大曲中產(chǎn)酯化酶霉菌的分離篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

曹新志，鐘利明，謝 進(jìn)，張鳳婷，李書(shū)源，楊建剛

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643001；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007）

大曲中微生物種類(lèi)繁多，其中霉菌是濃香型白酒釀造中重要的產(chǎn)酯微生物之一[1-3]。微生物在濃香型白酒中通過(guò)生產(chǎn)酯化酶，將己酸（窖泥功能菌代謝）與乙醇（糟醅體系代謝）縮合生成呈主體香味的己酸乙酯[4-5]。通過(guò)篩選和利用代謝活力高的產(chǎn)酯化酶菌株進(jìn)行發(fā)酵，可以提高酒糟己酸乙酯的生成率，進(jìn)而達(dá)到增添白酒風(fēng)味、優(yōu)化白酒酒質(zhì)、縮短發(fā)酵周期的目的[6]。目前，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在對(duì)紅曲霉（Monascus）[7-10]、根霉（Rhizopus）[11-12]和生香酵母[13-15]的分離篩選，產(chǎn)酶（生酯）條件的優(yōu)化，酯化酶性質(zhì)的研究及白酒應(yīng)用上。眾多研究表明，能產(chǎn)生酯化酶的微生物包括霉菌、酵母、細(xì)菌[2]，來(lái)源不同的酯化酶其性質(zhì)也有很大差別，且催化反應(yīng)受反應(yīng)介質(zhì)和底物、產(chǎn)物的濃度等因素影響較大[16-19]。因此，探索高產(chǎn)酯化酶菌株的分離篩選及酯化酶活力的優(yōu)化，可以極大地提高酯化酶產(chǎn)量，有針對(duì)性的讓酯化酶技術(shù)更好的為濃香型白酒工業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

本研究從五糧液濃香型白酒大曲中分離、篩選產(chǎn)酯化酶活力較高的霉菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，并以酯化酶活力為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化該菌株的發(fā)酵條件，為其在提高大曲中酯化酶含量及提高濃香型白酒的優(yōu)質(zhì)率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

五糧液濃香型白酒大曲樣品：市售。

1.1.2 試劑

無(wú)水乙醇、MgSO4、FeSO4、NaCl（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；環(huán)己烷、己酸、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、K2HPO4、MnSO4（均為分析純）：上海麥克林生化有限公司；KCl（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉（分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速提取試劑盒：北京酷來(lái)搏科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：葡萄糖2 g/L，瓊脂2 g/L，淀粉20 g/L。

分離培養(yǎng)基[20]：蛋白胨10 g/L，瓊脂25 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L、25%（V/V）乳化液（按體積比1∶9將三丁酸甘油酯和聚乙烯醇混合），自然pH。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：MgSO40.5 g/L，K2HPO41 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，KCl 0.5 g/L，MnSO40.3 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨50 g/L，pH 5.5～6.5。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基[21]：麩皮10 g，玉米粉1 g，豆粕2 g，（NH4）2SO40.5 g，蒸餾水10 mL，自然pH。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ-840型超凈工作臺(tái)：蘇信環(huán)境科技有限公司；LRH-150CL恒溫培養(yǎng)箱：金城致杰實(shí)驗(yàn)儀器廠；Applied Biosystems測(cè)序儀、Applied Biosystems聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、LG4C6734電泳儀、HE-120電泳槽：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酯化酶活力菌株的分離、純化及篩選

將10 g研磨成細(xì)粉的大曲添加至100 mL無(wú)菌生理鹽水中，加入玻璃珠打散，靜置30 min。取1 mL上清液加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，配制成10-2菌懸液。依次類(lèi)推，采用生理鹽水按10倍系列梯度稀釋至10-7。依次吸取0.2 mL 10-3～10-7的梯度稀釋液，涂布于分離培養(yǎng)基平板，36 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。觀察菌落周?chē)耐该魅Υ笮。瑴y(cè)量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d），計(jì)算D/d值。選擇D/d值較大且菌落直徑較大的菌株進(jìn)行純化。將篩選菌株保藏于20%的甘油管中，置于-20 ℃冰箱中冷藏備用。

將分離菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，36 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心20 min，去沉淀，上清液即為粗酶液，測(cè)定酯化酶活力，篩選高產(chǎn)酯化酶的菌株。

1.3.2 酯化酶活力的測(cè)定

參考黃丹等[22]的方法測(cè)定酯酶活力：分別稱(chēng)取環(huán)己烷10 mL、己酸6.25 mL、乙醇3.65 mL及0.2 mL粗酶液（所有試劑每500 mL加入30 g無(wú)水硫酸鈉）于100 mL錐形瓶中，36 ℃密封進(jìn)行酯化反應(yīng)24 h，取0.5 mL上清液加入5 mL水，兩滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH滴定至終點(diǎn)。酶活力單位定義：在測(cè)定條件下每分鐘消耗1 μmol己酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位，U/mL。

