大紅浙醋酒精發(fā)酵階段非釀酒酵母產(chǎn)香機(jī)制研究

倪嘉迎，朱 玲，王鳳軍，修 雨，張 越，姚云平，趙國(guó)忠*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.安琪酵母股份有限公司，江西 宜昌 443000）

食醋是我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，具有悠久的歷史[1]。大紅浙醋是傳統(tǒng)食醋中的典型代表，其玫瑰紅色來(lái)源于氨基和羰基化合物之間的美拉德反應(yīng)，發(fā)酵過(guò)程中不同于其他食醋的微生物群落豐度與組成也使得大紅浙醋具有獨(dú)特的風(fēng)味[2，3]。大紅浙醋的主要釀造階段包括糖化階段、酒精發(fā)酵階段以及醋酸發(fā)酵階段[4]，其中酒精發(fā)酵階段的主要微生物為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），它能夠?qū)⑻穷愞D(zhuǎn)化為乙醇，為后續(xù)的醋酸發(fā)酵提供底物，而產(chǎn)香非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）的存在能夠提升食醋風(fēng)味的豐富性和芳香性[5-7]。目前對(duì)大紅浙醋的研究主要集中于釀造工藝的改進(jìn)以及微生物群落的組成，而對(duì)產(chǎn)香非釀酒酵母在其風(fēng)味組成上的貢獻(xiàn)鮮有報(bào)道[8-10]。

產(chǎn)香非釀酒酵母是釀造工業(yè)廣泛應(yīng)用的微生物菌株，這些酵母雖不像釀酒酵母那樣可以產(chǎn)生高濃度的乙醇，但可以產(chǎn)生具有不同香氣的風(fēng)味物質(zhì)[11-12]。袁英豪等[6]從20份醋源樣品中分離得到了一株產(chǎn)酯能力強(qiáng)，產(chǎn)香濃郁、柔和的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），其可產(chǎn)59種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。韓志雙等[13]從醋醅中篩選得到的粟酒裂殖酵母（Scizosaccharomyces pombe）產(chǎn)酯量達(dá)到3.66g/L。這些非釀酒酵母的存在使得食醋的風(fēng)味更加濃郁。

本實(shí)驗(yàn)以大紅浙醋酒精發(fā)酵階段為研究對(duì)象，為了探討非釀酒酵母弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzeii）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）在大紅浙醋酒精發(fā)酵階段的產(chǎn)香機(jī)制，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定其還原糖代謝能力，失重法測(cè)定CO2生成能力，通過(guò)頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)測(cè)定其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，研究非釀酒酵母對(duì)酒精的耐受性，以及在以大米為發(fā)酵底物的條件下對(duì)糖分的利用情況和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成情況，旨在探究不同非釀酒酵母對(duì)大紅浙醋酒精發(fā)酵階段風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

大米（依嬌兒南陵大米）：市售；產(chǎn)香非釀酒酵母（弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii，Pf）、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans，Kt）、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzeii，Pk）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera，Sf）），商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc），酒曲（Jiuqu，JQ）：安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SHQ630：本實(shí)驗(yàn)室從大紅浙醋中篩選保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

2-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乳酸（分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；丙三醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；α-淀粉酶（10 000 U/g）：福建福大百特生物科技有限公司；糖化酶（100 000 U/g）：內(nèi)蒙古霸潤(rùn)酶制劑制作有限公司；酸性蛋白酶（150 000 U/g）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1115C超凈工作臺(tái)、ZWY-100H溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)儀器有限公司；TQS-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；GZX-9070MBE恒溫干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DY04-13-44-00 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海東亞壓力容器有限公司；CX23LEDRFS1C 生物顯微鏡：奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭：日本島津公司；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；QP2010Ultral氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)M食醋酒精發(fā)酵

在浸泡過(guò)夜的大米中加入2倍體積的水，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后按照料液比1∶6（g∶mL）加滅菌蒸餾水，加入酶制劑（糖化酶0.2%、淀粉酶0.1%和蛋白酶0.05%）和0.1%的干酵母（4株非釀酒酵母、2株釀酒酵母以及酒曲），共七組試驗(yàn)，模擬食醋酒精發(fā)酵。

