基于非糧糖蜜的聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化與中試放大

李舒婷，袁 凱，李 華，周衛(wèi)強(qiáng)，唐 堂，楊小凡，劉海軍，李方亮，李 凡，李 義，彭 超*

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 100029；3.中糧生化能源（榆樹(shù)）有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130400；4.吉林中糧生化有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130033）

全球每年85%的廢棄塑料最終被填埋或傾倒到海洋中，塑料[1]、微塑料[2]及其所含有害物質(zhì)會(huì)逐漸出現(xiàn)在食物[3]、飲用水和空氣中[4]。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一類在微生物體內(nèi)合成的由羥基脂肪酸單體通過(guò)酯化聚合得到的生物塑料[5]，可以作為生態(tài)友好型生物塑料替代石油優(yōu)質(zhì)材料[6]。研究者構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，優(yōu)化底盤(pán)菌株的工作效率[7]，使PHA的合成效率得到大大提升[8]。目前篩選出耐高鹽、高滲透壓的嗜鹽單胞菌，直接避免無(wú)菌操作，極大降低PHA發(fā)酵成本及復(fù)雜性[5]，研究發(fā)現(xiàn)中度嗜鹽單胞菌（Salinivibriosp.）TGB10發(fā)酵獲得的PHA達(dá)27.36 g/L[9]。鹵單胞菌（Halomonassp.）YLGW01菌株發(fā)酵合成的PHA高達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的95.26%[10]，是目前嗜鹽單胞菌（Halomonassp.）產(chǎn)PHA最高的菌種。但菌株生產(chǎn)PHA效率低、制備成本高的問(wèn)題限制著PHA的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用[11]。

PHA的廣泛應(yīng)用受限于其較高的生產(chǎn)成本，有研究表示生產(chǎn)PHA過(guò)程中碳源成本占30%～50%[11]，而糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，主要含有大量可發(fā)酵糖（主要是蔗糖），是很好的發(fā)酵原料，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]，在食品、醫(yī)療[13]、化工[14]和微生物發(fā)酵[15]行業(yè)具有廣闊研究前景，已有研究人員從甘蔗中分離出甘蔗糖蜜和具有生產(chǎn)儲(chǔ)存能力的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），分批發(fā)酵得到PHA最大產(chǎn)量為4.13～4.98 g/L[16]。

目前PHA生產(chǎn)過(guò)程中以蔗糖、淀粉、玉米油等生產(chǎn)PHA存在與人爭(zhēng)糧的問(wèn)題，故采用價(jià)格低廉的糖蜜為碳源物質(zhì)制備PHA的研究十分必要。本研究以鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01為發(fā)酵菌株，基于非糧糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)PHA，分析OD600nm值、細(xì)胞干質(zhì)量、PHA含量，并以PHA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化PHA發(fā)酵培養(yǎng)基，并在千噸級(jí)中試生產(chǎn)線驗(yàn)證，為促進(jìn)非糧生物基材料生產(chǎn)，優(yōu)化生產(chǎn)強(qiáng)度具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及原料

鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01：清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；糖蜜：中糧糖業(yè)遼寧有限公司；玉米漿粉（含氮量6.2%）：山東振華生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：英國(guó)OXOID公司；氯化鈉、硫酸鎂、尿素、硫酸銨、濃硫酸、苯甲酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水甲醇、三氯甲烷（均為色譜純）：美國(guó)Honeywell公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[17]

LB瓊脂培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g，蛋白質(zhì)1.0 g，氯化鈉6.0 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至8.0，在121 ℃滅菌15 min后倒平板。

LB種子搖瓶培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉60 g，蒸餾水1 L，pH調(diào)至8.0；一級(jí)種子搖瓶為100 mL錐形瓶分裝20 mL培養(yǎng)基；二級(jí)搖瓶為2 L錐形瓶分裝300 mL培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿粉16.00 g/L，硫酸鎂0.21 g/L，尿素2.00g/L，磷酸鹽10.00g/L，糖蜜23.6g/L，氯化鈉50.00 g/L，蒸餾水900 mL，pH調(diào)至8.5。

