基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對植物乳桿菌YP36細(xì)菌素的抑菌機(jī)制研究

王 婷，來歡歡，趙 微，3，崔美林，3，張秀紅，3*

（1.山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032；2.山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032；3.山西省微生物應(yīng)用技術(shù)工程研究中心，山西 太原 030032）

細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的蛋白類或多肽類物質(zhì)，細(xì)菌素能賦予產(chǎn)生菌生存優(yōu)勢[1-2]。大多數(shù)乳酸菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素[3]，細(xì)菌素也是益生菌篩選常用的標(biāo)準(zhǔn)之一，在食品工業(yè)中作為生物防腐劑用于食物保鮮[4]。由于大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素成分及性質(zhì)不完全相同，其抑菌機(jī)制也不盡相同，如有的細(xì)菌素與細(xì)胞膜結(jié)合，在細(xì)胞膜上聚集，形成孔洞，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄露[5]；有的細(xì)菌素的作用位點是細(xì)胞壁（它能抑制細(xì)胞壁中肽聚糖的生物合成[6]）、革蘭氏陰性細(xì)菌外膜，有的細(xì)菌素干擾脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白質(zhì)代謝[7]；有的細(xì)菌素對敏感菌的抑菌作用還與其細(xì)胞內(nèi)能量代謝及糖類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等部分相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[8]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YP36是從清香型白酒酒醅中分離的乳酸菌，其細(xì)菌素對指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有明顯抑制效果，對清香酒醅中酵母菌無抑制作用，在4～121 ℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性范圍在2.0～4.0之間，對酒醅正常發(fā)酵有重要的作用[9]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)為研究對象，高通量系統(tǒng)化解析蛋白質(zhì)組成、功能及相互作用的科學(xué)。蛋白質(zhì)是生命活動的承擔(dān)者，蛋白質(zhì)組學(xué)能夠從蛋白水平上揭示研究對象的生理狀態(tài)、病理狀態(tài)等過程的作用機(jī)制[10]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞、組織和體液中蛋白質(zhì)表達(dá)差異的分析[11]，但是利用該技術(shù)研究酒醅來源乳酸菌細(xì)菌素作用機(jī)制尚未報道。

本研究中采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（highperformance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）聯(lián)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[12]對細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2表達(dá)的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，并采用基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析對差異蛋白進(jìn)行代謝功能分析，旨在為乳酸菌在白酒釀造過程中作用機(jī)制提供新的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SL32-2、YP36（產(chǎn)細(xì)菌素）：本實驗室保存。

1.1.2 試劑

K2HPO3、KH2PO3：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甘油、溴酚藍(lán)、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素（Urea）、Tris、二硫蘇糖醇：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；NH4HCO3、三氟乙酸、EmporeTM固相萃取柱（C18，7 mm/3 mL）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；二辛可寧酸測定（bicinchoninic acid assay，BCA）定量試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；KH2PO4、KCl、HCl：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[13]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，酵母粉4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，檸檬酸二銨2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，K2HPO4·7H2O 2 g，吐溫-80 1 mL，1 000 mL。121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GI80DS型高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；ZHJH-C1112B型雙人超凈工作臺、ZXMP-R1230型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；D-37520型低速冷凍離心機(jī)、Q Exactive型質(zhì)譜、Easy nLC型色譜儀、MP Fastprep-24型勻漿儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AKTA Purifier 100型純化儀、EPS601型電泳儀：通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司；JY92-II型超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；QT-1型Votex振蕩器：上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與細(xì)菌素制備

菌株活化：將甘油保藏的乳酸菌菌株YP36接種于MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，待乳酸菌菌株YP36活化3代以后，儲存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

細(xì)菌素的制備：將菌株YP36活化后，以3%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，12 000 r/min離心10 min，將上清液通過0.22 μm的微孔濾膜過濾，所得濾液為細(xì)菌素粗品，保存在4 ℃下備用[14]。

1.3.2 細(xì)菌素處理前后發(fā)酵液樣品的制備

將活化后的植物乳桿菌SL32-2以2%（V/V）接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)4 h，以該發(fā)酵液為對照（CK）?；罨蟮闹参锶闂U菌SL32-2以2%（V/V）接種量接種于含有10%細(xì)菌素粗品的MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h的發(fā)酵液為處理組樣品（B）。將對照和處理樣品分別用緩沖液清洗3次后，液氮中處理30 min，于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

