及麩曲的群落多樣性更高，其中大曲群落多樣性最高，65 ℃的大曲富集液群落多樣性最低，與物種豐富度結(jié)果保持一致。樣品群落的多樣性結(jié)果為：大曲＞麩曲＞大曲富集液，而且隨著溫度升高，大曲富集液與麩曲群落多樣性降低。表明了大曲中的微生物多樣性最高，富集液經(jīng)過(guò)了高溫的處理使得大部分微生物無(wú)法生長(zhǎng)與繁殖導(dǎo)致豐富度降低，而麩曲的物種豐富度增加，受到制曲原料以及環(huán)境影響，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

表1 大曲、大曲富集液及麩曲菌群α多樣性Table 1 Daqu,Daqu enrichment liquid and α diversity of bran koji flora

2.1.2 大曲、大曲富集液及麩曲菌群的物種組成分析

Venn 可以統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣品中所特有和共有物種的數(shù)量，可以直觀地顯示樣品物種組成的相似性和重疊性。本研究在屬水平上對(duì)大曲、大曲富集液及麩曲菌群的物種組成分析。由圖1a 所示，大曲中有最多的物種組成，有51 個(gè)獨(dú)有的屬，麩曲中有30 個(gè)獨(dú)有的屬，大曲富集液有5 個(gè)獨(dú)有的屬，它們共同擁有兩個(gè)屬，按物種多樣性的數(shù)量排序?yàn)椋捍笄钧熐敬笄患?，?jīng)過(guò)高溫的富集處理后物種數(shù)快速下降，而制作成的麩曲物種組成增加，原因可能是受原料和環(huán)境因素的影響。由圖1b 所示，在屬水平上對(duì)不同溫度下的大曲富集液和麩曲分析，大曲富集液隨著富集溫度的升高它的物種組成數(shù)逐漸降低，且65 ℃條件下的大曲富集液沒(méi)有獨(dú)有的屬，耐熱細(xì)菌麩曲也隨著溫度的升高獨(dú)有的屬逐漸降低，它們共同擁有1 個(gè)屬。

圖1 大曲、大曲富集液及麩曲群落結(jié)構(gòu)Venn圖Fig.1 The Venn diagram of Daqu,Daqu enrichment liquid and bran community structure

2.1.3 大曲、大曲富集液及麩曲菌群Bar 圖分析

根據(jù)群落Bar 圖，可以直觀看出各樣本在某一分類學(xué)水平上含有何種微生物，以及樣本中各微生物的相對(duì)豐度。對(duì)大曲、大曲富集液及麩曲的群落Bar 圖分析，得到排名前4 的門(mén)、前20 的屬及前23 的種。

基于門(mén)水平對(duì)樣品進(jìn)行分析，由圖2 可知，其中占主導(dǎo)地位的都是Firmicutes（厚壁菌門(mén)），其中Firmicutes 在大曲富集液中最多，相對(duì)豐度為99.78%～99.90%，麩曲中Firmicutes 相對(duì)豐度為77.24%～77.18%，并隨著富集溫度的升高相對(duì)豐度含量逐漸上升，而大曲Firmicutes 相對(duì)最少，相對(duì)豐度為64.42%。Firmicutes 是一大類細(xì)菌，大多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性，細(xì)胞壁由一層厚厚的肽聚糖組成，厚壁菌大多能產(chǎn)生芽孢，能抵抗脫水和極端環(huán)境。Proteobacteria（變形菌門(mén)）在麩曲中最多，相對(duì)豐度為20.03%～28.33%，隨著富集溫度的升高其相對(duì)豐度逐漸降低，在高溫大曲中相對(duì)豐度為17.39%，在大曲富集液中含有極少量，Proteobacteria 是細(xì)菌中最大的一門(mén)，包括很多病原菌，所有的Proteobacteria 細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，其外膜主要由脂多糖組成，Actinobacteria（放線菌門(mén)）在高溫大曲中相對(duì)豐度為16.85%，在麩曲中相對(duì)豐度為0.55%～2.66%，并隨富集溫度上升相對(duì)豐度含量逐漸上升，在大曲富集液中含有極少量。