補(bǔ)料培養(yǎng)基①：硫酸鎂0.03 g，尿素2.00 g，磷酸鹽0.97 g，玉米漿粉8.33 g，糖蜜73.48 g，蒸餾水15 mL。

1 L發(fā)酵體系補(bǔ)料培養(yǎng)基②：尿素1.50 g，玉米漿粉1.94 g，糖蜜73.48 g。

1 L發(fā)酵體系補(bǔ)料培養(yǎng)基③：硫酸銨0.84 g，糖蜜104.98 g。1 L發(fā)酵體系補(bǔ)料培養(yǎng)基④：糖蜜156.86 g。

2 L和5 kL發(fā)酵培養(yǎng)基以及補(bǔ)料培養(yǎng)基按照裝液量等比例放大即可。

酯化液：無(wú)水甲醇970.00 mL，濃硫酸30.00 mL，苯甲酸1.00 g。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOSTAT B發(fā)酵罐：德國(guó)Sartorius公司；FD8-6型凍干機(jī)：瑞士METTLER TOLEDO公司；6B-56型智能消解儀：上海銳析儀器設(shè)備有限公司；7890B型氣相色譜（gas chromatography，GC）檢測(cè)儀、Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；UV-1750 分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及種子液的制備

將保藏于-80℃甘油管的菌株TD01解凍，在LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，后取平板上單菌落至一級(jí)種子進(jìn)行搖床培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min。取3 mL一級(jí)種子液于二級(jí)種子搖瓶中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)及中試放大

1 L和2 L發(fā)酵罐的初始裝液量為發(fā)酵罐體積的50%，接種量為初始裝液量的10%。5 kL發(fā)酵罐的初始裝液量為發(fā)酵體積的60%，接種量為初始裝液量的10%。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，當(dāng)發(fā)酵條件達(dá)到37 ℃、pH 8.5、轉(zhuǎn)速達(dá)到500 r/min、通氣量1 L3/min時(shí)開(kāi)始接種。當(dāng)溶氧低于20%時(shí)開(kāi)始提高轉(zhuǎn)速以保證溶氧能夠維持在20%，直至最高轉(zhuǎn)速1 000 r/min。于8 h開(kāi)始補(bǔ)料①，調(diào)整補(bǔ)料流速為1.5 mL/min，當(dāng)前一補(bǔ)料結(jié)束后接入下一次補(bǔ)料直至OD600nm值連續(xù)8 h下降，發(fā)酵時(shí)間控制在52 h內(nèi)。

1.3.3 聚羥基脂肪酸酯的制備

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min，倒出上清液，加水重懸洗滌10 min后，再次以8 000 r/min離心15 min，棄去上清并冷凍后置于真空冷凍干燥機(jī)中-80 ℃干燥48 h即可得到PHA粗品。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

不同糖蜜添加量的確定：以菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基質(zhì)，分別設(shè)置糖蜜添加量為6 g/L、12 g/L、24 g/L、48 g/L、96 g/L，初始pH值為8.5，每組兩個(gè)平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后取樣分析。

總氮添加量的確定：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿粉為氮源，以菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中總氮添加量。玉米漿粉添加量分別為8 g/L、16 g/L、24 g/L、32 g/L、40 g/L、48 g/L，初始pH值為8.5，每組兩個(gè)平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

最佳氮源的確定：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基質(zhì)，按照總氮添加量一致原則，按總氮添加量為1.98 g/L，分別以玉米漿粉、酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨作為氮源，以菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初始pH值為8.5，每組兩個(gè)平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

尿素和硫酸銨配比的確定：在總氮保持1.98 g/L不變情況下，分別考察尿素和硫酸銨的配比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，對(duì)照組氮源為玉米漿粉。初始pH值為8.5，每組兩個(gè)平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，由單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇糖蜜添加量（A）、尿素添加量（B）、硫酸銨添加量（C）為自變量，以PHA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation medium formula optimization