1.3.2 分析檢測(cè)

（1）還原糖和CO2的測(cè)定

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定[14]；CO2采用失重法[15]。

（2）菌株耐乙醇和耐酸的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)所用的四株非釀酒酵母、兩株釀酒酵母以及酒曲活化后，按2%的接種量分別接種至乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、6%、9%、12%、15%、18%的YPD培養(yǎng)基中；再按2%的接種量分別接種至pH值為3.6、3.4、3.2、3.0、2.8、2.6和自然pH（5.8）的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。

（3）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]。

頂空固相微萃取（HS-SPME）：將模擬食醋酒精發(fā)酵的糧食發(fā)酵液8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液2 mL于頂空瓶中，加入質(zhì)量濃度為20mg/L的2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品30μL，并加入轉(zhuǎn)子。將頂空瓶密封后置于加熱磁力攪拌器上，60 ℃平衡20 min；然后插入經(jīng)過(guò)老化的萃取頭，保持溫度不變，萃取30 min，250 ℃解吸15 min。

氣相色譜條件：使用Rtx-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持3 min，以4 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min；再以8 ℃/min上升到250 ℃保持6 min；載氣為高純氦氣（He），恒定流速為1.0 mL/min，分流比為10∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣時(shí)間1 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，溶劑延遲時(shí)間1.3 min，電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍為33～500 m/z，掃描速率3.00次/s。

定性定量方法：根據(jù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）17數(shù)據(jù)庫(kù)檢索選取相似度＞80%的化合物，并結(jié)合離子碎片及保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行定性。以2-辛醇（20 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量。

1.3.3 香氣活性值的計(jì)算

香氣活性值（ordor activity value，OAV）是表征某一香氣成分對(duì)食物整體香氣特征貢獻(xiàn)度的指標(biāo)，OAV=香氣成分質(zhì)量濃度/感覺(jué)閾值[17]。某種香氣成分的OAV越大，其對(duì)食物的香氣體系的貢獻(xiàn)度越大，對(duì)食物香氣體系特征的形成作用也越大。當(dāng)OAV＞1時(shí)，說(shuō)明該揮發(fā)性香氣成分對(duì)主體香氣有顯著貢獻(xiàn)，是關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），Duncan 多重范圍檢驗(yàn)顯著性水平設(shè)為P＜0.05。采用SPSS軟件27.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2023軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵階段還原糖及CO2變化

酵母菌消耗葡萄糖生成乙醇的同時(shí)釋放出CO2，在還原糖減少的同時(shí)測(cè)量CO2的生成量可大致估算酵母菌的乙醇生成能力和發(fā)酵動(dòng)力[18]。酒精發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量和CO2生成量變化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同非釀酒酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量（a）和CO2生成量（b）的變化Fig. 1 Changes of reducing sugar contents (a) and CO2 production(b) during alcoholic fermentation with different non-Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，不加菌只加酶制劑的空白組（CK）中，在發(fā)酵前4 d，還原糖含量由88.71 mg/L顯著增加到124.68 mg/L，第4天后增加趨勢(shì)變緩慢。在發(fā)酵前期，糖化酶和淀粉酶作用于淀粉分子的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，將淀粉大分子分解為小分子葡萄糖[19]，還原糖含量不斷升高。在發(fā)酵第5天，淀粉分子基本被分解完全，還原糖含量不再增加。在加菌的實(shí)驗(yàn)組中，第2天的還原糖含量基本高于第1天，說(shuō)明菌種用于生長(zhǎng)繁殖消耗還原糖的速率低于淀粉分子分解產(chǎn)生還原糖的速率。菌株Sf酒精發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量呈上升趨勢(shì)，這表明菌株Sf可在發(fā)酵過(guò)程中生成還原糖或者生成了能夠促進(jìn)大分子淀粉水解成還原糖的酶，且在發(fā)酵過(guò)程中，這株酵母產(chǎn)生的CO2量相較于其他酵母少得多，這表明其利用還原糖生成乙醇的能力也較差，從而導(dǎo)致還原糖的生成速率高于其消耗速率，使得最終還原糖含量高于空白組。除這株酵母外，其他酵母在發(fā)酵兩天后還原糖含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且在第7天時(shí)，還原糖基本被利用完全，CO2也不再繼續(xù)生成。其中釀酒酵母SHQ630在發(fā)酵過(guò)程中還原糖被利用的最快，發(fā)酵結(jié)束后，其CO2生成量也最多，這表明SHQ630產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)。JQ和產(chǎn)香非釀酒酵母Pf、Kt、Pk與商業(yè)釀酒酵母Sc的CO2生成量基本相同，其中菌株P(guān)k在24～60 h生成的CO2量較多，JQ、Pf、Kt、Sc的CO2主要在36 h內(nèi)合成，這表明他們產(chǎn)乙醇能力也基本相同，但是乙醇生成速率不同。