進(jìn)一步進(jìn)行屬水平分析，由圖3 可知大曲樣品中，主要以Bacillus（芽孢桿菌屬）相對(duì)豐度11.71%、Weissella（魏斯氏菌屬）相對(duì)豐度18.46%、Thermoactinomyces（高溫放線菌屬）相對(duì)豐度16.20%及Rhodococcus（紅球菌屬）相對(duì)豐度17.39%為主。隨著高溫富集，大曲富集液中Bacillus占到主導(dǎo)地位相對(duì)豐度為96.24%～99.76%，制作為麩曲Bacillus占比有所下降，相對(duì)豐度為45.34%～63.14%。

圖3 群落結(jié)構(gòu)Bar圖（屬水平）Fig.3 Bar diagram of community structure (genus level)

最后，為驗(yàn)證大曲耐熱細(xì)菌菌群是否復(fù)刻到麩曲當(dāng)中，基于種水平對(duì)大曲與麩曲樣品菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，由圖4 可知，主要以無(wú)法歸類Bacillus（芽孢桿菌）和Weissella（魏斯氏菌）等細(xì)菌為主。Bacillus是釀酒過(guò)程中的重要的功能菌，為白酒釀造過(guò)程提供蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等豐富的酶系，這些酶系推動(dòng)原料分解，形成豐富的氨基酸與糖類，對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有重要的影響[23,24]。Bacillus較大，該菌的重要特征是能夠產(chǎn)生對(duì)不利條件具有特殊抗性的芽孢，分布極為廣泛。Weissella是一種重要的乳酸菌，廣泛分布于發(fā)酵制品中，有研究表明，Weissella具有良好的發(fā)酵特性，能夠縮短食品發(fā)酵進(jìn)程，可發(fā)酵糖類、碳水化合物產(chǎn)生乳酸、醋酸、二氧化碳和乙醇等物質(zhì)，有助于提高發(fā)酵制品的品質(zhì)，改善發(fā)酵制品的風(fēng)味[25,26]。Weissella無(wú)芽孢形成，最適的生長(zhǎng)pH 值為3.0～9.5，在兼性厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)情況最佳[27]。經(jīng)過(guò)高溫富集、接種處理后，使原來(lái)大曲中的Bacillus相對(duì)豐度從11.65%提升麩曲中的45.24%～63.14%，且在一定范圍內(nèi)隨著富集溫度的升高，細(xì)菌占比越大，說(shuō)明將大曲中的功能耐熱細(xì)菌成功的復(fù)刻到了麩曲當(dāng)中，并占到了主導(dǎo)地位。

圖4 群落結(jié)構(gòu)Bar圖（種水平）Fig.4 Bar diagram of community structure (species level)

2.2 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)麩曲中耐熱細(xì)菌的影響

在制曲過(guò)程中，含水量是麩曲制作中非常重要的參數(shù)，適宜的含水量可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和代謝，提高麩曲的品質(zhì)和發(fā)酵效果，而過(guò)高或過(guò)低的含水量則會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致麩曲的質(zhì)量下降或者無(wú)法發(fā)酵成功[28]。生物量可以反映微生物在麩曲中的數(shù)量和代謝活性，進(jìn)而反映出麩曲中微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)酵能力，故將耐熱細(xì)菌菌群接種到麩皮當(dāng)中，以生物量為指標(biāo)，探究水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)麩曲中耐熱細(xì)菌菌群的影響，結(jié)果如圖5 所示，隨著含水量的增加麩曲中整體細(xì)菌數(shù)呈先增后緩慢下降的趨勢(shì)，在相同的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，麩曲細(xì)菌數(shù)隨著富集溫度的升高而增加，而且在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)細(xì)菌數(shù)均為最低值，與55%及以上水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在相對(duì)較低時(shí)，培養(yǎng)效果一般，對(duì)細(xì)菌生物量影響較大。55 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大值，60 ℃以及65 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大值，當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于55%時(shí)細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì)，且變化趨勢(shì)不大，說(shuō)明在含水量較大時(shí)，在一定范圍內(nèi)，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)麩曲中的細(xì)菌生長(zhǎng)影響不大，55 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲細(xì)菌數(shù)在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)與其他水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異（P＜0.05），在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大為5.61×1010CFU/g。60 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲的細(xì)菌數(shù)在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)達(dá)到最大為7.26×1010CFU/g，65 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲的細(xì)菌生物量在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)達(dá)到最大為8.52×1010CFU/g。將BF_55、BF_60 以及BF_65 在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)做出的麩曲命名為FQ_55、FQ_60 以及FQ_65，對(duì)比于大曲中的細(xì)菌數(shù)8.72×106CFU/g，F(xiàn)Q_65 細(xì)菌數(shù)提升接近1 萬(wàn)倍，并以此麩曲展開(kāi)釀造試驗(yàn)。

