黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化活性研究

龍丹丹，葉淑紅，燕欣悅，王琛郴，崔艷平，張 彧*

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

微生物多糖是細(xì)菌[1]、真菌[2]、酵母菌等微生物在生長和代謝過程中產(chǎn)生的多糖聚合物，也稱內(nèi)生菌多糖，對(duì)自身具有保護(hù)作用。內(nèi)生菌多糖根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)的位置，可分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖[3]和胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）。其中，內(nèi)生菌胞外多糖[4]是在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁[5]外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物。與胞內(nèi)多糖相比，胞外多糖在組成和結(jié)構(gòu)上有很大差異，并且具有不同的功能特性。因此內(nèi)生菌胞外多糖產(chǎn)量的提高和功能的探索讓其具有較高的研究價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用前景。

近年來，花椒被公認(rèn)為是研究生物活性化合物的很有吸引力的材料，包括酰胺、揮發(fā)油、生物堿和多糖類化合物[6]。尤其多糖類化合物顯示出顯著的藥理活性。多糖具有提高免疫力、抗病毒及抗癌、降血糖[7]等重要作用。因此它引起了營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域研究人員的關(guān)注?；谀承﹥?nèi)生菌能產(chǎn)生和其共生植物相同或相似生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)，近年來對(duì)藥用植物內(nèi)生菌的研究十分活躍。利用內(nèi)生菌，實(shí)現(xiàn)花椒多糖的微生物發(fā)酵體外培養(yǎng)，則可使花椒多糖的工業(yè)化生產(chǎn)不受植物資源的限制，并可防止花椒資源的日益短缺[8]。

生物體在新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生自由基[9]。國內(nèi)外關(guān)于微生物胞外多糖的抗氧化性能的報(bào)道較多。HU X等[10]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌Talaromyces purpureogenus的胞外多糖具有良好抗氧化性；蔣光陽等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖對(duì)1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基和羥自由基均具有一定的清除能力；王艷等[12]從發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）TG4-1-1分離的EPS具有作為天然抗氧化劑或功能性食品添加劑的巨大潛力。目前，胞外多糖的研究大多集中在乳酸菌[13]上，但其產(chǎn)糖量相對(duì)較低，極大地限制了其應(yīng)用和發(fā)展[14]。假單胞菌是自然界廣泛存在的微生物菌群，黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）是第四類病原微生物[15]，通常不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病的微生物。此外研究表明，大多數(shù)假單胞菌都能夠產(chǎn)生胞外多糖，但目前有關(guān)于黃褐假單胞菌產(chǎn)EPS的研究較少。

前期試驗(yàn)基于對(duì)從花椒葉中自主分離、篩選和鑒定的一株菌株黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）Y11的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠產(chǎn)生胞外多糖，本研究探究了該菌的最佳產(chǎn)胞外多糖條件以及胞外多糖的抗氧化性能，旨在為胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)、以及花椒內(nèi)生菌代謝物的進(jìn)一步開發(fā)及利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）Y11：由大連工業(yè)大學(xué)東山采摘的花椒葉中經(jīng)自主篩選得到的內(nèi)生菌株。

1.1.2 試劑

果糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；木糖（分析純）：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO41 g/L，MnSO40.5 g/L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SHP-150型生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；島津UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；ZHWY-211B型恒溫冷凍搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

從固體培養(yǎng)基中挑取菌株Y11，接種至發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，作為種子液。并將種子液OD600nm值調(diào)至1.00±0.05后以4%（V/V）的接種量接種到裝液量100 mL/250 mL的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min條件下發(fā)酵72 h。

1.3.2 多糖含量的測定

多糖含量在李慧穎[16]報(bào)道的苯酚硫酸法基礎(chǔ)上進(jìn)行一定修改后測定。稱取無水葡萄糖粉末10 mg，去離子水稀釋定容至10 mL，即為1 mg/mL。使用去離子水將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL。取上述不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL濃硫酸，搖勻靜置30 min，于波長490 nm處測定吸光度值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為x軸，吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.11x+0.002 3，R2=0.999 5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的多糖含量。

