新型生物反應器對濃香型酒醅微生物群落及理化指標的影響

莫玉婷，袁思棋，周 帥，稅梁楊，楊明永，劉 君，楊周林，范宏筠*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.瀘州國之榮耀酒業(yè)有限公司，四川 瀘州 646000；3.瀘州老窖集團有限責任公司，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000）

據(jù)國家統(tǒng)計局和中國酒業(yè)協(xié)會的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示：2022年全國白酒產(chǎn)量為671.2萬kL，其中上半年濃香型白酒產(chǎn)量375.1萬kL，占白酒總產(chǎn)量55.88%。濃香型白酒釀造原料為單糧或多糧，以泥窖作為發(fā)酵容器，在微氧或無氧的條件下厭氧菌或兼性厭氧菌將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化成乙醇和風味物質(zhì)，形成具有獨特風味的白酒[1-2]。濃香型白酒窖池發(fā)酵過程中絕對厭氧或微氧狀態(tài)促進乙醇和風味物質(zhì)的生成和轉(zhuǎn)化，從而要求窖池具有良好的密封性，即濃香型白酒窖池的封窖泥質(zhì)量和生產(chǎn)過程中窖泥維護等對窖池發(fā)酵有至關(guān)重要的作用。為提升濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵窖池釀造密閉性，相繼對濃香型白酒的封窖方式進行探索和實驗。劉念等[3-4]對濃香型白酒的密封方式進行了初步研究，相繼發(fā)明了濃香型固態(tài)發(fā)酵容器；蘇占元等[5-6]探究了生物反應器和發(fā)酵窖池中酒醅理化變化和白酒產(chǎn)量和品質(zhì)，表明生物反應器在白酒釀造生產(chǎn)實踐是可行的。羅杰等[7]運用生物反應器進行濃香型白酒發(fā)酵生產(chǎn)并采取不同控溫措施對比發(fā)酵工藝白酒品質(zhì)，結(jié)果顯示相較于對照組而言，控溫窖池的窖泥和酒醅經(jīng)過發(fā)酵后出酒率和酒質(zhì)最優(yōu)。相較于傳統(tǒng)窖皮泥和塑料薄膜封窖方式而言，白酒釀造生物反應器不僅密閉性好、衛(wèi)生、提高了白酒產(chǎn)量，而且能夠有效利用土地資源，節(jié)約后續(xù)護養(yǎng)資金和人工成本，進一步推動了生產(chǎn)機械化[8]。

酒醅是白酒釀造的物質(zhì)載體，是白酒釀造過程生化反應、物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換、代謝產(chǎn)酒產(chǎn)香等轉(zhuǎn)化介質(zhì)，即酒醅質(zhì)量與白酒品質(zhì)密切相關(guān)[9-10]。黃水是酒醅發(fā)酵的副產(chǎn)物，其不僅富含醇、酸、醛、酯等呈香呈味物質(zhì)，還含有大量有益微生物、糖類物質(zhì)、含氮化合物以及少量的單寧、色素等有機物[11]。隨著對黃水的不斷研究，黃水在白酒釀造中具有不可替代的價值，將其逐漸運用于白酒釀造和窖池養(yǎng)護過程，促使黃水重復應用。

