吲哚-1,3,4-二唑類衍生物的合成及其體外抗腫瘤活性研究

鄭煦陽 ，李凌宇，胡玥，尚海*，鄒忠梅 *

1.天津中醫(yī)藥大學 研究生院，天津 301600

2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)新型生物活性分子的重要源泉[1]。其中含有5-(3-吲哚基)唑結構的天然產(chǎn)物表現(xiàn)出多種生物活性，如抗病毒[2]、抗菌[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]、抑制細胞增殖[6]和殺蟲活性[7]。從丁香假單胞桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來的labradorin 1 就是一種含有5-(3-吲哚基)唑母核結構的天然產(chǎn)物，其對人腫瘤細胞系MCF-7、KM20L2 表現(xiàn)出明顯的抗增殖活性，GI50值分別為3.9、3.5 μg/mL[8]。1,3,4-二唑是一種含有1 個氧原子和2 個氮原子的五元芳香雜環(huán)化合物，具有廣泛的生物活性，包括抗癌[9]、抗微生物[10]、抗真菌[11]、抗炎[12]和抗艾滋病[13]。值得注意的是，由于其獨特的結構，常常作為重要的藥效團出現(xiàn)在抗腫瘤藥物設計中。本研究以labradorin 1 為研究對象，采用骨架躍遷策略，將labradorin 1 中的唑環(huán)替換為1,3,4-二唑環(huán)，設計并合成了15 個吲哚-1,3,4-二唑類化合物，其結構均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR 和HR-ESI-MS 進行確證。通過MTT 法測試了目標化合物對HeLa、SCG-7901 和MDA-MB-231 3 種腫瘤細胞的體外抗增殖活性，并篩選出活性較好的化合物，進行了作用機制研究。

1 儀器與試劑

Bruker AV III 600 核磁共振儀（北京布魯克科技有限公司）；Waters SYNAPT G2 HDMS 高分辨質(zhì)譜儀（上海沃特世科技有限公司）；Mettler-AB104-S 分析天平（梅特勒托利多測量設備有限公司）；IKARCT basic 磁力攪拌器（德國艾卡儀器設備有限公司）；EYELA-N1100 旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；DLSB-5/20 型低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；H1 型多功能酶標儀（美國Biotek 公司）；FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD公司）；多功能成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）；PSC603-07S 型熒光顯微鏡（美國OPLENIC 公司）；薄層色譜板GF254（煙臺化工廠）；快速柱色譜用硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）。

吲哚-3-甲酰肼（畢得科技有限公司），3,3,3-三氟丙酸乙酯、苯胺、異丙胺、芐胺、對氟芐胺、鄰氟芐胺、間氟芐胺、對甲基苯胺、對甲基芐胺、對溴芐胺、對氟苯胺、對氯苯胺、苯乙胺、3-氨甲基吡啶、2-呋喃甲胺、對溴苯胺均購自北京伊諾凱科技有限公司；HATU（韶遠科技有限公司），DIEA（安耐吉化學），碳酸鈉、氫氧化鈉（北京通廣精細化工有限公司）；其余試劑均為分析純，購于天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)公司。

人宮頸癌細胞HeLa、人胃癌細胞SCG-7901、人乳腺癌細胞MDA-MB-231 和人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1 均購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心，二甲亞砜（DMSO，上海阿拉丁試劑有限公司）；噻唑藍（MTT，碧云天生物技術有限公司）、胎牛血清（貨號10099-141）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號8122175）、青霉素-鏈霉素（貨號15140-122）購自Gibco 公司；2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，HY-D0940-5 mg，MedChemExpress 公司）；含DAPI 抗熒光淬滅封片液（P0131-5 mL）購自碧云天生物技術有限公司；Annexin V-APC/PI 細胞凋亡試劑盒（AP107-100T）購自聯(lián)科生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 化合物的合成

以吲哚-3-甲酰肼為起始原料，通過［4+1］環(huán)加成反應、水解反應和縮合反應得到目標化合物，合成路線見圖1。

圖1 化合物6a～6o 的合成路線Fig.1 Synthetic route of compounds 6a — 6o

2.1.1 化合物3的合成 將吲哚-3-甲酰肼（100 mg，0.57 mmol）、3,3,3-三氟丙酸乙酯（82.5 μL，0.63 mmol）、Na2CO3（90.6 mg，0.85 mmol）和無水乙醇（3 mL）依次加入一個干燥的密封管中。將混合物加熱至90 ℃反應7 h，TLC 監(jiān)測反應完全。將反應液冷卻至室溫，硅藻土濾過，并用醋酸乙酯洗滌，濃縮濾液，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到化合物3（160 mg，產(chǎn)率88%）。1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.03（s，1H)，8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H，7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.0、7.0、1.2 Hz，1H），4.25（s，2H），4.17（q，J＝7.2 Hz，2H），1.22（t，J＝7.1 Hz，3H）。