1.3.5 優(yōu)化發(fā)酵罐發(fā)酵工藝與中試驗(yàn)證

將優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果等比例放大應(yīng)用到1 L發(fā)酵罐中裝液量為500 mL，接種量10%進(jìn)行發(fā)酵，于8 h左右接補(bǔ)料，當(dāng)前一補(bǔ)料結(jié)束后接入下一補(bǔ)料。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化并將調(diào)整后發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用于5 kL中試發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.6 分析檢測(cè)

菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）的測(cè)定：取一定體積的發(fā)酵樣品，在波長(zhǎng)為600 nm條件下測(cè)定吸光度值，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為樣品OD600nm值。

菌體干質(zhì)量的測(cè)定：從發(fā)酵8 h開(kāi)始每4 h留取發(fā)酵樣品35 mL，直至發(fā)酵結(jié)束，將樣品以8 000 r/min離心15 min，倒出上清液，加水重懸洗滌10 min后，再次以8 000 r/min離心15 min，棄去上清并冷凍后置于真空冷凍干燥機(jī)中48 h，待樣品完全干燥后稱取干質(zhì)量。菌體干質(zhì)量計(jì)算公式如下：

式中：M為菌體干質(zhì)量，g/L；m2為凍干后樣品質(zhì)量，g；m1，50 mL離心管質(zhì)量，g；35為樣品的體積，mL；1 000為換算系數(shù)。

PHA含量的測(cè)定采用氣相色譜法[18]：將凍干樣品碾碎后，稱取35 mg于酯化管，每管加2 mL三氯甲烷溶液、2 mL酯化液于酯化管中后置于金屬浴中100 ℃加熱反應(yīng)4 h，將酯化管取出降至常溫，每管加入1 mL去離子水，振蕩15 min后靜置分層，取下層液過(guò)膜，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜條件：Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；壓力69.22 kPa；載氣為高純氮?dú)猓∟2）；流動(dòng)相流速2 mL/min；柱箱溫度開(kāi)啟時(shí)80 ℃，維持時(shí)間3 min，空氣流量400 mL/min；氫氣流量30mL/min；柱箱溫度350℃；尾吹氣流量25mL/min；加熱器溫度250 ℃；總流量65 mL/min；分流比30∶1；分流流量60 mL/min。

定性定量方法：根據(jù)PHA標(biāo)準(zhǔn)品與PHA樣品在相同色譜及分析條件下的色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性。以PHA標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）作為縱坐標(biāo)，PHA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制PHA標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.160 2x-0.357 3，按照回歸方程計(jì)算樣品中PHA含量。PHA產(chǎn)量=細(xì)胞干質(zhì)量×PHA含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design Expert 13.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同糖蜜添加量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖1可知，當(dāng)糖蜜添加量在6～24 g/L范圍內(nèi)增加，OD600nm值、PHA產(chǎn)量隨糖蜜添加量升高而增加；當(dāng)糖蜜添加量為24 g/L時(shí)，菌體OD600nm值、PHA產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為32.2、2.25 g/L；當(dāng)糖蜜添加量為24～96 g/L時(shí)，菌體OD600nm值、PHA產(chǎn)量有所下降。說(shuō)明糖蜜的添加可以維持菌體正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)水平，但糖蜜添加量過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基體系滲透壓增大，從而抑制菌體生長(zhǎng)[19]。因此，最適糖蜜添加量為24 g/L。

圖1 不同糖蜜添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of different molasses addition on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.1.2 總氮添加量對(duì)發(fā)酵的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿粉為氮源，考察總氮添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)玉米漿粉在8～32 g/L范圍時(shí)，OD600nm值呈階梯狀遞增是因?yàn)榈吞嫉雀欣诰w生物量的提高[20]，PHA產(chǎn)量隨之增加；玉米漿粉添加量為16 g/L時(shí)OD600nm值為34，高于玉米漿粉添加量為8 g/L和24 g/L，說(shuō)明此時(shí)培養(yǎng)基能夠維持菌體量的高效生成，但不利于產(chǎn)物的積累，PHA產(chǎn)量較低為1.83 g/L。當(dāng)玉米漿粉添加量為32 g/L時(shí)，PHA產(chǎn)量為2.27 g/L，且OD600nm值較高為33.45；當(dāng)玉米漿粉添加量在32～48 g/L時(shí)，OD600nm值、PHA產(chǎn)量有所降低，原因是過(guò)高的碳氮比會(huì)因滲透壓作用抑制菌體的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)導(dǎo)致PHA合成受阻[21]，因此，最適玉米漿粉添加量為32 g/L，即最適總氮添加量為1.98 g/L。