樣品采用SDT裂解液（4% SDS、100 mmol/L Tris/HCl pH 7.6、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT））提取蛋白質(zhì)[15]，然后用二辛可寧酸測定（bicinchoninic acid，BCA）法[16]進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每個樣品取適量蛋白質(zhì)采用過濾器輔助蛋白質(zhì)組制備（filter aided and proteome preparation，F(xiàn)ASP）方法[17]進(jìn)行胰蛋白酶酶解，采用C18 Cartridge對肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，肽段定量[18]。

1.3.4 HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)采集及蛋白質(zhì)定量

采用高效液相色譜（HPLC）法液相系統(tǒng)進(jìn)行樣品分離。樣品由自動進(jìn)樣器上樣到上樣柱，經(jīng)過分析柱分離，流速為300 μL/min。流動相為含0.1%甲酸的水溶液（A液）和含0.1%甲酸的84%乙腈（B液）。用95%A液平衡[19]，上樣柱為nanoViper C18色譜柱（100 μm×2 cm），分析柱為C18-A2 Thermo sclentific EASY柱（75 μm×3 cm）。樣品分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集[20]。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍為300～1 800 m/z，在200 m/z時，一級質(zhì)譜分辨率為70 000，二級質(zhì)譜分辨率為175 000[21]。

用MaxQuant 1.6.14軟件通過MS和MS/MS搜索肽段母離子及其理論碎片離子的信號來確認(rèn)該肽段及相關(guān)蛋白是否存在于樣本中，并獲得未知肽段、蛋白及翻譯后修飾信息。采用非標(biāo)記定量（label free quantification，LFQ）對鑒定蛋白進(jìn)行相對定量[22]。

1.3.5 生物信息學(xué)分析方法

用Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。對目標(biāo)蛋白質(zhì)利用基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearchtool，BLAST）2GO進(jìn)行GO（Gene ontology，http：//geneontology.org/）注釋，包括序列比對、GO條目提取、GO注釋和Inter-ProScan補(bǔ)充注釋等4個步驟；利用KAAS（KEGG automatic annotation server）軟件進(jìn)行KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）通路注釋；采用Fisher精確檢驗，比較目標(biāo)蛋白質(zhì)集合和總體蛋白質(zhì)集合中各個GO分類（或KEGG通路或Domain）的分布情況，以進(jìn)行富集分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2鑒定蛋白的分布

采用韋恩圖分析細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2鑒定蛋白分布情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知，處理前鑒定的蛋白質(zhì)共有1 999個，處理后鑒定的蛋白質(zhì)共有2 005個，其中處理前后共有蛋白質(zhì)為1 905個。

圖1 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2中鑒定蛋白韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of identified protein from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

2.2 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白分析

對細(xì)菌素處理后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白分析時，以表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞2.0（上調(diào)＞2.0倍或下調(diào)＜0.5倍）且P值＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，得到細(xì)菌素處理后上調(diào)、下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)目，同時還做了“有無”差異比較，即分析只在細(xì)菌素處理前或處理后出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖2。

圖2 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白熱圖Fig. 2 Heat map of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由圖2可知，與細(xì)菌素處理前相比，細(xì)菌素處理后顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)有59個，在細(xì)菌素處理后消失的蛋白質(zhì)有26個；有33個蛋白在細(xì)菌素處理后開始表達(dá)，顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)只有15個，這一結(jié)果表明細(xì)菌素處理后植物乳桿菌SL32-2下調(diào)和消失的蛋白數(shù)目較多，菌體整體代謝減弱。

進(jìn)一步對細(xì)菌素處理前后差異表達(dá)蛋白種類分析，結(jié)果見表1。由表1可知，在細(xì)菌素處理前CK中鑒定到的蛋白、細(xì)菌素處理后鑒定到的表達(dá)上調(diào)、下調(diào)的蛋白中以及細(xì)菌素處理后才鑒定到的蛋白中，占比最大的是酶類，分別占65.38%、40%、72.88%、33.33%，由此可知，細(xì)菌素處理后會影響到細(xì)菌整體的代謝網(wǎng)絡(luò)，而不只是簡單的細(xì)菌素成分的作用。其次是轉(zhuǎn)運蛋白，如能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解產(chǎn)生的能量將結(jié)合的氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運的寡肽ABC轉(zhuǎn)運蛋白[24]等，以及將各種糖及其衍生物進(jìn)行磷酸化然后運輸?shù)桨麅?nèi)的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）中的糖轉(zhuǎn)運蛋白[25]，表明細(xì)菌素處理后不僅影響細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流，還能影響胞外營養(yǎng)物質(zhì)到胞內(nèi)，以及胞內(nèi)各種功能蛋白的運輸。除此之外還有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、獨有蛋白和未知蛋白。