2.1.2 化合物4 的合成 將化合物3（0.59 mmol）溶于四氫呋喃（2 mL）中，加入10% NaOH 水溶液1 mL，室溫攪拌0.5 h，TLC 監(jiān)測反應完全。反應液濃縮至1 mL，加入稀鹽酸調(diào)pH 值至2 左右，析出白色固體，抽濾，收集濾餅，得化合物4（83 mg，產(chǎn)率58%）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：13.15（s，1H），12.08（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.6 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.28～7.21（m，2H），4.12（s，2H）。

2.1.3 化合物6a～6o 的合成 將化合物4（0.29 mmol）和胺類化合物5（0.37 mmol）溶于DMF（2 mL）中，依次加入HATU（0.37 mmol）和DIEA（0.37 mmol），室溫攪拌2 h，TLC 監(jiān)測反應完全。將反應液倒入水中，用醋酸乙酯（20 mL×3）萃取，合并有機相，飽和食鹽水洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，濾過，減壓濃縮至析出大量固體，抽濾，濾餅依次用石油醚、二氯甲烷洗滌，收集濾餅，干燥，得到化合物6a～6o。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苯乙酰胺（6a）：白色固體，收率45.6%。mp 252.0～253.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（s，1H），10.47（s，1H），8.16（d，J＝2.7 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.60（d，J＝7.5 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 Hz，1H），7.34（t，J＝7.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.6、7.0、1.3 Hz，1H），7.09（t，J＝ 7.4 Hz，1H），4.18（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.5，162.3，159.6，138.7，136.4，128.9（2C），128.1，124.1，123.7，122.9，121.2，120.2，119.2（2C），112.5，99.4，33.6；HR-MSm/z：319.119 5 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(對甲苯基)乙酰胺（6b）：白色固體，收率54.6%。mp 249.1～251.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），10.37（s，1H），8.15（d，J＝2.8 Hz，1H），8.09（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.49（d，J＝8.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.4、6.5、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.4、1.3 Hz，1H），7.14（d，J＝8.3 Hz，2H），4.16（s，2H），2.26（s，3H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.2，162.3，159.7，136.4，136.2，132.7，129.3（2C），128.1，124.1，122.8，121.2，120.2，119.2（2C），112.4，99.4，33.5，20.5；HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苯基)乙酰胺（6c）：白色固體，收率63.5%。mp 262.7～264.8 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（d，J＝1.7 Hz，1H），10.53（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.64～7.61（m，2H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.3、7.0、1.2 Hz，1H），7.20～7.16（m，2H），4.17（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，162.4，159.6，158.2（d，J＝240.5 Hz），136.4，135.1（d，J＝2.0.Hz），128.1，124.1，122.9，121.2，121.0（d，J＝7.8 Hz），120.2，115.5（d，J＝21.6 Hz），112.5，99.4，33.5；HR-MSm/z：337.110 1 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氯苯基)乙酰胺（6d）：白色固體，收率49.0%。mp 254.5～256.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝2.1 Hz，1H），10.61（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.10（d，J＝7.5 Hz，1H），7.65～7.63（m，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.38（m，2H），7.27（ddd，J＝7.7、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.8、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.8，162.5，159.6，137.8，136.6，128.9（2C），128.2，127.4，124.2，123.0，121.3，120.9（2C），120.3，112.6，99.5，33.8；HR-MSm/z：353.080 5[M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苯基)乙酰胺（6e）：白色固體，收率34.8%。mp 256.3～258.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝1.8 Hz，1H），10.61（s，1H），8.12（d，J＝2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.59（d，J＝7.5 Hz，2H），7.54～7.52（m，3H），7.27（ddd，J＝7.6、6.5、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.0、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.9，162.4，159.5，138.1，136.4，131.7（2C），128.1，124.1，122.9，121.2（2C），121.1，120.2，115.3，112.5，99.4，33.7；HR-MSm/z：397.030 0 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-芐基乙酰胺（6f）：白色固體，收率 64.5%。mp 237.2～239.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.87（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.9 Hz，1H），7.53（d，J＝7.7 Hz，1H），7.35～7.30（m，4H），7.28～7.23（m，3H），4.34（d，J＝5.9 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.6，162.2，159.9，139.0，136.4，128.4（2C），128.0，127.3（2C），127.0，124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.5，32.6；HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-甲基芐基)乙酰胺（6g）：白色固體，收率55.2%。mp 243.0～245.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），8.81（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.3 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.6、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.2、7.0、1.1 Hz，1H），7.19（d，J＝7.9 Hz，2H），7.14（d，J＝7.9 Hz，2H），4.29（d，J＝5.9 Hz，2H），3.97（s，2H），2.28（s，3H）；13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ165.5，162.2，159.9，136.4，136.0，135.9，128.9（2C），128.0，127.4（2C），124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.2，32.6，20.7；HR-MSm/z：347.150 8 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基芐基)乙酰胺（6h）：白色固體，收率40.4%。