1.3.3 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及其產(chǎn)胞外多糖曲線繪制

按照1.3.1的方法制備黃褐假單胞菌Y11種子液，向發(fā)酵液培養(yǎng)基中注入4%接種量的種子液，28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，每隔4 h測定OD600nm值，以去離子水為空白對(duì)照。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長曲線。黃褐假單胞菌Y11胞外多糖產(chǎn)量按照1.3.2每隔24 h進(jìn)行測定。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，胞外多糖產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制該菌株的胞外多糖產(chǎn)量曲線。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.1.3發(fā)酵液體培養(yǎng)基及1.3.1發(fā)酵液制備為基礎(chǔ)條件，改變單一變量，分別考察碳源（葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖）和碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、氮源（大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、硫酸銨、酵母抽提物）及氮源添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、無機(jī)鹽（磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀）及無機(jī)鹽添加量（2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、轉(zhuǎn)速（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）、發(fā)酵溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對(duì)黃褐假單胞菌Y11胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

采用Placket-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)檢驗(yàn)篩選顯著影響因素。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 13軟件，考察不同碳源添加量、氮源添加量、無機(jī)鹽添加量、pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵速度、發(fā)酵溫度、接種量8個(gè)因素對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響，PB試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 黃褐假單胞菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化Placket-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Placket-Burman experiments for fermentation conditions optimization of extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)胞外多糖產(chǎn)量具有顯著性影響的因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

1.3.7 胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 13軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)3個(gè)顯著因素：麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C）設(shè)計(jì)3因素3水平的測試組合，以研究因素變化對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響，Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.8 胞外多糖抗氧化性評(píng)價(jià)

（1）DPPH自由基清除率測定

參照WANG Q F等[17]的試驗(yàn)方法稍作修改。將2 mL DPPH-乙醇溶液（4×10-3mol/L）與2 mL測試的胞外多糖或不同質(zhì)量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的抗壞血酸在試管中混合。將混合物避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測量混合物的吸光度值。按公式（1）中計(jì)算DPPH自由基清除率。

（2）ABTS自由基清除率測定

參照WANG W N等[18]的試驗(yàn)方法稍作修改。將等體積的7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8混合并在黑暗中放置12 h。將混合物用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。將不同質(zhì)量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的樣品（0.2 mL）加入0.8 mL ABTS溶液中，37 ℃避光振蕩15 min，在波長734 nm處測量吸光度值。按式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率。

（3）羥自由基自由基清除率測定

參照HAO L M等[19]的試驗(yàn)方法稍作修改。首先將1 mL不同質(zhì)量濃度（0、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5 mg/mL）的胞外多糖或抗壞血酸加入10 mL試管中，然后加入1 mL FeSO4（9×10-3mol/L）轉(zhuǎn)移至溶液中混勻；之后加入1 mL H2O2（8.8×10-3mol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（9×10-3mol/L）并充分混合。然后將混合物置于37 ℃水浴1 h。以蒸餾水為空白，在波長510 nm處測量混合物的吸光度值。按式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

（4）超氧陰離子自由基清除率測定

參照文獻(xiàn)[20]的方法取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）5 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，加入4 mL不同質(zhì)量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的胞外多糖，于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，然后在25 ℃水浴中加入3 mmol/L預(yù)熱20 min的鄰苯三酚溶液1 mL，混勻，在25 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，加10 mol/L HCl 1 mL終止反應(yīng)，測定波長320 nm處的吸光度值，空白對(duì)照組用等體積蒸餾水代替樣品。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣品，取平均值。按式（4）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。采用SPSS26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖，Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 13軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及其產(chǎn)胞外多糖曲線

黃褐假單胞菌Y11生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線見圖1。

圖1 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線Fig. 1 Growth curve and extracellular polysaccharide production curve of Pseudomonas flavus Y11