1.3.3 菌種的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選菌株接種于PDA培養(yǎng)基，36 ℃條件下培養(yǎng)72 h，觀察菌落的生長(zhǎng)、顏色、表面形態(tài)、質(zhì)地、邊緣形狀和高度等，并采用顯微鏡觀察菌絲、孢子和子實(shí)體結(jié)構(gòu)的形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：選擇菌落生長(zhǎng)狀況良好且純種的平板，當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基表面但并未產(chǎn)生孢子時(shí)，直接從平板上刮取菌絲，加入適量石英砂研磨，取研磨液分別稀釋1倍、5倍和10倍。采用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA。以其為模板，采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)篩選菌株的ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22]。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增體系：T5 Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、基因組DNA 1 μL、雙蒸水（ddH2O）22 μL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及膠回收，委托成都肇科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)搜索，選取同源關(guān)系較大的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA 7軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[23]。

1.3.4 篩選菌株產(chǎn)酯化酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在1.3.1的基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法依次考察碳源（蔗糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉）及其添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、氮源（黃豆粉、蛋白胨、酵母膏、尿素）及其添加量（40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）對(duì)篩選菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響。

確定最優(yōu)碳源、氮源及其添加量后，分別考察發(fā)酵時(shí)間（3 d、5 d、7 d、9 d）、發(fā)酵溫度（30 ℃、31 ℃、32 ℃、33 ℃、34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃）對(duì)篩選菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響。

1.3.5 篩選菌株產(chǎn)酯化酶發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蔗糖添加量（A）、尿素添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）為自變量，以酯化酶活力（Y）作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 26.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），采用Design-Expert 13.0進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析，采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酯化酶活力菌種的分離及篩選

通過(guò)透明圈法初篩，共篩選得到6株透明圈較大的菌株，編號(hào)為B1～B6，計(jì)算其D/d值，并測(cè)定酯化酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6株菌株的D/d值及酯化酶活力測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of D/d value and esterase activity of 6 strains

由表2可知，6株菌株均具有產(chǎn)酯化酶的能力，其中菌株B3的D/d值較高，酯化酶活力最高，分別為1.48、5.62 U/mL，因此將其視為高產(chǎn)酯化酶活力的菌株。

2.2 菌株B3的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株B3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株B3的菌落較大、質(zhì)地疏松，呈灰白色；菌株具有足細(xì)胞，分生孢子梗極粗糙、較長(zhǎng)，可達(dá)到1.5 mm。

圖1 菌株B3的菌落（a）及菌絲（b）形態(tài)Fig. 1 Colony (a) and mycelial (b) morphology of strain B3

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于ITS基因序列構(gòu)建菌株B3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株B3與總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）（GQ342847）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌株B3的形態(tài)特征，最終鑒定菌株B3為總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）。

圖2 基于ITS基因序列菌株B3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strain B3 based on ITS gene sequence

2.3 總狀橫梗霉B3的產(chǎn)酯化酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同碳源及其添加量對(duì)酶化酶活力的影響

碳是構(gòu)成生物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物中碳架的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也為生物體提供重要的能源物質(zhì)[23]。有研究表明，微生物對(duì)碳源的利用具有選擇性[23]，因此，考察不同碳源及其添加量對(duì)菌株B3產(chǎn)酯化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同碳源及其添加量對(duì)總狀橫梗霉B3產(chǎn)酯化酶的影響Fig. 3 Effect of different carbon sources and their addition on the production of esterase by Lichtheimia ramose B3

由圖3可知，4種碳源中蔗糖作為碳源時(shí)，酯化酶活力最高，且隨著蔗糖添加量的升高，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是碳源濃度過(guò)低抑制微生物生長(zhǎng)，碳源濃度過(guò)高，導(dǎo)致碳氮比失衡，同樣抑制了菌株的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酶[24]。許春艷等[4]研究多種碳源對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖作為碳源時(shí)酶活最高，且酯化酶酶活隨著蔗糖添加量的升高呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)蔗糖添加量為20 g/L時(shí)，酯化酶活力最高，達(dá)到6.05 U/mL。因此，確定最佳碳源為蔗糖，最佳添加量為20 g/L。

2.3.2 不同氮源及其添加量對(duì)酶化酶活力的影響

氮源為微生物提供用于合成細(xì)胞所需的含氮物質(zhì)：如核酸、蛋白質(zhì)等，足夠的氮源有利于菌體的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶[25]。因此，考察不同氮源及其添加量對(duì)菌株B3產(chǎn)酯化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同氮源及其添加量對(duì)總狀橫梗霉B3產(chǎn)酯化酶的影響Fig. 4 Effect of different nitrogen sources and their additions on the production of esterase by Lichtheimia ramose B3

由圖4可知，4種氮源中尿素作為氮源時(shí)，酯化酶活力最高，且隨著尿素添加量的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是低于或高于最適碳氮比，均會(huì)抑制總狀橫梗霉產(chǎn)酯化酶活力[26]。王曉丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)，紫色紅曲霉（Monascuspurpureus）在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶活力比尿素高，這可能是因?yàn)榭偁顧M梗霉比紫色紅曲霉分解利用尿素的能力更強(qiáng)。當(dāng)尿素添加量為60 g/L時(shí)，酯化酶活力達(dá)到最高，為6.45 U/mL。因此，確定最佳尿素添加量為60 g/L。