mp 195.2～197.9 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），9.03（t，J＝6.3 Hz，1H），8.21（d，J＝8.8 Hz，2H），8.14（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.9 Hz，1H），7.58（d，J＝9.0 Hz，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H),7.27（ddd，J＝8.3、7.5、1.1 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.0、6.9、1.0 Hz，1H），4.48（d，J＝6.1 Hz，2H），4.04（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ166.0，162.3，159.8，147.2，146.5，136.4，128.3（2C），128.0，124.1，123.6（2C），122.9，121.2，120.2，112.5，99.6，42.0，32.5；HR-MSm/z：378.120 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(2-氟芐基)乙酰胺（6i）：白色固體，收率48.2%。mp 237.2～239.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.3 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.42～7.39（m，1H），7.35～7.32（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.3 Hz，1H），7.24～7.17（m，3H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.7，162.2，160.13（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(3-氟芐基)乙酰胺（6j）：白色固體，收率48.3%。mp 239.2～241.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.91（t，J＝6.0 Hz，1H），8.12（d，J＝2.8 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.36（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.1、1.1 Hz，1H），7.17～7.13（m，2H），7.11～7.07（m，1H），4.36（d，J＝6.0 Hz，2H），4.02（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.7，162.2，160.1（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟芐基)乙酰胺（6k）：白色固體，收率51.5%。mp 229.6～231.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.2 Hz，1H），7.37～7.33（m，2H），7.27（ddd，J＝7.4、6.8、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），7.19～7.15（m，2H），4.32（d，J＝5.8 Hz，2H），3.32（s，2H）；13CNMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.2，161.3（d，J＝242.0 Hz），159.9，136.4，135.2（d，J＝3.2 Hz），129.3（d，J＝8.0 Hz），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，115.1（d，J＝21.0 Hz），112.5，99.5，41.8，32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴芐基)乙酰胺（6l）：白色固體，收率33.6%。mp 210.2～212.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.90（t，J＝6.2 Hz，1H），8.13（s，1H），8.07（d，J＝7.3 Hz，1H），7.52～7.54（m，3H），7.28～7.21（m，4H），4.31（d，J＝6.2 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ：165.7，162.3，159.8，138.5，136.4，131.2（2C），129.6（2C），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，120.0，112.5，99.4，41.8，32.5；HR-MSm/z：411.045 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基芐基)乙酰胺（6m）：白色固體，收率72.9%。mp 193.4～194.8 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.01（d，J＝1.9 Hz，1H），8.93（t，J＝5.8 Hz，1H），8.54（d，J＝1.5 Hz，1H），8.48（d，J＝8.5 Hz，1H），8.12（d，J＝9.0 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.72（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.37（dd，J＝4.7、3.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.8、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.3、7.5、1.2 Hz，1H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.8，162.3，159.8，148.8，148.3，136.4，135.2，134.5，128.0，124.1，123.5，122.9，121.2，120.2，112.5，99.4，40.2，32.5；HR-MSm/z：334.130 4 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(呋喃-2-基甲基)乙酰胺（6n）：白色固體，收率39.6%。mp 208.5～210.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.02（d，J＝1.9 Hz，1H），8.84（t，J＝5.5 Hz，1H），8.13（d，J＝2.8 Hz，1H），8.08（d，J＝7.7 Hz，1H），7.61（dd，J＝1.9 Hz，J＝0.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0，1H），7.27（ddd，J＝7.7、6.7、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.3、1.2 Hz，1H），6.42（dd，J＝3.8、1.8 Hz，1H），6.31（dd，J＝3.2、0.6 Hz，1H），4.33（d，J＝5.6 Hz，2H），3.96（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.4，159.5，151.8，142.5，136.5，128.1，124.2，123.0，121.3，120.3，112.6，110.6，107.3，99.6，35.9，32.5；HR-MSm/z：323.114 4 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-異丙基乙酰胺（6o）：白色固體，收率67%。mp 242.0～243.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.26（d，J＝7.7 Hz，1H），8.12（d，J＝ 2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝7.5 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），3.88～3.83（m，3H），1.10（d，J＝6.6 Hz，6H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，163.2，160.0，136.4，127.9，124.1，122.8，121.1，120.2，112.5，99.5，55.0，40.9，32.6，22.3（2C）；HR-MSm/z：285.135 2[M＋H]+。

