白酒中氨基甲酸乙酯及其前體物的控制方法

周韓玲，趙 東，郭 艷，宋廷富，李隆淼，鄭 佳，2*

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是食品在發(fā)酵或存儲過程中天然產(chǎn)生的一種2A類致癌物[1-2]，其中，飲料酒中EC含量較高[3]。加拿大、捷克和日本等國家針對蒸餾酒中EC制訂的限量標準為150 μg/L，美國規(guī)定蒸餾酒中EC的上限值為125 μg/L[3-4]。作為世界六大蒸餾酒之一，中國白酒中含有一定量的EC[5]，目前，EC已成為我國白酒走向國際化的技術(shù)壁壘之一[6]。

中國白酒香型眾多，每種香型的白酒都有其獨特的生產(chǎn)工藝和酒體風格[7]，如何在不改變釀造工藝、不影響酒體感官和不降低白酒產(chǎn)量的前提下降低EC含量，是酒企面臨的共同難題[6，8]。活性炭可用于吸附白酒中的EC，但會將酒中微量風味成分吸附過濾掉，對酒體感官影響較大[9]；白酒酒頭中醛類等低沸點香味物質(zhì)含量較高，酒企一般將酒頭回蒸或貯存另作它用[7]，“掐頭”法有助于控制成品酒中EC含量，但會降低產(chǎn)量且損失部分香氣成分[10]；王金夢等[11]將壺式二次蒸餾技術(shù)應用于酒廠中試生產(chǎn)，酒中EC去除效果較好，但是揮發(fā)性脂肪酸含量顯著降低，蒸餾后的酒體香味及豐滿度較原酒差。

氰化物是白酒中EC的一種重要前體物，釀造原料高粱中蜀黍氰苷又是白酒中氰化物的重要前體物[6，12-13]，控制酒體中氰化物及高粱中蜀黍氰苷的含量可有效降低白酒中EC含量[6]。本研究對氰化物揮發(fā)法、氰化物反應法、高粱去皮法和低氰高粱選擇法降低白酒中EC含量及前體物的效果進行了比對，并對四種方法在實際生產(chǎn)中的應用前景進行了探討，以期為白酒生產(chǎn)企業(yè)降低酒中EC含量、提高白酒品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H1高粱：產(chǎn)地為中國東北地區(qū)；H2高粱：產(chǎn)地為中國西南地區(qū)。

銅絲網(wǎng)（0.2 mm，20目）：市售。

氨基甲酸乙酯（純度99%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；D5-氨基甲酸乙酯（純度98%）、蜀黍氰苷（純度95%）：美國Sigma-Aldrich公司；氰標準溶液（質(zhì)量濃度為50 mg/L）：中國計量科學研究院；正己烷、乙酸乙酯（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醚、磷酸、氯胺T（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

7890A型氣相色譜儀、7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；ExionLC-5500型三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國AB Sciex公司；DMA 35型手持式密度計：奧地利安東帕公司；SBEQ-CG1012型固相萃取裝置：上海安譜實驗科技股份有限公司；SHB ⅢA型循環(huán)水式真空泵：杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；Milli-Q型超純水儀：美國Millipore公司；ML1602型百分之一分析天平、AE200型萬分之一分析天平：美國梅特勒-托利多公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；FSJ-Ⅱ型錘片式糧食粉粹機、JLG-Ⅲ實驗礱谷機：中儲糧成都糧食貯藏科學研究院；YM-060S型超聲波清洗機：深圳市雨盟超聲波清洗機設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 氰化物揮發(fā)法

在宜賓地區(qū)某濃香型酒廠中試車間進行試驗：窖池中取出6甑酒醅混合在一起，加上適量糧食后混勻，平均分成兩堆，一堆為實驗組糧糟，另一堆為對照組糧糟。

實驗組：向?qū)嶒灲M糧糟中加入糠殼拌勻后物料上甑，蓋上甑蓋，加大蒸汽，待甑蓋發(fā)燙且連接彎管處有酒汽冒出時關(guān)小蒸汽，1 min后完全關(guān)掉蒸汽，10 min后連接冷卻器，按正常工藝蒸酒。

對照組：向?qū)φ战M糧糟中加入糠殼拌勻，按正常工藝上甑、蒸酒。

實驗組和對照組同時蒸酒，依照濃香型白酒生產(chǎn)工藝按質(zhì)摘酒[7]，各進行3次試驗，每次各取酒頭、前段酒、后段酒500 mL，測定酒精度，按照國標GB 5009.36—2023《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》中氣相色譜法測定酒中氰化物含量后[14]，將酒樣密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯存1年，按照國標GB 5009.223—2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》方法測定EC含量[15]。

1.3.2 氰化物反應法

在宜賓地區(qū)某濃香型酒廠小試車間進行試驗：窖池中取出6甑酒醅混合在一起，加上適量糧食混勻，平均分成兩堆，一堆為實驗組糧糟，另一堆為對照組糧糟。

實驗組：向?qū)嶒灲M糧糟中加入糠殼拌勻后上甑，在上完甑后的糧糟上鋪置一層銅絲網(wǎng)，蓋上甑蓋，按正常工藝蒸酒。

對照組：向?qū)φ战M糧糟中加入糠殼拌勻，按正常工藝上甑、蒸酒。

實驗組和對照組同時蒸酒，各進行3次試驗，每次各取酒樣500 mL，測定氰化物含量，按照國標GB/T 10345—2022《白酒分析方法》對酒樣進行感官品評[16]。