表1 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白分類Table 1 Classification of differentially expressed proteins from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

2.3 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白的GO功能分析

為了全面深入了解細(xì)菌素處理后差異蛋白在生物體中的功能、定位及參與的生物學(xué)途徑，通過GO富集分析對蛋白質(zhì)的功能分類進(jìn)行注釋。GO功能注釋主要分為3類：生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）。以P值＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對用細(xì)菌素處理前后菌株SL32-2差異表達(dá)蛋白的GO功能富集分析表明，顯著性差異表達(dá)蛋白所涉及的功能條目共有99條，其中屬于生物過程的有78條，屬于分子功能的有21條，其中BP的前20條和MF的前10條功能條目見圖3。由圖3可知，BP的前20條涉及的功能有核苷、核苷酸生物合成及代謝；糖基化合物合成、酒精、有機(jī)羥基化合物、多元醇代謝相關(guān)過程，且大多與嘧啶核苷及核苷酸生物合成和代謝相關(guān)；MF的前10條涉及的功能大多與糖類利用相關(guān)。

圖3 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白基因本體富集分析Fig. 3 Gene Ontology enrichment analysis of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

富集因子為該代謝路徑下差異蛋白數(shù)目與所有注釋到該路徑蛋白數(shù)目的比值，代表富集到目標(biāo)路徑的蛋白數(shù)占比，值越大表示富集的程度越大。在對植物乳桿菌SL32-2細(xì)菌素處理后差異表達(dá)蛋白GO分析時發(fā)現(xiàn)，5條與細(xì)胞壁代謝相關(guān)的BP條目：（GO：0016998）細(xì)胞壁大分子分解代謝過程、（GO：0006027）糖胺聚糖分解代謝過程、（GO：0009253）肽聚糖分解代謝過程、（GO：0006026）氨基聚糖分解代謝過程及（GO：0008152）代謝過程都顯著性富集到兩個相同的蛋白A0A2S3U5Q5、A0A7X1TC68。這兩個蛋白涉及的MF條目有GO：0004553水解酶活（水解O-糖基化合物）、GO：0016798水解酶活性（作用于糖苷鍵）、GO：0003824催化活性，具體見表2。

表2 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2細(xì)胞壁代謝相關(guān)蛋白基因本體富集分析Table 2 Gene Ontology enrichment analysis of cell wall metabolism related proteins from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

A0A2S3U5Q5被鑒定為溶菌酶（putative autolytic lysozyme），是細(xì)菌素處理新誘導(dǎo)表達(dá)的，可以裂解細(xì)胞壁肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵[26]，破壞細(xì)胞壁的完整性，達(dá)到抑菌目的。A0A7X1TC68糖苷水解酶（glycosyl hydrolase family 25，GH25）則是在細(xì)菌素處理后表達(dá)上調(diào)，它屬于GH25家族蛋白，具有溶菌酶活性。溶菌酶是一種抗菌酶，其本質(zhì)是一種糖苷水解酶，基于序列相似性的糖基水解酶分類系統(tǒng)已經(jīng)定義了85個不同的家族[27]，GH25僅包含一種具有已知活性的酶，該酶主要水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間的β-1,4-糖苷鍵。說明細(xì)菌素處理使乳酸菌表達(dá)更多具有溶菌酶活性的蛋白，降解原有細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁不完整，不能維持正常生長，達(dá)到抑菌的目的。

2.4 細(xì)菌素處理前后差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路分析結(jié)果

將細(xì)菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果共涉及到53段代謝通路，其中顯著性富集到KEGG途徑的有14條（P＜0.05），其富集分析結(jié)果見圖4。