2.2 化合物的抗腫瘤活性研究

2.2.1 目標化合物對腫瘤細胞增殖的影響 采用MTT 法測試目標化合物6a～6o 對HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 細胞的體外抗腫瘤活性。將HeLa、SCG-7901、MDA-MB-231 細胞以5×104個/mL 密度接種到96 孔板中，每孔100 μL。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設置對照組和給藥組，給藥組每孔加入梯度稀釋的化合物6a～6o 藥液（終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L）200 μL，對照組加入含有等體積DMSO 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，加入5 mg/mL MTT 溶液5 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩10 min，酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度（A）值。實驗設置3 個平行孔，重復2 次，取平均值。采用GraphPad Prism 9 計算目標化合物6a～6o 對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），結果見表1。

表1 化合物6a～6o 的體外抗腫瘤活性Table 1 In vitro antitumor effect of compounds 6a — 6o

化合物6f、6g、6k、6l 表現(xiàn)出抗腫瘤活性，其中化合物6f、6g 對3 種腫瘤細胞均表現(xiàn)出良好的抗增殖作用。活性最好的化合物6f 對HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 細胞的IC50分別為（4.35±0.32）、（3.94±0.03）、（4.04±1.06）μmol/L。初步的構效關系研究表明，芐胺衍生物具有良好的抗腫瘤活性。其中芐胺的苯環(huán)上無取代基或為甲基取代基時，衍生物表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。當苯環(huán)上的取代基替換為鹵素或硝基取代時則活性下降，甚至消失，說明芐胺的苯環(huán)上連有供電子基團有助于抗腫瘤活性。當酰胺的氨基部分由芐胺替換為苯胺、烷基胺時，衍生物的抗腫瘤活性喪失。此外，將芐胺的苯基替換為吡啶或呋喃基團時，衍生物同樣無明顯抗腫瘤作用。說明芐胺基團對衍生物發(fā)揮抗腫瘤活性至關重要。

為了進一步考察目標化合物抗腫瘤作用是否具有選擇性，實驗測試了化合物6f、6g 對人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1 存活率的影響，結果見表1。結果顯示，化合物6f、6g 的選擇性指標[SI，SI＝IC50(CCC-HPF-1)/IC50(SGC-7901)]分別為 3.54、11.09，具有良好的細胞選擇性?？紤]到化合物6f 的活性更優(yōu)，故選擇化合物6f 進行后續(xù)實驗。

2.2.2 化合物6f 抑制SCG-7901 細胞增殖 采用克隆形成實驗考察化合物6f 對SCG-7901 細胞增殖的影響。實驗設置空白組和給藥組。取對數(shù)生長期的SCG-7901 細胞，調(diào)整細胞密度至800 個/mL，接種于6 孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的化合物6f，終濃度分別為10、20、40 μmol/L，空白組加入含等體積DMSO 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后，棄去上清液，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，除去4%多聚甲醛。使用結晶紫染色液染色10 min，水洗除去多余的結晶紫染色液，晾干后進行拍照記錄。用Image J 軟件分析細胞集落數(shù)量（大于50 個細胞的細胞群為1 個集落），結果見圖3。在40 μmol/L 的濃度下，化合物6f 可顯著抑制細胞集落的形成，SCG-7901 細胞的平均集落數(shù)量由711 個（空白組）減少至2 個。

圖3 化合物6f 對SCG-7901 細胞增殖的影響（,n＝3）Fig.3 Effect of compound 6f on colony formation of SCG-7901 cells ,n＝3)