高通量測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛運用到白酒釀造的微生物群落結(jié)構(gòu)分析[12-13]，有利于對白酒酒醅在發(fā)酵過程中微生物群落組成及群落演替研究。本研究以新型生物反應容器和傳統(tǒng)窖池為研究對象，探索傳統(tǒng)窖池生產(chǎn)工藝（對照組）、新型生物反應器生產(chǎn)工藝（實驗組I），以及在此基礎上優(yōu)化后的白酒新型生物反應器生產(chǎn)工藝（實驗組II）對發(fā)酵酒醅中微生物的影響，聯(lián)合酒醅理化指標和微生物指標，運用高通量測序技術(shù)分析酒醅發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和群落動態(tài)變化規(guī)律，探討新型生物反應器優(yōu)化工藝的生產(chǎn)實踐可行性；同時，利用冗余分析（redundancy analysis，RDA）技術(shù)綜合分析理化因子與微生物生長演替的相關(guān)性，以期在生物反應器基礎優(yōu)化生產(chǎn)工藝而提升酒醅發(fā)酵狀態(tài)，進而為新型生物反應器在白酒釀造生產(chǎn)過程中應用提供理論指導，進一步推動白酒企業(yè)機械化、自動化生產(chǎn)，提高白酒產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅：四川省瀘州市某酒廠。選用9口窖齡和出酒率基本一致的窖池用于3組研究實驗中，每組工藝設置3口平行組且做3次重復試驗，共取54個樣品用于理化與微生物檢測。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.RSoil DNA Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；次甲基蘭、酚酞、鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004B 電子天平：上海市安亭電子儀器廠；101-E 電熱鼓風干燥箱：北京市永光醫(yī)療儀器有限公司；WST-411數(shù)顯溫度計：上海博取儀器有限公司；GeneAmp9700R型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI 有限公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序儀：美國Illumina公司；NanoDrop2000 DNA濃度測定儀：美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與保存

取樣方法參照五點取樣法分別對出、入窖酒醅面、上、下3層分別取樣并置于無菌取樣袋中立即密封混合均勻。將混勻后酒醅樣品平均分成2 份裝入無菌袋并冷藏，一份用于理化實驗分析（4 ℃保存），一份用于高通量測序（-20 ℃保存）。樣品根據(jù)分組和層面進行編號，樣品Ⅰ（入窖：C1、C2、C3；出窖：C_1、C_2、C_3），樣品Ⅱ（入窖：N1、N2、N3；出窖：N_1、N_2、N_3），樣品Ⅲ（入窖：S1、S2、S3；出窖：S_1、S_2、S_3）。羅馬數(shù)字I、II、III分別代表傳統(tǒng)窖池生產(chǎn)工藝、新型生物反應器生產(chǎn)工藝、優(yōu)化白酒新型生物反應器生產(chǎn)工藝。新型生物反應器示意圖見圖1[4]。

圖1 新型生物反應器裝置示意圖Fig. 1 Diagram of new bioreactor device

對照組窖池為傳統(tǒng)黃泥＋窖皮封窖工藝；實驗組I為新型生物反器封窖工藝；實驗組II根據(jù)實驗I裝置經(jīng)過改造優(yōu)化后形成具有黃水處理和控溫、保溫設施的新型生物反應器。3組工藝的發(fā)酵時間均為60 d，冬季頂溫為32～35 ℃。

1.3.2 酒醅理化指標測定

酒醅溫度測定：使用數(shù)顯溫度計對窖池和容器內(nèi)發(fā)酵酒醅實時測溫；水分含量：參照國標GB 5009.3—2016《食品中水分含量的測定》中的第一法直接干燥法進行測定；酸度、淀粉含量、還原糖含量的測定：參照《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[1]。酸度測定：采用氫氧化鈉滴定法；淀粉含量測定：采用酸水解法；還原糖含量的測定：采用斐林試劑滴定法。

1.3.3 樣品總DNA提取

本實驗采用E.Z.N.A.RSoil DNA Kit DNA 抽提試劑盒提取樣品中的總DNA，提取步驟參考試劑盒說明方法，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，并用NanoDrop 2000檢測DNA 濃度和純度。

1.3.4 PCR擴增

細菌采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對V3-V4可變區(qū)進行PCR 擴增，真菌采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增ITS1區(qū)。

細菌PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，35 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），再72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，10 ℃保存直至反應結(jié)束；真菌PCR擴增條件參照衛(wèi)春會等[14]實驗方法。

PCR擴增體系：上、下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，5×FastPfu緩沖液吸取4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）取2 μL，F(xiàn)ast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模版DNA 10 ng，添加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。