2.2 酒曲和酵母的耐酸性和耐乙醇性

酵母菌適合在酸性環(huán)境下生存，一般最適生長(zhǎng)pH為4.5～5.0，偏酸或偏堿環(huán)境都會(huì)影響酵母菌的正常生長(zhǎng)繁殖和代謝。然而酵母自身在代謝過(guò)程中也會(huì)生成一些呈酸性的物質(zhì)使pH降低[20]，在醋酸發(fā)酵過(guò)程中有時(shí)也需要酵母菌發(fā)揮作用，這就要求酵母菌必須具有一定的耐酸能力。耐乙醇是作為發(fā)酵用酵母必須具備的能力，在酒化階段酵母菌自身利用底物生成乙醇并積累增多，當(dāng)達(dá)到一定量的時(shí)候這些乙醇會(huì)反過(guò)來(lái)抑制菌株本身的生長(zhǎng)和代謝水平[21]，因此，能耐高濃度乙醇的菌株會(huì)在這種環(huán)境下獲得優(yōu)勢(shì)，并且能夠生成更多的乙醇。

酒曲和6株酵母在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH環(huán)境中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

圖2 酒曲和不同酵母的酸（a）及乙醇（b）耐受性Fig. 2 Acid (a) and ethanol (b) tolerance of Jiuqu and different yeasts

由圖2a可知，菌株Sc和SHQ630具有最強(qiáng)的耐酸能力，在pH 2.6的強(qiáng)酸環(huán)境下，菌株Sc的OD600nm值為0.517，SHQ630的OD600nm值為0.501仍具有生長(zhǎng)能力，而其他菌株在此酸度環(huán)境中基本已無(wú)法生長(zhǎng)（OD600nm值幾乎為零）；酒曲（JQ）和菌株Sc有相似的耐酸性，但其在pH 3.0時(shí)活力急劇下降，pH 2.8時(shí)幾乎喪失了活力；在四株產(chǎn)香非釀酒酵母中，菌株Sf和Pk的耐酸性相對(duì)較好。這說(shuō)明在與醋酸菌發(fā)酵的末期這四株產(chǎn)香非釀酒酵母和酒曲已經(jīng)不能發(fā)揮作用了，而釀酒酵母還能生長(zhǎng)。

由圖2b可知，菌株P(guān)f和Kt的乙醇耐受性明顯高于菌株Sc、SHQ630和酒曲（JQ）；菌株P(guān)f和Kt與商業(yè)釀酒酵母Sc的乙醇耐受性基本相同。因此，在還原糖充足的條件下，菌株P(guān)f和Kt在酒精發(fā)酵末期高濃度乙醇的脅迫下在產(chǎn)乙醇方面更具優(yōu)勢(shì)。

2.3 酒曲和酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

酒曲和不同酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS測(cè)定總離子流色譜圖見(jiàn)圖3，各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，酒曲和不同酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量見(jiàn)圖4，產(chǎn)香非釀酒酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)韋恩圖見(jiàn)圖5。由圖3和表1可知，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢出最多的是產(chǎn)香非釀酒酵母Sf，共24種，其中OAV＞1的有13種，其次是商業(yè)釀酒酵母Sc，共檢出23種，其中OAV＞1的只有9種，雖然產(chǎn)香非釀酒酵母Pk只共檢出18種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，但其OAV＞1的有12種。