圖5 不同水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下麩曲中細(xì)菌數(shù)Fig.5 The number of bacteria in bran koji under different moisture content conditions

2.3 耐熱細(xì)菌在小曲酒釀造中的應(yīng)用

2.3.1 耐熱細(xì)菌麩曲對(duì)小曲酒出酒率的影響

對(duì)于大曲耐熱細(xì)菌制作而成的麩曲功能的探究，需進(jìn)一步設(shè)計(jì)更接近實(shí)際生產(chǎn)的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。故本試驗(yàn)將大曲中的耐熱細(xì)菌群落應(yīng)用到小曲白酒的生產(chǎn)過(guò)程中，以期提高小曲白酒的質(zhì)量。各組出酒率結(jié)果如圖6 所示，整體出酒率在38%～40%之間，能達(dá)到良好的釀造效果，說(shuō)明了該釀造工藝的可行性。添加不同溫度富集液制作的麩曲，對(duì)小曲酒的原料出酒率有一定的提高，隨著富集溫度的升高出酒率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。其中添加不同耐熱細(xì)菌麩曲的小曲白酒出酒率均與對(duì)照組達(dá)到顯著水平（P＜0.05），使用65 ℃的耐熱細(xì)菌麩曲出酒率最高，為39.67%，相較對(duì)照組出酒率提高了3.7%。說(shuō)明在小曲酒發(fā)酵過(guò)程中添加適當(dāng)?shù)母患诖笄械哪蜔峒?xì)菌，可以提高小曲白酒的出酒率。耐熱細(xì)菌使小曲白酒出酒率增加的主要原因是大量細(xì)菌分解原料中的淀粉，將淀粉轉(zhuǎn)化為可被酵母菌利用的糖類物質(zhì)。此外，大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌還可以分解原料中的其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)，可以生成有機(jī)酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH 值和其他環(huán)境因素，為酵母菌提供更適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，幫助酵母菌更好地生長(zhǎng)和發(fā)酵，從而提高了出酒率。因此，耐熱細(xì)菌在小曲白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)提高白酒的出酒率起到了關(guān)鍵的作用。

圖6 不同耐熱細(xì)菌麩曲對(duì)小曲酒出酒率影響Fig.6 Effect of different heat-resistant bacteria bran on liquor yield of Xiaoqu liquor