圖4 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白京都基因與基因組百科全書富集分析Fig. 4 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由圖4可知，圖中橫坐標(biāo)為富集因子，縱坐標(biāo)表示富集程度排名靠前的代謝路徑。每個點的大小表示富集到該GO條目的蛋白的個數(shù)，點越大表示富集到該GO條目的蛋白越多，反之則越少[28]。顏色梯度代表lg（P值）的大小，顏色越接近紅色代表P值越小，對應(yīng)代謝通路富集度的顯著性水平越高。在富集到的14條途徑中，屬于碳代謝的有6條，即淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、檸檬酸（三羧酸）循環(huán)、磷酸肌醇代謝、果糖和甘露糖代謝，以及戊糖和葡糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化；氨基酸代謝有5條，即丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成與降解；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；核苷酸代謝1條，核酸代謝1條，跨膜途徑1條。

細(xì)菌素處理后植物乳桿菌SL32-2差異表達(dá)蛋白質(zhì)的6段代謝途徑相關(guān)酶表達(dá)受到影響，其受影響的碳代謝及嘧啶代謝途徑結(jié)果見圖5。

圖5 細(xì)菌素處理后植物乳桿菌Sl32-2差異表達(dá)蛋白受影響的碳代謝及嘧啶代謝途徑Fig. 5 Carbon metabolism and pyrimidine metabolism pathway affected by differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 after bacteriocin treatment

由圖5可知，影響最顯著的是碳源吸收階段的淀粉和蔗糖代謝，如淀粉降解需要的α-淀粉酶[EC 3.2.1.1]、麥芽糖磷酸化酶[EC 2.4.1.8]；蔗糖降解需要的蔗糖酶[EC 3.2.1.20]；以及胞外纖維二糖降解需要的纖維二糖Npi-磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7.1.205]和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶[EC 3.2.1.86]，另外還有一些糖苷酶，如糖苷水解酶家族65蛋白（A0A166KUN4，A0A0G9FBU3）、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（F9URP6，A0A0 R2GBH8、A0A151G2V8），β-葡萄糖苷酶（A0A162GFY1）細(xì)菌素處理后這些酶表達(dá)全部下調(diào)，最終導(dǎo)致D-葡萄糖的生成減少。碳源吸收階段滲透IIC成分（F9UU22）；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）糖轉(zhuǎn)運蛋白（T5JR35）顯著性下調(diào)，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖減少。還有β-磷酸葡萄糖變位酶（F9US84）下調(diào)，β-磷酸葡萄糖變位酶可將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸是二磷酸尿苷（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖的前體，而UDP-葡萄糖是多種代謝途徑的糖基供體，如細(xì)胞壁等。β-磷酸葡萄糖變位酶的下調(diào)可能影響細(xì)胞形態(tài)，抑制細(xì)菌生長[29]。

糖酵解/糖異生是糖的分解代謝/合成代謝重要階段，共檢測到9個顯著差異蛋白，其中8個均顯著下調(diào)，只有1個顯著上調(diào)。8個下調(diào)蛋白中，有1個是從纖維二糖得到葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，3個是將磷酸二糖釋放葡萄糖的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（F9URP6，A0A0R2GBH8、A0A151G2V8）；還有4個是不同底物脫氫酶或脫氫酶的組分。糖酵解是產(chǎn)能較少的生物氧化過程，脫氫酶或組分表達(dá)下調(diào)使糖酵解產(chǎn)生更少的能量，能顯著降低碳源代謝，反過來也會影響糖的異生。該階段唯一上調(diào)的是醛醇脫氫酶。細(xì)菌中有醇醛脫氫酶能使乙醇和乙醛脫氫，是一種雙功能酶，而且是乙醇厭氧發(fā)酵中的關(guān)鍵酶[30]。

三羧酸階段，糖酵解產(chǎn)物丙酮酸繼續(xù)代謝的關(guān)鍵酶，如丙酮酸脫氫酶E1成分[EC 1.2.4.1]、丙酮酸脫氫酶E2成分（二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶）[EC 2.3.1.12]和二氫硫辛酰胺脫氫酶[EC 1.8.1.4]表達(dá)也下調(diào)，導(dǎo)致進(jìn)入三羧酸循環(huán)的乙酰輔酶A的量減少，最終減少能量供應(yīng)。α-酮戊二酸脫氫酶-α-亞基的下調(diào)削弱了三羧酸循環(huán)中的不可逆的限速反應(yīng)，使整個三羧酸循環(huán)代謝下調(diào)。關(guān)于其他單糖，如果糖和甘露糖代謝也受到影響，如甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶[EC 5.3.1.8]在細(xì)菌素處理后不再表達(dá)，導(dǎo)致β-D-果糖-6磷酸的生成量減少；L-艾杜糖醇脫氫酶可將L-山梨糖醇氧化為L-果糖，該酶的下調(diào)也可導(dǎo)致L-果糖的減少；甘露醇也是細(xì)菌生長的碳源，轉(zhuǎn)移因子亞基、甘露醇-1-磷酸5-脫氫酶也都下調(diào)，導(dǎo)致甘露醇濃度下降。