1.3.5 高通量測序

質(zhì)檢合格的PCR擴增樣品送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進行高通量測序和生物信息學分析。生物公司返回測序數(shù)據(jù)后，使用Fastp（version 0.19.6）軟件對雙端原始測序序列進行質(zhì)控，F(xiàn)LASH（version 1.2.11）軟件進行拼接，過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，去除含N堿基的reads，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列。然后，使用Qiime2流程中的Deblur插件對質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化序列進行降噪處理后得到擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）。物種分類學分析基于Sliva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫（v138），通過Qiime2中的Naivebayes分類器，置信度閾值為0.7，對ASVs進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

含高通量測序數(shù)據(jù)于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的多樣性云分析平臺進行統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)可視化。Alpha多樣性分析Chao1、香農(nóng)（Shannon）等指數(shù)運用Mothur軟件計算，Wilxocon秩和檢驗進行α-多樣性的組間差異分析。使用RDA技術(shù)來反映酒醅理化指標與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。酒醅理化指標則是運用IBM SPSS Statistics 27.0和Origin 2021進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標分析

2.1.1 不同生產(chǎn)工藝條件下酒醅溫度的變化

3種不同生產(chǎn)工藝條件下，酒醅溫度的變化見圖2。由圖2可知，發(fā)酵溫度整體呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，符合白酒釀造生產(chǎn)溫度變化趨勢。3種生產(chǎn)工藝入窖酒醅溫度范圍在20.0～23.9 ℃，實驗II入窖溫度較高（23.9 ℃）。在0～30 d發(fā)酵過程中，窖池內(nèi)發(fā)酵溫度均呈現(xiàn)上升趨勢，其中實驗組II溫度上升幅度大。發(fā)酵時間達到15 d時，實驗組I窖池和對照組窖池溫度上升幅度放緩，直到27～28 d，酒醅溫度上升到最高，分別為33.0 ℃和33.2 ℃，后緩慢降溫。但是，實驗組II酒醅溫度15 d后繼續(xù)上升，到第30天達到頂溫35.5 ℃，后緩慢回落，直至第60天溫度回落至30.8 ℃。實驗組II在第35天經(jīng)過生物反應器中控溫裝置調(diào)控處理后，溫度呈現(xiàn)小幅度上升趨勢，且該工藝封窖下保持適宜溫度時間更長。結(jié)果表明，對照組和實驗組在發(fā)酵周期內(nèi)，溫度變化趨勢基本一致，但是優(yōu)化新型生物反應器生產(chǎn)工藝的保溫效果更好。

圖2 酒醅溫度在三種不同生產(chǎn)工藝條件下的變化Fig. 2 Changes of temperature of fermented grains under 3 different production process conditions

2.1.2 不同生產(chǎn)工藝條件下酒醅理化指標的變化

將出、入窖酒醅樣品進行理化指標分析，結(jié)果見圖3。水分含量是釀酒生產(chǎn)活動的必須條件之一，且濃香型入窖酒醅水分含量合適范圍為52%～56%[1]。由圖3a可知，3組入窖酒醅水分含量為53.2%～55.8%，出窖酒醅水分含量為58.5%～62.3%。從整體上看，出窖酒醅水分含量均高于入窖酒醅，且增長了約5.3%～6.5%。3種不同生產(chǎn)工藝中，實驗組II出窖酒醅下層水分含量（62.3%）比對照組（60.0%）、實驗組I（60.9%）稍高，其中，水分含量下層（62.3%）＞上層（60.1%）＞面層（59.6%），實驗組II下層出窖水分含量最高，達到62.3%，說明實驗組II封窖模式下，密封性效果最好。

圖3 酒醅水分（a）、酸度（b）、淀粉（c）、還原糖（d）含量在三種不同生產(chǎn)工藝條件下的變化Fig. 3 Changes of moisture (a), acidity (b), starch (c) and reducing sugar (d) contents of fermented grains under 3 different production process conditions