由圖1可知，黃褐假單胞菌Y11的生長和產(chǎn)EPS是同步的，屬于同步合成型，也叫生長偶聯(lián)型。在前36 h菌株繁殖迅速，曲線呈快速增長，為對(duì)數(shù)生長期；在36 h時(shí)OD600nm值基本達(dá)到最高點(diǎn)，36 h時(shí)后菌株穩(wěn)定繁殖，進(jìn)入穩(wěn)定期。所以在活化菌株時(shí)，搖床培養(yǎng)36 h為最佳時(shí)間。EPS產(chǎn)量在發(fā)酵72 h時(shí)達(dá)到最大值（1.23 g/L），之后由于菌株進(jìn)入衰亡期，EPS產(chǎn)量下降。因此應(yīng)通過優(yōu)化發(fā)酵條件，補(bǔ)充營養(yǎng)底物，促進(jìn)細(xì)菌生長，以產(chǎn)生更多的胞外多糖[22]。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 碳源對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

考察不同碳源種類及最佳碳源添加量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 碳源種類（A）及麥芽糖添加量（B）對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 2 Effect of carbon source types (A) and maltose addition (B)on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖2A可知，根據(jù)所選取的六種碳源對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)糖能力的影響來看，當(dāng)麥芽糖作為碳源時(shí)，黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖能力最強(qiáng)，為2.05 g/L，產(chǎn)胞外多糖能力顯著高于其他碳源（P＜0.05），因此最佳碳源為麥芽糖。由圖2B可知，胞外多糖產(chǎn)量隨麥芽糖添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)麥芽糖添加量為40 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，為3.16 g/L；這可能是因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)基中麥芽糖添加量低于40g/L時(shí)，培養(yǎng)基中的碳源含量不足以滿足黃褐假單胞菌Y11的生長代謝需要[23]，導(dǎo)致產(chǎn)生的EPS被新陳代謝消耗掉；在添加量＞40 g/L時(shí)，胞外多糖含量降低，這可能是由于培養(yǎng)基中麥芽糖含量過多，導(dǎo)致菌體內(nèi)外滲透壓失衡，其生長受到抑制，從而影響細(xì)胞外多糖的合成，故麥芽糖最佳添加量為40g/L。

2.2.2 氮源對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

氮同樣是生物和EPS生產(chǎn)的主要營養(yǎng)素[24]，不同氮源種類及最佳氮源添加量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響見圖3。

圖3 氮源種類（A）及大豆蛋白胨添加量（B）對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source types (A) and soy peptone addition(B) on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖3A可知，不同氮源對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS含量的影響存在顯著差異（P＜0.05）。與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源明顯優(yōu)于無機(jī)氮源。當(dāng)大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，更顯著有利于黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)生胞外多糖（P＜0.05），EPS產(chǎn)量最高為3.11 g/L。由圖3B可知，胞外多糖產(chǎn)量隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的增加先顯著升高后降低（P＜0.05），這是因?yàn)楫?dāng)?shù)春窟^多，細(xì)菌沒有充足能量合成代謝產(chǎn)物。當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，為3.31 g/L，故最佳大豆蛋白胨添加量為10 g/L。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

不同無機(jī)鹽及最佳無機(jī)鹽添加量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響見圖4。

圖4 無機(jī)鹽離子種類（A）及磷酸二氫鈉添加量（B）對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 4 Effect of inorganic salt ion species (A) and sodium dihydrogen phosphate addition (B) on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖4A可知，這幾種無機(jī)鹽離子的添加對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS含量均具有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)無機(jī)鹽離子為磷酸二氫鈉時(shí)，黃褐假單胞菌Y11的EPS產(chǎn)量最高，為4.19 g/L。因此，選用磷酸二氫鈉作為培養(yǎng)基中無機(jī)鹽類。由圖4B可知，胞外多糖產(chǎn)量隨著磷酸二氫鈉質(zhì)量濃度的增加先顯著升高后降低的趨勢（P＜0.05），當(dāng)磷酸二氫鈉的添加量為8 g/L時(shí)，黃褐假單胞菌Y11EPS產(chǎn)量最高，為4.16g/L。這表明EPS的產(chǎn)生可能與磷酸鹽的添加有關(guān)，磷酸鹽是EPS分泌的重要刺激物[25]，有利于EPS的產(chǎn)生。因此最佳無機(jī)鹽及添加量為8 g/L磷酸二氫鈉。