1.3.3 高粱去皮法

使用實驗礱谷機分別對H1、H2高粱樣品進行去皮處理：每次碾磨量16.00 g，碾磨時間120 s，碾磨完后收集去皮后的高粱米（胚乳和胚）和高粱糠（果皮和種皮）。分別將兩種高粱、高粱米和高粱糠粉粹，過120目篩，稱取1.50 g，經(jīng)20 mL甲醇水溶液（95∶5，V/V）超聲提取1 h、8 000 r/min離心10 min后，取上清液0.4 mL，超純水稀釋3倍，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后進三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，計算去皮前籽粒、高粱米和高粱糠中蜀黍氰苷含量[17]。

1.3.4 低氰高粱選擇法

試驗在宜賓地區(qū)某酒廠小試車間進行，將4口窖池分成兩個組（實驗組和對照組），每組2口，其中實驗組以H2高粱（蜀黍氰苷含量為1.62 mg/kg）為高粱原料，對照組以H1高粱（蜀黍氰苷含量為7.26 mg/kg）為高粱原料，另四種原料（小麥、大米、玉米、糯米）相同，兩個組均按照五糧濃香型白酒生產(chǎn)工藝進行釀酒試驗，各進行6輪試驗，每口窖池的每輪白酒蒸餾出來后，取樣，測定原酒酒精度，測定氰化物含量后將酒樣密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯存360 d，測定EC含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)均重復測定3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，并采用SPSS 24.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氰化物揮發(fā)法

實驗組和對照組相應的各段酒酒精度差異較小，酒頭酒精度為75%vol，前段酒酒精度為72%vol，后段酒酒精度為65%vol。對照組和實驗組各白酒酒樣中氰化物和EC含量測定結(jié)果見表1。

表1 白酒酒樣中氰化物和氨基甲酸乙酯含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of cyanide and ethyl carbamate contents in Baijiu samples

高粱中蜀黍氰苷水解可生成氫氰酸[18]，本研究嘗試利用氫氰酸沸點低（25.7 ℃）的特點，在蒸酒過程中將其揮發(fā)掉，從而降低酒體中氰化物含量，進一步達到降低EC的目的。由表1可知，實驗組和對照組的酒頭、前段酒和后段酒中初始氰化物含量差異不顯著（P＞0.05）。酒樣于28 ℃下貯存1年后，其EC含量達到相對穩(wěn)定狀態(tài)[6]，實驗組和對照組的酒頭、前段酒和后段酒中EC含量差異不明顯（P＞0.05），說明氰化物揮發(fā)法降低白酒中氰化物和EC含量效果較差。

由表1亦可知，隨著蒸酒的進行，氰化物逐步被蒸出并進入到各段酒中，酒頭中氰化物含量略高于前段酒，前段酒中氰化物含量高于后段酒；達到相對穩(wěn)定狀態(tài)時，酒頭、前段酒和后段酒中EC含量與氰化物趨勢相似。蒸酒過程中，酒頭中氰化物的富集作用不顯著，因此，采用“掐頭”法降低濃香型白酒中氰化物和EC含量時，效果不理想。

2.2 氰化物反應法

測定實驗組和對照組酒樣中氰化物含量，并對酒樣進行感官品評，結(jié)果見表2。

表2 酒樣中氰化物含量及感官品評結(jié)果Table 2 Cyanide contents and sensory evaluation results of Baijiu samples

Cu2+可催化氰化物反應生成EC[19]，本研究嘗試在氰化物進入酒中前將其催化反應掉，從而達到降低酒體中氰化物和EC含量的目的。由表2可知，實驗組酒樣中氰化物平均含量比對照組低43.9%，差異極顯著（P＜0.01），氰化物去除效果較好，但對酒樣進行感官品評時有明顯的金屬味。

感官品評是白酒質(zhì)量評判的重要手段，品評項目包括酒體的色澤和外觀、香氣、口味、口感和風格等[16，20]，釀造工藝決定了白酒的香型，香型不同，白酒的感官品質(zhì)不同[7]；同一種香型的白酒，質(zhì)量等級不同，呈現(xiàn)出的感官也不同[21]。因此，在研究白酒中EC控制方法時，要以不改變釀造工藝、不影響酒體感官為前提，否則方法無法得到實際應用。氰化物反應法雖然去除氰化物效果較好，但將異雜味帶入酒中，嚴重影響了酒體風格，降低了產(chǎn)品質(zhì)量，且銅絲網(wǎng)的使用可能會引起糟醅中Cu2+含量升高，Cu2+濃度過高影響微生物的生長代謝，進而影響糟醅發(fā)酵，因此，氰化物反應法不適合應用于企業(yè)實際生產(chǎn)。