在適當?shù)乃岫确秶鷥?nèi)，酸度增長對抑制雜菌生長和糊化作用起著積極影響。由圖3b可知，酒醅酸度隨發(fā)酵時間延長而顯著增大，且出窖酒醅下層樣品酸度值比面層、上層更大，這可能是下層醅長期與黃水浸泡的因素引起酸度較高。出窖酒醅酸度為2.28～4.24 mmol/10 g，對照組與實驗組II面層、下層酸度分別為2.28 mmol/10 g、3.39 mmol/10 g和3.81 mmol/10 g、4.24 mmol/10 g，兩組釀造工藝存在顯著差異（P＜0.05），然而，實驗組II中下層出窖醅S_3的酸度高達4.24 mmol/10 g，可能是采用黃水控溫和保溫裝置后，持續(xù)穩(wěn)定的溫度和豐富的營養(yǎng)成分利于微生物生長和代謝，促進濃香型白酒風味物質(zhì)生成。

淀粉與還原糖在白酒釀造中為微生物提供營養(yǎng)成分和發(fā)酵能量，入窖淀粉含量應在16%～22%[1]。由圖3c和圖3d可知，酒醅淀粉與還原糖含量隨發(fā)酵而呈現(xiàn)下降趨勢，且各層酒醅淀粉含量均大幅度降低且下層消耗量最多，對照組與實驗組II下層酒醅淀粉含量由18.76%和20.65%分別下降至10.72%、9.36%，兩者差異顯著（P＜0.05）。由圖3d可知，還原糖含量由1.76%～2.06%降至0.09%～0.27%，其中，實驗組II各層淀粉消耗量均比其余兩組消耗多，對照組、實驗組I上層出窖醅還原糖分別為0.23%、0.31%，而實驗組II還原糖由1.93%降至0.09%，三組生產(chǎn)工藝還原糖含量差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，實驗組II生產(chǎn)工藝在保溫裝置的作用下，微生物代謝旺盛，持續(xù)利用淀粉類物質(zhì)和可發(fā)酵性糖，從而一定程度上降低了殘余糖類，對濃香型白酒酒醅作用效果最佳。

2.2 酒醅微生物α-多樣性指數(shù)分析

采用降噪后的樣本擴增子序列變體（ASV）序列進行酒醅微生物α-多樣性分析，酒醅樣品中細菌和真菌微生物的α-多樣性分析結(jié)果分別見表1和表2。細菌測序共得到有效序列790 608條；真菌測序共得到有效序列1 234 842條。ASV數(shù)是樣本擴增子序列數(shù)；Sob指數(shù)和Chao1指數(shù)均反映群落豐富度；香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)表示群落多樣性反映譜系多樣性[15]，且Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)含義相反，Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。

表1 酒醅細菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of bacteria of fermented grains

表2 酒醅真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of fungi of fermented grains

由表1可知，所有樣本覆蓋率均達到99.9%以上，說明測序結(jié)果可以全面準確地反映物種信息。整體來看，酒醅發(fā)酵過程中細菌菌群入窖樣品的豐富度和多樣性均高于出窖樣品；對照組、實驗組II的出窖酒醅真菌群落數(shù)略高于入窖酒醅，實驗組I出窖酒醅相較入窖酒醅菌落數(shù)呈下降趨勢。結(jié)果表明，隨著酒醅發(fā)酵的進行，微生物生長和代謝，以及溫度、酸度等理化指標的變化而影響酒醅中微生物群落多樣性，從而利于釀酒的微生物生長。

由表1可知，物種豐富度和多樣性隨發(fā)酵進行呈下降趨勢，3組入窖酒醅的細菌群落豐富度（Sob指數(shù)、Chao1指數(shù)）和細菌群落多樣性（Shannon指數(shù)）整體上均高于出窖酒醅樣品，說明入窖酒醅微生物豐度和多樣性高于出窖酒醅，推測可能是由于發(fā)酵前期營養(yǎng)物質(zhì)充分且入窖微生物主要來源于大曲和窖池，隨著發(fā)酵后期氧氣和底物的減少以及環(huán)境變化，不適應發(fā)酵環(huán)境微生物被淘汰，出窖酒醅多樣性及豐度隨之降低。其中對照組入窖酒醅的上、下層微生物物種豐富度最大，發(fā)酵結(jié)束后出窖醅最大豐富度為面層，可能是隨著發(fā)酵時間的延長，實驗組面層酒醅原料大量被利用，形成風味化學物質(zhì)，部分微生物生長受到抑制；實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ入窖酒醅面、上兩層物種豐富度和多樣性最高，出窖醅則存在差異，其中，實驗組Ⅰ物種豐度以面層和下層較高，實驗組Ⅱ物種豐度則以上、下層較為突出，說明優(yōu)化后的白酒新型生物反應器可使上、下層的溫度更有利于微生物生存。各層不適應發(fā)酵環(huán)境的細菌群落不斷減少，3組樣品出窖酒醅微生物豐富度和多樣性則是實驗組Ⅱ＞對照組＞實驗組Ⅰ。