圖2 玉米漿粉添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of corn steep powder addition on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.1.3 不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響

按等氮原則研究不同氮源（玉米漿粉、酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨）對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，其中總氮含量為1.98 g/L，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

由圖3可知，酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨的PHA產(chǎn)量較高，分別為2.19 g/L、2.07 g/L、2.67 g/L、2.23 g/L，比玉米漿粉組高出25.97%、19.07%、53.58%、28.27%，且酵母粉、玉米漿和尿素3種有機(jī)氮源作用下菌體生長(zhǎng)較好，說(shuō)明其更能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)。推測(cè)是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源更能促進(jìn)嗜鹽單胞菌TD01合成PHA，可能是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源可以被菌體直接利用[22]，前期能夠加速促進(jìn)生物量的積累，后期氮源不足時(shí)，有足夠時(shí)間將所吸收的碳源轉(zhuǎn)變成聚酯產(chǎn)物[23]，推測(cè)有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源結(jié)合更有利于發(fā)酵。綜合PHA產(chǎn)量判斷氮源效果：尿素＞硫酸銨＞酵母粉＞玉米漿粉＞玉米漿。因此，故選擇尿素、硫酸銨為最適氮源。

2.1.4 不同尿素和硫酸銨配比對(duì)發(fā)酵的影響

按總氮含量為1.98 g/L研究不同尿素和硫酸銨配比對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)尿素和硫酸銨組合時(shí)，OD600nm值和PHA產(chǎn)量較對(duì)照組均得到有效提高，說(shuō)明該組合能夠有效促進(jìn)菌體量積累的同時(shí)也能促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成，可能是無(wú)機(jī)氮源硫酸銨的引入提供了前期菌體生長(zhǎng)時(shí)可直接利用氮源需求。隨著硫酸銨比例的降低，OD600nm值和PHA產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)尿素和硫酸銨氮原子添加量為1∶1時(shí)OD600nm值和PHA產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為34.15和2.48 g/L，比對(duì)照組高出29.36%和42.82%，說(shuō)明有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源的等比例添加即尿素和硫酸銨添加量分別為2.00 g/L和4.44 g/L時(shí)更有利于PHA的產(chǎn)出。

圖4 不同尿素與硫酸銨配比對(duì)菌體生長(zhǎng)和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of different ratios of urea and ammonium sulfate on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以糖蜜添加量（A）、尿素添加量（B）、硫酸銨添加量（C）為自變量，PHA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Benhken響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhken experiments for fermentation medium optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y=2.57+0.578 4A-0.0129B-0.209 7C+0.093 2AB-0.368 8AC+0.031 4BC-0.609 0A2-0.034 7B2-0.051 9C2

由表3中的P值可知，該回歸方程P＜0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.058 9＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，方程回歸模型擬合真實(shí)水平，選擇合理。F值為44.75、決定系數(shù)R2=0.982 9、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.961 0，說(shuō)明該回歸模型擬合程度較好，能用于本試驗(yàn)預(yù)測(cè)分析。該模型的精密度為21.6920＞4，進(jìn)一步說(shuō)明模型合理。由P值可知，一次項(xiàng)A、C與二次項(xiàng)A2以及交互項(xiàng)AC對(duì)PHA產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、BC以及二次項(xiàng)B2、C2對(duì)PHA產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響PHA產(chǎn)量的因素順序?yàn)锳（糖蜜添加量）＞C（硫酸銨添加量）＞B（尿素添加量）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，得到了各個(gè)影響因素的交互作用對(duì)PHA產(chǎn)量的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。響應(yīng)面坡度越陡，其等高線越接近橢圓，說(shuō)明這兩個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果影響越顯著，反之，若響應(yīng)面坡度越小等高線越接近圓形，則表示兩個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著。