表1 酒曲和不同菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of volatile flavor substances in fermentation broth by Jiuqu and different strains

圖3 酒曲和不同菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in fermentation broth by Jiuqu and different strains analyzed by GC-MS

圖4 酒曲和不同酵母發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（a）及含量（b）Fig. 4 Types (a) and contents (b) of volatile flavor compounds in fermentation broth by Jiuqu and different yeasts

圖5 不同非釀酒酵母發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)韋恩圖Fig. 5 Venn diagram of volatile flavor substances in fermentation broth by different non-Saccharomyces cerevisiae

由圖4a和圖4b可知，產(chǎn)酯種類最多的為產(chǎn)香非釀酒酵母Pk，共10種，酯類物質(zhì)含量最多的為產(chǎn)香非釀酒酵母Pf，為10.64 mg/L；產(chǎn)醇種類最多的為商業(yè)釀酒酵母Sc，共7種，醇類物質(zhì)含量最多的為產(chǎn)香非釀酒酵母Pk，為12.43 mg/L。

由圖5可知，油酸乙酯、亞油酸乙酯、異戊醇、2-甲基丁醇和苯乙醇是產(chǎn)香非釀酒酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)物中所共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。所檢測(cè)到的酯類物質(zhì)呈現(xiàn)不同的水果香味和花香[22]；醇類物質(zhì)是酵母代謝的次級(jí)產(chǎn)物之一，是酒中主要香氣物質(zhì)，醇類物質(zhì)呈現(xiàn)出的香味較為復(fù)雜[23]，如產(chǎn)香非釀酒酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)物中所共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)異戊醇具有濃郁的威士忌香味，2-甲基丁醇具有酒香，而苯乙醇是果香和花香；幾組發(fā)酵液中醛、酸、酮、苯以及酚的種類和含量都較少，然而卻可以為風(fēng)味做出獨(dú)特的貢獻(xiàn)。

酒曲和不同酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，酒曲和酵母的存在能夠豐富食醋的風(fēng)味，產(chǎn)香非釀酒酵母能夠產(chǎn)生釀酒酵母所沒(méi)有的獨(dú)特風(fēng)味，其中產(chǎn)香非釀酒酵母Sf產(chǎn)生風(fēng)味最為豐富并且能生成具有丁香香料風(fēng)味的4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚兩種獨(dú)特物質(zhì)，能夠增添食醋的柔和感，起到呈香、助香的作用[24-26]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了酒曲和6株酵母在模擬食醋酒精發(fā)酵階段消耗還原糖產(chǎn)乙醇的能力以及在不同酸度和乙醇脅迫下菌株的生長(zhǎng)情況，并以大米為底物，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)檢測(cè)酒精發(fā)酵初期各菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征。結(jié)果表明，在酒精發(fā)酵過(guò)程中，菌株SHQ630產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)，菌株P(guān)f、Kt及Pk的產(chǎn)乙醇能力與菌株Sc和酒曲（JQ）相當(dāng)，菌株Sf產(chǎn)乙醇能力最弱。耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Sf和Pk耐酸性較好，菌株P(guān)f和Kt乙醇耐受性較好。GC-MS結(jié)果表明，菌株Sf、Pk、Pf及Kt發(fā)酵液分別共檢出揮發(fā)性風(fēng)味成分24種、18種、13種、10種，菌株P(guān)k產(chǎn)酯種類最多（10種）、產(chǎn)醇最高（12.43 mg/L），菌株P(guān)f產(chǎn)酯最高（10.64 mg/L）。結(jié)果顯示，非釀酒酵母能夠提升大紅浙醋酒精發(fā)酵階段風(fēng)味的豐富性和芳香性。在大紅浙醋酒精發(fā)酵階段，不同產(chǎn)香非釀酒酵母的存在，能夠使大紅浙醋酒精發(fā)酵階段的風(fēng)味更加豐富、芳香，并能提升乙醇產(chǎn)量，使接下來(lái)的醋酸發(fā)酵階段，醋酸菌有更多的底物。