由表2可知，對照組出窖酒醅的ASV數(shù)增加，面層出窖酒醅多樣性指數(shù)降低，上、下層出窖酒醅多樣性則是升高；實驗組Ⅰ上、下層入窖酒醅多樣性高于出窖酒醅，而面層物種多樣性發(fā)酵后增加；實驗組Ⅱ各層出窖酒醅多樣性均高于入窖酒醅。Simpson 指數(shù)越小，多樣性越大，對照組、實驗組Ⅱ總體上顯示出窖各層酒醅樣品真菌群落多樣性大于入窖，說明發(fā)酵后期微生物群落分布更均勻；實驗Ⅱ組則是隨發(fā)酵時間推移真菌群落數(shù)逐漸減少。

2.3 稀釋曲線

稀釋曲線主要利用各樣本在不同測序深度時的微生物Alpha多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性，可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度和多樣性，亦可證明樣本的測序數(shù)量是否合理。多樣性指數(shù)Sob反映實際觀測到的物種數(shù)，以此構(gòu)建稀釋曲線見圖4。

圖4 基于Sob多樣性指數(shù)構(gòu)建細菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig. 4 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) based on Sob diversity index

由圖4可知，對照組和實驗組的稀釋曲線隨著序列數(shù)的增加趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理。

2.4 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 酒醅發(fā)酵過程中細菌群落組成分析

根據(jù)降噪得到的ASV在門分類水平的物種分類信息檢出酒醅細菌構(gòu)成有33門、93綱、227目、374科、717屬。不同釀造工藝中發(fā)酵前后對照組和實驗組酒醅樣品細菌的相對豐度，選取樣品在門、屬水平上相對豐度≥1%（相對豐度＜1%為others）ASV生成相對豐度堆積柱狀圖分別見圖5和圖6。

圖5 基于門水平酒醅發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 5 Bacterial community structure of fermented grains during fermentation process based on phylum level

圖6 基于屬水平酒醅發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 6 Bacterial community structure of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖5可知，酒醅在發(fā)酵過程中主要的細菌有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota），整個發(fā)酵過程中厚壁菌門（Firmicutes）是豐度最高的優(yōu)勢門，并且在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為73.02%、69.65%、77.95%；變形菌門（Proteobacteria）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為20.84%、17.83%、16.42%，放線菌門（Actinobacteriota）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ組平均相對豐度分別為5.41%、8.58%、4.97%。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）在對照組、實驗組Ⅱ的相對豐度明顯高于實驗組Ⅰ，變形菌門（Proteobacteria）在對照組中略高于實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ，而放線菌門（Actinobacteriota）在實驗組Ⅰ高于對照組、實驗組Ⅱ。

通過對比3組生產(chǎn)工藝，3組的出窖酒醅中厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度明顯高于入窖酒醅，而變形菌門（Proteobacteria）則與之相反；對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ中厚壁菌門（Firmicutes）平均相對豐度分別由55.30%、58.70%、63.47%上升到90.74%、80.61%、92.44%，變形菌門（Proteobacteria）平均相對豐度分別由38.66%、29.58%、30.41%下降至6.20%、13.25%、5.07%。隨著發(fā)酵時間的延長，酒醅中細菌豐度隨時間而變化，厚壁菌門（Firmicutes）在發(fā)酵過程中整體呈大幅度上升趨勢，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度則顯著降低，雜菌減少，與宋建陽等[16]研究結(jié)果基本一致。由此可知，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是發(fā)酵過程中常見的細菌門，二者主要來源于大曲優(yōu)勢微生物，且VITAL M等[17]研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）是主要合成丁酸的潛力細菌，同時上述兩種菌富集可能是酒醅高醇、高酸的主要因素[18]。