圖5 尿素添加量、糖蜜添加量、硫酸銨添加量交互作用對(duì)聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of urea addition,molasses addition and ammonium sulfate addition on polyhydroxyalkanoate yield

由圖5（a）可知，PHA產(chǎn)量隨糖蜜和尿素添加量增高而增大，二者交互作用對(duì)結(jié)果影響響應(yīng)面坡度較緩，表明這兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響不顯著。由圖5（b）可知，PHA產(chǎn)量隨硫酸銨和糖蜜添加量增高而增大，二者交互作用對(duì)結(jié)果影響響應(yīng)面坡度較陡，等高線呈橢圓形，表明這兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由圖5（c）可知，PHA產(chǎn)量隨硫酸銨和尿素添加量增高而增大，二者交互作用對(duì)結(jié)果影響響應(yīng)面坡度平緩，表明這兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響不顯著。這與表3方差分析結(jié)果一致。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè)，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為糖蜜添加量33.191 g/L、尿素添加量2.467 g/L、硫酸銨添加量2.22 g/L。在該優(yōu)化條件下PHA產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值為3.107 g/L。為了便于實(shí)際操作，將發(fā)酵培養(yǎng)基配方修正為糖蜜添加量33.2 g/L、尿素添加量2.5 g/L、硫酸銨添加量2.2 g/L。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次搖瓶平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到PHA平均產(chǎn)量實(shí)際值為（3.12±1.19）g/L，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值比較相對(duì)誤差為0.418%，證明該模型合理可行。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵罐發(fā)酵工藝與中試放大

因反應(yīng)器的發(fā)酵混合傳質(zhì)和供氧能力，需進(jìn)一步驗(yàn)證比較1 L發(fā)酵罐采用優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵效果。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，將上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于1 L發(fā)酵罐，發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯的變化情況見(jiàn)圖6。

圖6 優(yōu)化前（a）、后（b）1L生物反應(yīng)器下菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 6 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 1 L bioreactor before (a) and after (b) optimization

由圖6a可知，發(fā)酵44 h時(shí)，其最高OD600nm值、細(xì)胞干質(zhì)量、PHA含量、PHA產(chǎn)量分別為184、55.20 g/L、50.40%、27.82g/L。由圖6b可知，發(fā)酵52h時(shí)，其最高細(xì)胞干質(zhì)量82g/L、PHA含量68.79%，總產(chǎn)量56.41 g/L。較優(yōu)化前PHA產(chǎn)量提高了90.32%。優(yōu)化前后對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵16 h前PHA含量幾乎相同，細(xì)胞干質(zhì)量于發(fā)酵16 h時(shí)相差16.4 g/L，可能是無(wú)機(jī)氮更易于被菌體吸收，有助于生物量的積累。優(yōu)化后細(xì)胞干質(zhì)量在24 h后幾乎停滯增長(zhǎng)，推測(cè)菌體代謝過(guò)快，補(bǔ)料不足以維持其正常代謝導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不均衡，菌體開(kāi)始利用所吸收的碳源合成PHA[20]。