2.2.4 初始pH對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

不同初始pH對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響見圖5。由圖5可知，胞外多糖產(chǎn)量隨著初始pH的增加先升高后降低，由此說明菌株只有在適宜pH條件下才能正常生長代謝，酶活性良好，對(duì)多糖產(chǎn)物的合成才能發(fā)揮最大作用。因此，EPS生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)初始pH為7.0，此時(shí)獲得了最高的EPS產(chǎn)量，為4.19 g/L。

圖5 初始pH對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 5 Effect of initial pH on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響見圖6。由圖6可知，EPS產(chǎn)量從發(fā)酵1～3 d呈快速生長趨勢，從3～5 d略有下降。發(fā)酵3 d時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最高水平，為4.21g/L。3 d后，細(xì)菌菌株進(jìn)入衰亡階段，因此生物量下降[26]。故最佳發(fā)酵時(shí)間為3 d。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 6 Effect of fermentation time on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

2.2.6 轉(zhuǎn)速對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響見圖7。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 7 Effect of rotational speed on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

一般來說，搖瓶發(fā)酵時(shí)，轉(zhuǎn)速越高，溶氧越多，越適合菌種培養(yǎng)和發(fā)酵。但研究表明，速度高時(shí)溶解氧不一定高。由圖7可知，在轉(zhuǎn)速120～160 r/min范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速越高，EPS產(chǎn)量越大；轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，黃褐假單胞菌Y11的EPS產(chǎn)量最高，為4.23 g/L；轉(zhuǎn)速為160～200 r/min時(shí)開始下降，這與文獻(xiàn)[27]的研究結(jié)果一致，故最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.2.7 發(fā)酵溫度對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)黃褐假單胞菌Y11EPS產(chǎn)量的影響見圖8。由圖8可知，在20～36 ℃的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)菌株EPS產(chǎn)量先升高后降低，在28 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量最高為4.26 g/L。溫度過高或過低影響菌株內(nèi)酶促反應(yīng)速率的變化，都不利于EPS的生產(chǎn)，故最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 8 Effect of fermentation temperature on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae Y11

2.2.8 接種量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)EPS的影響

接種量的多少會(huì)影響微生物發(fā)酵產(chǎn)物的合成，不同接種量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響結(jié)果見圖9。由圖9可知，相同發(fā)酵時(shí)間下，隨著接種量的增加，黃褐假單胞菌Y11的EPS產(chǎn)量先升高后降低，且接種量為4%時(shí)EPS產(chǎn)量最高，為4.27 g/L，接種量超過4%后開始下降，可能是因?yàn)榻臃N量過多引起細(xì)菌之間的競爭，影響了EPS的合成和積累[28]。故最佳接種量為4%。

圖9 接種量對(duì)黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 9 Effect of inoculum on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae Y11

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3和表4可知，模型變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=6.23%＜10%，R2（0.987 5）與調(diào)整后的R2adj（0.954 3）之差＜0.1，表明該模型具有較強(qiáng)的優(yōu)化信號(hào)和適用性較好[29]。模型P=0.008 9＜0.05，說明回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型擬合良好。經(jīng)方差分析得出的多元回歸方程為：Y=2.98+0.6275A+0.390 8B+0.329 2C+0.139 2D+0.077 5E-0.030 8F+0.009 2G+0.040 8H

由表3可知，第4組可獲得最高的胞外多糖產(chǎn)量，為4.27 g/L。其中，麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C），這三種因素對(duì)EPS產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05），因此選擇這三個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其他因素保持在單因素法測定的最佳水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

為了逼近麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C）的響應(yīng)中心點(diǎn)，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 13設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the streepest climbing tests