由圖6可知，酒醅發(fā)酵過程中共檢出21個優(yōu)勢細菌屬，且各樣品細菌菌落組成相似，但豐富度存在差異。其中，優(yōu)勢細菌屬主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus），與李澤等[19]研究結(jié)果基本一致。上述5類細菌優(yōu)勢屬在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ中平均相對豐度分別達到78.80%、68.89%、82.35%；酒醅入窖發(fā)酵前后，乳桿菌屬（Lactobacillus）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由6.13%上升到90.47%，14.66%上升到80.37%，3.02%劇增到92.30%，與陳進等[20]研究結(jié)論基本一致。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，不同酒醅層的群落結(jié)構(gòu)無明顯差異，而不同發(fā)酵階段酒醅的微生物菌群差異相對較大。泛菌屬（Pantoea）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由18.17%、9.44%、14.82%均降至0；魏斯氏菌屬（Weissella）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由12.73%、18.87%、16.71%均降至0，葡萄球菌屬（Staphylococcus）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由10.08%、10.72%、20.82%降至0.01%，芽孢桿菌屬（Bacillus）在3組酒醅中平均相對豐度分別由19.83%下降到0.17%，3.69%下降到0.03%，16.97%下降到0.02%。

由此可得出，當酒醅入窖發(fā)酵后，隨著發(fā)酵時間推移和酒醅理化性質(zhì)的變化，酒醅中優(yōu)勢細菌屬相對豐度有顯著性變化，即酒醅發(fā)酵前細菌優(yōu)勢菌屬由泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）所構(gòu)成，而酒醅發(fā)酵后則由乳桿菌屬（Lactobacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）和潘多拉菌屬（Pandoraea）所取代，且酒醅發(fā)酵結(jié)束后乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢，也是酒醅發(fā)酵后豐度最高的優(yōu)勢菌屬。乳桿菌屬（Lactobacillus）微生物代謝產(chǎn)物為乳酸及乙酸等有機酸能力，代謝過程還可以這些有機酸為底物發(fā)生酯化反應生成乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質(zhì)，為白酒風味的形成提供前體物質(zhì)，提升相應酒體中風味成分[21-24]。與實驗組Ⅰ相比，對照組、實驗組Ⅱ發(fā)酵前乳桿菌屬（Lactobacillus）較少；發(fā)酵后大幅度增長，對照組、實驗組Ⅱ乳桿菌屬（Lactobacillus）多于實驗組Ⅰ，其中實驗組Ⅱ乳桿菌屬（Lactobacillus）增長最多。乳桿菌屬（Lactobacillus）是酒醅發(fā)酵中重要呈香脂肪丁酸的合成代謝主要貢獻菌[25]，其在發(fā)酵中后期大量繁殖，是由于發(fā)酵過程中微生物代謝導致還原糖分解生成乙醇和乳酸等物質(zhì)[26]，酒醅顆粒間隙中的氧氣近乎消耗殆盡，以及產(chǎn)物的抑制作用使得霉菌和酵母活性減弱，產(chǎn)酸菌開始大量生長繁殖，總酸含量快速上升。因此，乳桿菌屬（Lactobacillus）的大量生長可作為酒醅在發(fā)酵后期的標志性象征，優(yōu)化后的生物反應器在酒醅發(fā)酵過程中能起到較好封閉效果，加上其自帶的保溫、降溫裝置能夠有效控制酒醅發(fā)酵過程，有一定促進效果；隨著發(fā)酵階段推移，3組酒醅樣品中物種多樣性顯著下降，大量原始微生物被抑制、淘汰，適合生長的微生物富集成優(yōu)勢群，相對豐度得以提高[27]，其中實驗組Ⅱ相對豐富度最高，雜菌大量減少；實驗組Ⅰ相對豐度最低。