2.3.2 耐熱細(xì)菌麩曲對(duì)小曲酒高級(jí)醇和總酯的影響

高級(jí)醇與酯類物質(zhì)都是小曲白酒中重要的香味成分，也是呈味物質(zhì)，直接影響白酒的品質(zhì)，因此對(duì)小曲白酒中高級(jí)醇以及酯類含量的控制至關(guān)重要。對(duì)小曲白酒中高級(jí)醇以及總酯含量測(cè)定，結(jié)果如表2 及圖7 所示，小曲白酒中高級(jí)醇主要以異戊醇為主，相比于對(duì)照組，添加不同耐熱細(xì)菌的麩曲，對(duì)小曲酒中的高級(jí)醇和總酯含量有一定的影響。隨著富集溫度的升高，小曲酒中高級(jí)醇含量逐漸降低，而酯類物質(zhì)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。其中用65 ℃耐熱細(xì)菌麩曲釀造的小曲白酒，高級(jí)醇含量最低，為0.96 mg/mL，較對(duì)照組高級(jí)醇含量降低27.27%，酯含量最高，為0.97 mg/mL，較對(duì)照組酯含量增加23.07%，與對(duì)照組均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。原因可能是原料中的淀粉會(huì)被細(xì)菌和酵母分解為糖類物質(zhì)，隨后，酵母菌會(huì)將這些糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)菌會(huì)釋放出一些有機(jī)酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)與酒精和其他物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，從而形成了酯類物質(zhì)，使小曲白酒中酯類物質(zhì)的增加。小曲白酒中高級(jí)醇含量的降低，可能與細(xì)菌的代謝過(guò)程有關(guān)。細(xì)菌和酵母對(duì)于不同種類的有機(jī)物質(zhì)的代謝能力是不同的，一些細(xì)菌更擅長(zhǎng)將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酒精，而減少了對(duì)于一些高級(jí)醇的生成。王亞平等[29]探究影響高級(jí)醇生成的因素，發(fā)現(xiàn)隨著大曲用量的增加，高級(jí)醇含量明顯下降，黃治國(guó)等[30]將從大曲中篩選出的2 株芽孢桿菌通過(guò)做成麩曲的形式，應(yīng)用到小曲白酒釀造過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)能有效降低小曲白酒中的高級(jí)醇含量，與試驗(yàn)結(jié)果相符。因此，在小曲酒發(fā)酵過(guò)程中，添加適當(dāng)大曲中的耐熱細(xì)菌，可以適當(dāng)降低小曲酒中的高級(jí)醇，提高酯類物質(zhì)的含量，進(jìn)一步可以達(dá)到合理的醇酯比，從而提高小曲白酒的品質(zhì)。

圖7 耐熱細(xì)菌對(duì)小曲酒中高級(jí)醇及總酯含量影響Fig.7 Effects of heat-resistant bacteria on contents of higher alcohols and total esters in Xiaoqu liquor

表2 不同耐熱細(xì)菌對(duì)小曲酒中高級(jí)醇含量影響Table 2 Effects of different heat-resistant bacteria on the content of higher alcohols in Xiaoqu liquor

3 結(jié)論

本研究是從大曲中分離富集三種高溫條件下的微生物菌群，并在55%含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，制成了三種細(xì)菌生物量可達(dá)5.61×1010CFU/g～8.31×1010CFU/g 的麩曲FQ_55、FQ_60 和FQ_65，對(duì)比大曲中的細(xì)菌數(shù)8.72×106CFU/g 有顯著提升。將樣品通過(guò)16S rDNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品菌群進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)高溫富集并接種至麩曲后，使原來(lái)大曲中Bacillus（芽孢桿菌）相對(duì)豐度從11.65%最大提升到麩曲中的64.22%。說(shuō)明大曲中的優(yōu)勢(shì)耐熱細(xì)菌被成功復(fù)刻到了麩曲中，并占主導(dǎo)地位。通過(guò)小曲酒釀造試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三種耐熱細(xì)菌麩曲的產(chǎn)酒能力均大于對(duì)照組，且在一定范圍內(nèi)隨著富集溫度的升高而增強(qiáng)。另外，細(xì)菌生物量最高的FQ_65 所釀造的小曲白酒相較于對(duì)照組，出酒率提高了3.7%，高級(jí)醇含量降低27.27%，酯含量增加23.07%，而且在一定范圍內(nèi)，富集溫度越高對(duì)小曲白酒質(zhì)量提升越大。研究表明，將中高溫大曲中的耐熱細(xì)菌通過(guò)麩曲為媒介應(yīng)用到小曲白酒生產(chǎn)過(guò)程中，制作出的麩曲具有豐富的細(xì)菌生物量，應(yīng)用于小曲白酒可以降低高級(jí)醇，增加酯類物質(zhì)，可提升小曲酒質(zhì)量小曲酒釀造過(guò)程中使用大曲優(yōu)勢(shì)耐熱細(xì)菌菌群，在一定范圍內(nèi)可以提高小曲白酒質(zhì)量，為小曲白酒的質(zhì)量提升及生產(chǎn)工藝的改善提供理論基礎(chǔ)。