由表5可知，在試驗(yàn)號(hào)2的培養(yǎng)條件下，胞外多糖產(chǎn)量最高，可達(dá)4.25 g/L。因此選擇麥芽糖40 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、磷酸二氫鈉8 g/L作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素法和Plackett-Burman設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，以麥芽糖（A）、大豆蛋白胨（B）和磷酸二氫鈉（C）添加量為考察因素，以胞外多糖產(chǎn)量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，優(yōu)化3個(gè)變量的最佳添加量及其交互作用，結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表6 黃褐假單胞菌產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface experiments for culture conditions optimization of extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface test results

采用Design-Expert 13軟件對(duì)表6試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，結(jié)果表明，EPS產(chǎn)量的預(yù)測產(chǎn)量Y可由以下二階多項(xiàng)式方程求得：Y=4.44+1.01A+0.267 5B+0.155 0C+0.177 5AB+0.042 5AC-0.057 5BC-1.14A2-0.741 3B2-0.341 2C2

由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），這表明模型方程足以預(yù)測任意變量組合的EPS產(chǎn)量。模型的決定系數(shù)R2為0.988 1，表明98.81%的響應(yīng)變異性可以被模型解釋。此外，預(yù)測值與實(shí)際值之間的高度相似性也反映了響應(yīng)面試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和適用性，可用于獲得優(yōu)化的最大EPS產(chǎn)量。由表6可知，一次項(xiàng)A、B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.6 最佳工藝驗(yàn)證

通過對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到最佳發(fā)酵工藝為麥芽糖添加量44.15 g/L、大豆蛋白胨濃度11.32 g/L、磷酸二氫鈉7.80 g/L。結(jié)合Plackett-Burman聯(lián)合BBD-RSM進(jìn)行的優(yōu)化試驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)際操作可行性，得到最佳條件為麥芽糖44 g/L、大豆蛋白胨11g/L、磷酸二氫鈉8 g/L、接種量4%、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、初始pH 7，此時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量最高為4.68 g/L，以上述條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下胞外多糖的實(shí)際值為（4.56±0.13）g/L，接近于預(yù)測值4.68 g/L。因此，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)與BBD響應(yīng)面方法相結(jié)合優(yōu)化黃褐假單胞菌合成胞外多糖的發(fā)酵條件是可靠且實(shí)用的。

2.7 黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖抗氧化性評(píng)價(jià)

不同質(zhì)量濃度的胞外多糖對(duì)4種自由基的清除活性見圖10。由圖10可知，在一定濃度范圍內(nèi)，EPS對(duì)DPPH、ABTS、OH、超氧陰離子自由基清除活性表現(xiàn)出濃度依賴性，但均低于維生素C（vitamin C，VC）。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，EPS的自由基清除率可達(dá)到最大值，EPS對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力分別為（70.83±1.80）%、（45.00±1.73）%、（65.83±1.80）%和（44.6±2.11）%，這表明EPS具有較好的自由基清除活性。

圖10 不同質(zhì)量濃度EPS對(duì)DPPH（A）、ABTS（B）、OH（C）及超氧陰離子（D）自由基清除率的影響Fig. 10 Effect of different mass concentrations of EPS on free radical scavenging rate of DPPH (A), ABTS (B), OH (C) and superoxide anion (D)

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化了黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖條件，并研究了其胞外多糖的抗氧化性。結(jié)果表明，黃褐假單胞菌Y11產(chǎn)胞外多糖最佳發(fā)酵工藝為麥芽糖添加量44 g/L、大豆蛋白胨添加量11 g/L、磷酸二氫鈉添加量8 g/L、接種量4%、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、初始pH 7.0，此時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量最高為4.56 g/L，是優(yōu)化前的3.7倍。抗氧化性研究結(jié)果表明，EPS具有一定的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除活性，對(duì)于測定的體外活性強(qiáng)弱表現(xiàn)為VC＞EPS。本研究為黃褐假單胞菌EPS的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考，對(duì)胞外多糖的體外抗氧化活性提供了理論依據(jù)。