2.4.2 酒醅發(fā)酵過程中真菌群落組成分析

真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）分析共檢測出6門、23綱、51目、98科、178屬。物種相對豐度堆積圖根據(jù)物種注釋結(jié)果分別見圖7和圖8。選取樣品在門、屬水平上相對豐度≥1%的物種（相對豐度＜1%合并為others）而生成的不同工藝中發(fā)酵前后酒醅真菌的相對豐度。

圖7 基于門水平酒醅發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 7 Fungal community structure of fermented grains during fermentation process based on phylum level

圖8 基于屬水平酒醅發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 8 Fungal community structure of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖7可知，酒醅在發(fā)酵過程中檢測出優(yōu)勢真菌門3個，主要真菌為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），子囊菌門（Ascomycota）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的平均相對豐度分別為94.75%、93.69%、97.59%，占據(jù)絕對優(yōu)勢；而擔子菌門（Basidiomycota）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的平均相對豐度分別為4.91%、6.10%、2.04%。子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）主要來源于大曲微生物且是大曲在酒醅發(fā)酵中的優(yōu)勢真菌門，與李義等[28]研究結(jié)果基本一致。

所有酒醅的微生物隨著發(fā)酵時間推移，子囊菌門（Ascomycota）相對豐度增加，擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度降低。入窖酒醅開始發(fā)酵時子囊菌門（Ascomycota）比例最高，表明其能在該釀造環(huán)境條件下生長代謝，將原料中的淀粉與蛋白質(zhì)分解成葡萄糖與氨基酸。子囊菌門（Ascomycota）在整個發(fā)酵過程中是豐度最高的優(yōu)勢門，占據(jù)了酒醅發(fā)酵前后真菌絕對優(yōu)勢門的地位，高含量的子囊菌門（Ascomycota）對驅(qū)動酒醅活性微生物群落變化起重要作用[25]。擔子菌門（Basidiomycota）在發(fā)酵中相對豐度逐漸減低，原因可能為擔子菌門（Basidiomycota）是好氧性微生物，隨著發(fā)酵時間增加，氧氣含量不斷減少且養(yǎng)分不斷消耗，導致真菌含量減少[29]。

由圖8可知，酒醅樣品檢出優(yōu)勢真菌屬17個，主要優(yōu)勢真菌屬包括未分類的曲霉菌科（unclassified_f__Aspergillaceae）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），這4種真菌屬在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為70.72%、63.82%、77.47%。曲霉屬在釀造過程中能產(chǎn)生糖化酶、液化酶、蛋白酶等多種酶，降解原料，提高出酒率以及生香[30-31]。隨著發(fā)酵時間的推移，unclassified_f__Aspergillaceae在發(fā)酵前期豐度較高，在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ相對豐度分別達到41.75%、32.40%、60.84%，對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ隨發(fā)酵后相對豐度分別降低至15.52%、13.87%、22.96%，可能是unclassified_f__Aspergillaceae菌群不適應高酸、高醇、厭氧環(huán)境而生長代謝受阻礙或死亡，該實驗結(jié)果與車路萍[32]研究結(jié)果基本一致。其次，伊薩酵母屬（Issatchenkia）在對照組發(fā)酵過程中呈下降趨勢，下降了5.67%；其在實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的相對豐度上升，分別由14.72%、7.59%上升至25.34%、33.97%，與以往的研究結(jié)論相同[33]，其對酒醅的香氣形成具有重要作用[34-36]。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ發(fā)酵過程中整體呈現(xiàn)下降趨勢；哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）在3組樣品的發(fā)酵前期未檢出，但隨著發(fā)酵過程的進行而不斷增長，其在對照組相對豐度最高，達到51.56%，該菌主要存在于C_1和C_2酒醅樣品中，可能原因是面層、上層酒醅淀粉殘余量充足且氧氣含量較高利于生長，實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ分別上升至16.26%、17.60%。因此，unclassified_f__Aspergillaceae和伊薩酵母屬（Issatchenkia）為酒醅發(fā)酵中優(yōu)勢真菌，對白酒糟醅形成更多風味物質(zhì)起到積極作用。