根據(jù)發(fā)酵20～32 h的發(fā)酵情況加倍糖氮添加量，得到補(bǔ)料優(yōu)化后2 L生物反應(yīng)器下發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化情況見(jiàn)圖7。通過(guò)2 L生物反應(yīng)器放大反應(yīng)，于發(fā)酵48 h得到菌體干質(zhì)量92.5 g/L、PHA含量72.82%，總PHA產(chǎn)量達(dá)到67.36 g/L，較優(yōu)化前PHA產(chǎn)量增長(zhǎng)了142.13%。發(fā)酵20 h后，細(xì)胞干質(zhì)量與PHA含量有明顯增長(zhǎng)，證明上述推測(cè)20 h因缺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)停滯結(jié)論正確[24]。加倍糖氮補(bǔ)料后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，有利于生物量的增長(zhǎng)使菌體干質(zhì)量持續(xù)上漲的同時(shí)不利于胞內(nèi)PHA的積累致使PHA含量于37 h后保持平穩(wěn)[25]，但PHA含量仍然比未加倍糖氮補(bǔ)料時(shí)高出5.86%，PHA產(chǎn)量高出19.41%。可能是因?yàn)榈闯渥阌欣诰w的生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)菌體大量積累時(shí)，即使氮添加量充足也會(huì)積累少量PHA[25-26]。證明過(guò)高或過(guò)低的糖氮添加量都會(huì)抑制發(fā)酵的進(jìn)行[27-28]，也許有機(jī)氮源被吸收慢能保持培養(yǎng)基中持續(xù)含氮更有利于生物量增長(zhǎng)[29]，無(wú)機(jī)氮源更有利于PHA含量的積累[30]。

圖7 補(bǔ)料優(yōu)化后2 L生物反應(yīng)器下菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 7 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 2 L bioreactor after feeding optimization

為驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于工業(yè)化規(guī)模的可行性，進(jìn)行鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01的5 kL中試驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)曲線見(jiàn)圖8，發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯的變化情況見(jiàn)圖9。由圖8和圖9可知，在發(fā)酵溫度和速度保持穩(wěn)定狀態(tài)下，發(fā)酵22 h加堿量保持平穩(wěn)，發(fā)酵10～16.5 h時(shí)耗糖量不斷增大，菌體正在進(jìn)行大量積累。發(fā)酵22.5 h切換補(bǔ)料后pH和溶氧迅速上漲且從發(fā)酵22.5～28.0 h內(nèi)OD600nm值保持平穩(wěn)，28.0 h加大糖氮補(bǔ)料補(bǔ)充后pH和溶氧穩(wěn)定到正常范圍，且細(xì)胞干質(zhì)量、PHA含量長(zhǎng)勢(shì)趨于平緩，證明氮源供應(yīng)量不足以菌體消耗所致，發(fā)酵22.5～28 h營(yíng)養(yǎng)缺乏在一定程度上抑制菌體活力，此時(shí)PHA含量生長(zhǎng)較為平緩。發(fā)酵42.5 h開(kāi)始OD600nm值保持平穩(wěn)但仍在消耗糖和堿，推測(cè)是PHA仍在積累，并于50.5 h發(fā)酵結(jié)束，OD600nm值為250，細(xì)胞干質(zhì)量為81.67 g/L，PHA含量為62.65%，總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L。結(jié)果表明，5 kL中試發(fā)酵試驗(yàn)得到發(fā)酵50.5 h時(shí)總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L，較起始發(fā)酵PHA產(chǎn)量高83.90%。

圖8 中試放大發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)曲線Fig. 8 Monitoring curves of pilot scale-up fermentation process

圖9 5 kL中試放大試驗(yàn)菌體生長(zhǎng)及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 9 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 5 kL bioreactor pilot test

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為糖蜜添加量33.2 g/L、尿素添加量2.5 g/L、硫酸銨添加量2.2 g/L。在此優(yōu)化條件下，PHA產(chǎn)量為3.12 g/L。采用2 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化并控制補(bǔ)料后進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)得到總產(chǎn)量達(dá)到67.36 g/L，較優(yōu)化前產(chǎn)量增長(zhǎng)了142.13%。5 kL中試放大發(fā)酵試驗(yàn)得到發(fā)酵50.5 h總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L，較起始發(fā)酵PHA產(chǎn)量高83.90%。結(jié)果表明，該工藝優(yōu)化可以大幅度提升PHA產(chǎn)量，可直接應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)。該工藝優(yōu)化結(jié)果有效提升了PHA產(chǎn)量，優(yōu)化生產(chǎn)強(qiáng)度，大幅降低單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠條件。