2.3.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶化酶活力的影響

液體發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體的生成與產(chǎn)酶有著顯著的影響[27]。因此，考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株B3產(chǎn)酯化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)總狀橫梗霉B3產(chǎn)酯化酶的影響Fig. 5 Effect of different fermentation time on the production of esterase by Lichtheimia ramose B3

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。分析原因可能是，發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，橫梗霉生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)酯化酶少；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，霉菌衰老、自溶及自噬，進(jìn)而影響產(chǎn)酯酶。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，酯化酶活力最高，為6.61 U/mL，因此確定5 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。該結(jié)果與顏麗[27]研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)華根酶產(chǎn)酯化酶活力的影響結(jié)果一致。

2.3.4 不同發(fā)酵溫度對(duì)酶化酶活力的影響

溫度是影響產(chǎn)酶的重要因素之一，細(xì)胞代謝與產(chǎn)物的合成都需要酶的催化來(lái)完成，只有當(dāng)溫度適于菌體生長(zhǎng)時(shí)，催化反應(yīng)才能正常進(jìn)行[28]。因此，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株B3產(chǎn)酯化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)總狀橫梗霉B3產(chǎn)酯化酶的影響Fig. 6 Effect of different fermentation temperatures on esterase production by Lichtheimia ramose B3

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，酯化酶活力最高，為7.46 U/mL，因此，確定最佳發(fā)酵溫度為35 ℃。宮若楠[29]研究發(fā)現(xiàn)，衡水老白干大曲產(chǎn)酯化酶霉菌在發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)酯化酶活力最高；滕巍等[30]通過(guò)優(yōu)化汾酒大曲產(chǎn)酯酶霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基得到最佳發(fā)酵溫度為36 ℃，與本研究結(jié)果相近，說(shuō)明不同菌體產(chǎn)酯化酶的最適溫度略有差異。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蔗糖添加量（A）、尿素添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素，以酯化酶活力（Y）作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Benhnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert13.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到酯化酶活力（Y）對(duì)蔗糖添加量（A）、尿素添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）的多元二次回歸方程為：Y=7.64-0.054A+0.024B+0.046C-0.021D-0.091AB+0.084AC-0.001 906AD+0.006 667BC-0.04BD+0.011CD-0.11A2-0.067B2-0.081C2-0.061D2。

由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型可靠。決定系數(shù)R2=0.957 5，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.915 0，表明模型與試驗(yàn)具有較好的擬合性，試驗(yàn)誤差較小，該模型對(duì)酯化酶活力的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較高。由表4亦可知，一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AB、AC、BD及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.4.2 各因素間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖

采用Design-Expert 13.0軟件繪制蔗糖添加量與尿素添加量、蔗糖添加量與發(fā)酵時(shí)間、尿素添加量與發(fā)酵溫度間交互作用對(duì)酯化酶活力影響的響應(yīng)曲面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，響應(yīng)面呈凸形，存在最高點(diǎn)，等高線為橢圓，說(shuō)明AC、AB、BD間交互作用均比較顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖7 不同因素間交互作用對(duì)酯化酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on esterase activity

2.4.3 優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 13.0軟件對(duì)模型進(jìn)行求解，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：蔗糖添加量22.00 g/L、尿素添加量58.00 g/L、發(fā)酵時(shí)間6.08 d、發(fā)酵溫度35.20 ℃。在此條件下，酯化酶活力預(yù)測(cè)值為7.667 U/mL。為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)條件修訂為蔗糖添加量22.0 g/L、尿素添加量58.00 g/L、時(shí)間6 d、發(fā)酵溫度為35 ℃，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到酯化酶活力實(shí)際值為7.673 U/mL，試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值接近，相對(duì)誤差較小，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，模型可靠。

有研究表明，劉新宇等[31]從汾酒分離到2株紅曲霉，在固態(tài)發(fā)酵條件下測(cè)得酯化酶酶活為2.46 U/mL；黃丹等[11]從濃香型大曲中分離得到的少根根霉（Rhizopus arrhizus）產(chǎn)酯化酶酶活最高，達(dá)7.91 U/mL；侯小歌等[32]從宋河大曲復(fù)篩出地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件后，該菌株的酯化酶活力達(dá)到22.83 U/mL；劉延波等[33]在張弓老酒大曲中篩選得到一株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，酯化酶活力達(dá)到最高，為83.33 U/mL。本研究從五糧液濃香型白酒大曲中分離鑒定的總狀橫梗霉B3產(chǎn)酶能力處于中等水平，可進(jìn)一步研究以提高其產(chǎn)酯化酶活力。

3 結(jié)論

從五糧液濃香型白酒大曲中篩選得到一株高產(chǎn)酯化酶的菌株B3，通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌株為總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）。通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到總狀橫梗霉B3的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基及條件為蔗糖添加量22 g/L、尿素添加量58 g/L、時(shí)間6 d、發(fā)酵溫度為35 ℃，在此條件下，酯化酶活力可達(dá)7.67 U/mL，是優(yōu)化前（5.62 U/mL）的1.3倍，有利于進(jìn)一步提高濃香型白酒的品質(zhì)。