2.2.3 化合物6f 誘導SCG-7901 細胞凋亡和壞死 采用Annexin V-APC/PI 雙染法檢測化合物6f 對SCG-7901 細胞凋亡和壞死的影響[14]。實驗設置空白組和給藥組。取對數(shù)生長期的SCG-7901 細胞，調(diào)整細胞密度至3×105個/mL，接種于6 孔板中，每孔1 mL。待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的化合物6f，終濃度分別為10、20、40 μmol/L，空白組加入含等體積DMSO 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，PBS 洗滌細胞，將細胞轉移至流式管中，向流式管內(nèi)分別加入Annexin V-APC（10 μL）和PI（5 μL）染液，室溫孵育10 min，使用流式細胞儀檢測凋亡和壞死細胞的比例。并使用Flow Jo 軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)顯示為偽彩圖，結果見圖4。40 μmol/L 化合物6f 處理24 h 后，SCG-7901 細胞的早期凋亡細胞占比由4.76%升高到17.6%，晚期凋亡細胞占比由1.92%上升到13.2%。細胞凋亡率（早期凋亡與晚期凋亡）隨濃度的升高而升高，呈一定的濃度相關性。提示化合物6f 通過促進腫瘤細胞的凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖4 化合物6f 對SCG-7901 細胞凋亡的影響（,n＝3）Fig.4 Effect of compound 6f on apoptosis rate of SCG-7901 cells ,n＝3)

2.2.4 化合物6f 對SCG-7901 細胞形態(tài)學的影響 采用DAPI 染色法檢測化合物6f 對SCG-7901 細胞凋亡核染色質(zhì)形態(tài)學的影響。實驗設置空白組和給藥組。取對數(shù)生長期SCG-7901 細胞，以4×104個/mL的細胞密度接種于置有直徑為8 mm 爬片的48 孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的化合物6f，終濃度分別為5、10、20 μmol/L，空白組加入含等體積DMSO 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，棄去上清，PBS 洗滌細胞，4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 洗滌細胞3 次，取出爬片，置于含有DAPI 抗熒光淬滅封片液的載玻片上，4 ℃孵育15 min，使用熒光顯微鏡觀察染色情況并拍照記錄，結果見圖5?？瞻捉M的細胞核形態(tài)規(guī)則，且呈彌散均勻的淡藍色熒光。給予不同濃度的化合物6f 后，SCG-7901細胞的細胞核固縮，染色質(zhì)高度凝聚，說明化合物6f 能夠誘導SCG-7901 細胞的凋亡。

圖5 化合物6f 對SCG-7901 細胞核形態(tài)變化的影響Fig.5 Effect of compound 6f on the nuclear morphological changes of SCG-7901 cells

2.2.5 化合物6f 誘導SCG-7901 細胞活性氧（ROS）水平升高 采用DCFH-DA 染色法檢測化合物6f 對SCG-7901 細胞中ROS 含量的影響。實驗設置空白組和給藥組。取對數(shù)生長期的SCG-7901 細胞，以3×105個/mL 的細胞密度接種于24 孔板內(nèi)。待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的化合物6f，終濃度分別為5、10、20 μmol/L，空白組加入含等體積DMSO 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入DCFH-DA 熒光探針（10 μmol/L），室溫避光孵育30 min，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，使用熒光顯微鏡觀察染色情況并拍照記錄，結果見圖6。與空白組相比，化合物6f 處理后的細胞內(nèi)DCFH-DA的平均熒光強度明顯增強，說明細胞內(nèi)的ROS 水平顯著升高，且具有劑量相關性。結果表明，化合物6f 可有效促進SCG-7901 細胞活性氧的生成。

圖6 化合物6f 對SCG-7901 細胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.6 Effect of compound 6f on ROS level of SCG-7901 cell

3 討論

labradorin 1 是一種具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，實驗在labradorin 1 的結構基礎上采用骨架躍遷策略合成了一系列吲哚-1,3,4-二唑類衍生物，部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用，其中化合物6f表現(xiàn)出最好的抗腫瘤活性，并具有一定的細胞選擇性，說明酰胺的氨基部分為芐胺基團取代時活性最優(yōu)。此外化合物6f 對所測試的3 種腫瘤細胞株均表現(xiàn)出抗增殖作用，說明化合物6f 還具有抗腫瘤譜廣的特點。作用機制研究發(fā)現(xiàn)，該類衍生物可以誘導腫瘤細胞的凋亡和壞死。其中衍生物誘導腫瘤細胞凋亡作用可能與促進腫瘤細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，進而造成線粒體損傷有關[15-16]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突