差異蛋白中數(shù)量最多的是輔因子，輔因子是能與酶蛋白結(jié)合并能影響其活力的非蛋白成分，因而可影響細(xì)菌細(xì)胞中很多酶反應(yīng)（見表3）。

表3 細(xì)菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2表達(dá)的參與輔因子生物合成途徑的顯著差異蛋白Table 3 Significantly difference proteins involved in cofactor biosynthesis pathway expressed by Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由表3可知，細(xì)菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2高達(dá)14個輔因子受到影響，11個顯著下調(diào)，1個不再表達(dá)，有2個表達(dá)上調(diào)。11個顯著下調(diào)輔因子中有9個參與嘧啶代謝，嘧啶是合成細(xì)胞壁肽聚糖重要的載體，嘧啶下調(diào)直接影響細(xì)胞壁的合成，結(jié)合GO富集分析中細(xì)菌素處理后有溶菌酶上調(diào)，還有新的溶菌酶分子合成，共同有效抑制了細(xì)胞的生長。下調(diào)的輔因子中有5個參與氨基酸代謝，且全部是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，有效減弱了氨基酸之間的轉(zhuǎn)換以及通過氨基酸途徑再次抑制嘧啶代謝。二氫脂酰脫氫酶[EC 1.8.1.4]的下調(diào)則影響了細(xì)胞內(nèi)非常廣泛的代謝反應(yīng)，如丙酮酸代謝，多種（賴氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸）氨基酸代謝、乙醛酸和二羧酸的代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、部分氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）降解等。

細(xì)菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2雖然只有一條核酸代謝受影響，但是受影響蛋白數(shù)量較多，主要分布在嘧啶代謝的單磷酸尿苷（uridine monophosphate，UMP）合成途徑中，如以丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸為原料合成N-氨基甲酰-L-天冬氨酸途徑中的EC 6.3.5.5（氨甲酰磷酸合酶）和EC 2.1.3.2（天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶），以及以L-天冬氨酸為原料合成UMP途徑中的EC 2.1.3.2（天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶）、EC 3.5.2.3（二氫乳清酸酶）、EC 1.3.1.14（二氫乳清酸脫氫酶（NAD+）、EC 2.4.2.10（乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）和EC 4.1.1.23（5'-磷酸-乳清酸核苷脫羧酶）全部表達(dá)下調(diào)，使UMP的生成減少，進(jìn)而能有效影響UDP和細(xì)胞壁的合成。

3 結(jié)論

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析細(xì)菌素作用植物乳桿菌SL32-2后抑菌生長的機(jī)制表明，細(xì)菌素處理后植物乳桿菌SL32-2發(fā)酵液顯著上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)分別有15個和59個，另外有26個蛋白消失，33個蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；在上調(diào)、下調(diào)以及消失和誘導(dǎo)表達(dá)蛋白中，數(shù)量最多的都是酶類，其次是轉(zhuǎn)運蛋白。GO功能富集分析表明，顯著性差異表達(dá)蛋白的功能條目共99條，主要集中在肽聚糖分解代謝和細(xì)胞壁大分子分解代謝、碳水化合物代謝以及嘧啶核苷酸代謝和生物合成等方面。其中，細(xì)菌素處理后上調(diào)表達(dá)的溶菌酶A0A7X1TC68和誘導(dǎo)表達(dá)的溶菌酶A0A2S3U5Q5參與了5個BP和3個BF條目，可協(xié)同作用降解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，使細(xì)胞失去完整性而裂解；KEGG富集分析表明，差異蛋白共涉及淀粉和蔗糖代謝途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、輔因子生物合成途徑和嘧啶代謝途徑等53條通路，使細(xì)胞最主要的營養(yǎng)要素碳源的吸收降解及代謝途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)下調(diào)，降低細(xì)胞的能量供應(yīng)等，細(xì)胞壁主要成分肽聚糖生物合成中的重要載體UDP前體物質(zhì)UMP合成途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)下調(diào)，抑制細(xì)胞壁的合成。