2.3 高粱去皮法

分別測定H1、H2高粱樣品及其碾磨后的籽粒、高粱皮中蜀黍氰苷含量，結(jié)果見表3。

表3 高粱籽粒各部位蜀黍氰苷含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of dhurrin contents in various parts of sorghum grains

由表3可知，H1高粱中蜀黍氰苷含量較高，去皮前籽粒和去皮后的高粱米中蜀黍氰苷含量分別為7.26 mg/kg、1.92 mg/kg，差異極顯著（P＜0.01），經(jīng)去皮處理后，H1高粱籽粒中蜀黍氰苷含量降低了73.6%，高粱糠中蜀黍氰苷含量高達31.09 mg/kg。H2高粱中蜀黍氰苷含量為1.62 mg/kg，經(jīng)去皮處理后，籽粒中蜀黍氰苷含量降低了87.7%。高粱中的蜀黍氰苷是白酒中氰化物的重要前體，氰化物又是EC的重要前體物，蜀黍氰苷主要存在于高粱的皮層中，由此可推測，將釀酒高粱進行去皮處理，可大幅降低蜀黍氰苷含量，進而能降低白酒中氰化物和EC含量。

大多數(shù)名優(yōu)白酒之所以都采用高粱作為主要釀造原料，除淀粉含量高、蛋白質(zhì)及脂肪含量適中、氨基酸種類全面等原因外[22]，還有一個重要原因：高粱中含有一定量的單寧，發(fā)酵過程中，單寧不僅能抑制有害微生物的生長，提高出酒率，其產(chǎn)生的衍生物丁香酸和丁香醛等香味物質(zhì)還能增加白酒的芳香風味[23]。而高粱籽粒里的單寧主要分布在皮層中[24]，進行去皮處理時也會將大部分單寧去掉，此外，高粱去皮后硬度等物理性狀發(fā)生了改變，其吸水率等也可能會隨之發(fā)生改變，因此，能否將高粱去皮法應用于實際生產(chǎn)，還需通過長時間的釀酒試驗來進行驗證。

2.4 低氰高粱選擇法

實驗組采用蜀黍氰苷含量低的H2高粱，對照組采用蜀黍氰苷含量高的H1高粱釀造白酒。測定白酒酒樣中氰化物和EC含量，結(jié)果見表4。

表4 白酒酒樣中氰化物和氨基甲酸乙酯含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of cyanide and ethyl carbamate contents in Baijiu samples

由表4可知，實驗組白酒酒樣中氰化物含量為163.3mg/kg，對照組酒樣中氰化物含量為565.0 mg/kg，實驗組酒樣中氰化物含量顯著低于對照組（P＜0.01），貯存1年后，白酒酒樣中EC含量為214.0 mg/kg，實驗組酒樣中EC含量顯著低于對照組（P＜0.01）。采用低氰高粱選擇法可降低白酒中氰化物和EC含量。

低氰高粱選擇法不改變白酒原有釀造工藝，酒體風格也不受影響。理論上，企業(yè)在收購原料時，只需針對高粱中蜀黍氰苷設定一個相對較低的值，就可達到控制白酒中氰化物和EC含量的目的，但是，在實際應用中依然存在困難：一是將蜀黍氰苷含量值設定為多少較合適，若白酒生產(chǎn)企業(yè)將此值設定過高，酒中EC含量控制效果可能不佳，若針對高粱中蜀黍氰苷設定一個極低值，則可能影響原料的選用，收購的高粱不能滿足生產(chǎn)的需求。因此，需在生產(chǎn)水平上研究出高粱中蜀黍氰苷含量與白酒中EC含量的明確的對應關(guān)系才能針對高粱設定一個合適的含氰量，而白酒生產(chǎn)工藝及其傳統(tǒng)、復雜，該項研究難度非常大。二是蜀黍氰苷在高粱中為痕量物質(zhì)，不同高粱中含量差異極大[25]，大型酒企每年高粱用量高達幾千甚至數(shù)萬噸，很難針對所有生產(chǎn)用高粱中蜀黍氰苷含量進行精準的檢測。

3 結(jié)論

EC廣泛存在于各類香型白酒中，探索白酒中EC生成機理并尋求降低方法一直是行業(yè)研究的熱點和難點。本研究對氰化物揮發(fā)法、氰化物反應法、高粱去皮法和低氰高粱選擇法降低EC及其前體物的效果和實際應用前景進行了比對和探討。氰化物揮發(fā)法效果較差；氰化物反應法將異雜味帶入到酒中，影響了酒體風格；高粱去皮法降低蜀黍氰苷效果較好，能否應用于實際生產(chǎn)還有待驗證；低氰高粱選擇法可有效降低白酒中氰化物和EC含量，既不改變釀造工藝，又不改變酒體風格，但企業(yè)將其應用于實際生產(chǎn)時還存在諸多困難。

本研究已證實低氰高粱選擇法可有效降低白酒中氰化物和EC含量，若企業(yè)能解決如何獲得大量、穩(wěn)定低氰高粱的問題，產(chǎn)品中EC含量即能得到有效控制。