2.5 理化指標與優(yōu)勢微生物屬相關(guān)性分析

根據(jù)獲取的ASV數(shù)據(jù)集，將不同生產(chǎn)工藝的酒醅發(fā)酵過程中的理化指標與優(yōu)勢細菌屬、真菌屬進行RDA，結(jié)果見圖9。

圖9 酒醅發(fā)酵過程中基于屬水平細菌與理化因子（a）、真菌與理化因子（b）冗余分析Fig. 9 Redundancy analysis of bacteria and physicochemical factors(a), fungi and physicochemical factors (b) of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖9a可知，水分和溫度與乳桿菌屬（Lactobacillus）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），淀粉與乳桿菌屬（Lactobacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），淀粉與芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。由圖9b可知，水分、溫度和酸度與unclassified_f__Aspergillaceae、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、unclassified_f__Metschnikowiaceae呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）呈正相關(guān)性，淀粉與unclassified_f__Aspergillaceae、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）呈正相關(guān)關(guān)系，這與湯涵嵐等[37]研究結(jié)論基本一致。通過RDA，微生物對白酒發(fā)酵產(chǎn)酒生香中起到推動作用，白酒質(zhì)量的優(yōu)劣取決于發(fā)酵中微生物的群落組成，濃香型白酒發(fā)酵過程中在理化因子的作用下，與微生物之間相互影響、相互協(xié)同或拮抗，從而影響著微生物群落的演替和組成情況。

2.6 不同生產(chǎn)工藝條件下白酒產(chǎn)量分析

對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ分別投入原料為4 200 kg、6 300 kg、6 300 kg，經(jīng)過發(fā)酵后對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ所產(chǎn)濃香型白酒產(chǎn)量分別為1 376 kg、1 704 kg、2 055 kg。實驗組Ⅱ白酒產(chǎn)量和出酒率均最高，相較于對照組和實驗組Ⅰ白酒產(chǎn)量分別多產(chǎn)679 kg、351 kg，說明優(yōu)化后白酒生物反應器對白酒產(chǎn)量和出酒率均有著顯著的提高。優(yōu)化后白酒生物反應器采用控溫和黃水結(jié)合，使得一系列產(chǎn)酒微生物獲得舒適生境和營養(yǎng)底物，大量生長繁殖，從而促進白酒產(chǎn)量的提升。

3 結(jié)論

通過研究傳統(tǒng)窖池、新型生物反應器，以及優(yōu)化后新型生物反應器進行釀酒生產(chǎn)而對比分析3種不同發(fā)酵模式下，實驗組和對照組的酒醅微生物群落和理化指標的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組II升溫效果最優(yōu)且保持適宜溫度時間更長，實驗組水分含量、淀粉及還原糖消耗量更高，實驗組II下層酒醅酸度最高（4.24 mmol/10 g）。基于高通量測序技術(shù)分析可知，3組工藝發(fā)酵過程中酒醅樣品的細菌豐富度和多樣性均顯著高于真菌，其中厚壁菌門和子囊菌門分別為豐度最高的優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢真菌門。RDA結(jié)果表明，酒醅發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化與理化因子有著顯著的相關(guān)性，水分和溫度與Lactobacillus呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），淀粉與Bacillus、Staphylococcus、Weissella呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；水分、溫度和酸度與unclassified_f__Aspergillaceae、Thermoascus、Saccharomycopsis呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與Kazachstania、Issatchenkia呈正相關(guān)性。

綜上所述，采用優(yōu)化后的白酒生物反應器封窖能夠更好的保持窖池內(nèi)密封性，從而保障微生物在相對厭氧或厭氧條件下的生存，后續(xù)發(fā)酵控制更加有利于微生物長期處于適宜的生存環(huán)境，充分利用營養(yǎng)物質(zhì)，提升糧食利用率和出酒率。優(yōu)化后白酒生物反應器在濃香型白酒釀造中實踐應用，為實際生產(chǎn)釀造濃香型白酒工藝改良以及智能化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的白酒提供理論依據(jù)和實踐支撐。