基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建LEU1基因缺失釀酒酵母用于釀造低醉酒度米酒

王澤翔，何嬌嬌，梁思宇，周世水*

（1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東石灣酒廠集團(tuán)有限公司，廣東 佛山 528031）

米酒是大米經(jīng)過(guò)毛霉（Mucorsp.）、根霉（Rhizopussp.）以及酵母發(fā)酵后得到的產(chǎn)品，具有歷史悠久、種類繁多等特點(diǎn)。米酒在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)糖代謝途徑（Harris途徑）和氨基酸代謝途徑（Ehrlich途徑）生成多種高級(jí)醇，包括正丙醇、異丁醇、異戊醇等[1-2]，是形成米酒風(fēng)味的重要化合物，但因高級(jí)醇具有較強(qiáng)的致醉性，飲用后會(huì)出現(xiàn)嘔吐和“上頭”等不適癥狀，對(duì)人體健康有危害[3-6]。不同高級(jí)醇比例導(dǎo)致醉酒度不同[7-8]，其對(duì)神經(jīng)刺激程度隨分子質(zhì)量的增大而加劇，其中對(duì)醉酒度影響最大的物質(zhì)是異戊醇，尤其是異戊醇與異丁醇的比值越高，米酒的醉酒度越高[9]。因此，降低異戊醇/異丁醇的比值，能夠降低米酒的醉酒度，進(jìn)而改善米酒的品質(zhì)，減少對(duì)人體健康的危害。

在Ehrlich途徑中，LEU1基因編碼的異丙基蘋果酸合成酶催化由丙酮酸轉(zhuǎn)化而來(lái)的檸康酸生成β-蘋果酸甲酯，隨后轉(zhuǎn)化成α-酮丁酸，α-酮丁酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成異丁醇的前體物質(zhì)α-酮異戊酸和異戊醇的前體物質(zhì)α-酮異己酸[10]。目前LEU1基因?qū)Σ煌祁愑绊懢休^多研究[11-12]，但對(duì)米酒醉酒度影響的研究較少。

成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPRassociated protein 9，CRISPR-Cas9）基因編輯技術(shù)利用向?qū)Ш颂呛怂幔╣uide ribonucleic acid，gRNA）識(shí)別目標(biāo)序列，依靠Cas9蛋白切割靶位點(diǎn)序列，使得細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）雙鏈斷裂，以此來(lái)激發(fā)非同源末端連接修復(fù)機(jī)制或同源重組修復(fù)機(jī)制，達(dá)到基因組高效定點(diǎn)敲除、定點(diǎn)敲入和基因修飾的目的[13-18]。與傳統(tǒng)的基因改造技術(shù)相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有精準(zhǔn)、高效的優(yōu)勢(shì)，避免了在基因改造過(guò)程中對(duì)釀酒酵母基因組的污染，使得改良酵母應(yīng)用于釀造酒更加安全[19-20]。本研究以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）XF0為出發(fā)菌株，通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒p414-Cas9- BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX，建立通過(guò)博來(lái)霉素和G418抗生素來(lái)篩選釀酒酵母的基因敲除系統(tǒng)，以此獲得非營(yíng)養(yǎng)缺陷型LEU1基因缺失的重組菌，探究LEU1基因缺失對(duì)高級(jí)醇生成的影響，通過(guò)優(yōu)化高級(jí)醇之間的比例釀造低醉酒度米酒，為提高米酒品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒載體見表1。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationalcenterforbiotechnology information，NCBI）獲得釀酒酵母S288c的LEU1基因組序列（序列號(hào)：NC-001139），采用SnapGene 5.2.4軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生物工程技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成。本研究所用引物見表2。

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.1.3 試劑

G418硫酸鹽：北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；博來(lái)霉素TM篩選試劑：賽默飛世爾科技公司；氨芐青霉素、D-山梨醇、乙酸丁酯、醋酸鋰：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：上海邁跟生物科技有限公司；Apex HF HS DNA聚合酶預(yù)混液-FS：湖南艾科瑞生物科技有限公司；Clon ExpressRII One Step Cloning Kit試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；2×GSTaq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix：北京金沙生物科技有限公司；酵母總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）快速抽提試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；無(wú)酵母米酒酒曲：本實(shí)驗(yàn)室。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基[9]：酵母提取粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、蛋白胨10 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[21]：酵母提取粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、無(wú)水葡萄糖20 g/L。

模擬發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：麥芽粉130 g/L、白砂糖100 g/L。

以上對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基需添加2%瓊脂，以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司（bio-rad）；EPS300電泳儀：上海天能生命科學(xué)有限公司；TC1000-G PCR基因擴(kuò)增儀：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；GC8100氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：滕州市經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括Cas9蛋白和gRNA，Cas9蛋白通過(guò)與gRNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因編輯[22]。Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建需要含有Cas9基因和博來(lái)霉素抗性基因。以質(zhì)粒p414-Cas9為模板，Cas9-F和Cas9-R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含有Cas9基因的片段（8 330 bp）；以pPICZ（alpha）質(zhì)粒為模板，BleoR-F和BleoR-R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到兩端與含有Cas9基因片段末端20 bp序列同源的BleoR抗性基因片段（1 324 bp）；將兩個(gè)片段混合后，用同源重組試劑盒實(shí)現(xiàn)DNA的體外環(huán)化。直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，取100 μL轉(zhuǎn)化液涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到Cas9表達(dá)質(zhì)粒p414-Cas9-BleoR。

gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建需要將LEU1基因設(shè)置為靶位點(diǎn)，并含有G418抗性基因。以質(zhì)粒p426-gRNA為模板，gRNA-F和gRNA-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到含有SNR52啟動(dòng)子、gRNA scaffold及SUP4終止子的片段（4 953 bp）；以pUG6質(zhì)粒為模板，kanMX-F和kanMX-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端與含有g(shù)RNA基因片段末端20 bp序列同源的G418抗性基因片段（1 482 bp）；將兩個(gè)片段混合后，用同源重組試劑盒實(shí)現(xiàn)DNA的體外環(huán)化。直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，取100 μL轉(zhuǎn)化液涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到gRNA表達(dá)質(zhì)粒p426-gRNA-kanMX。

參照NCBI中釀酒酵母S288c基因組序列（序列號(hào)：NC-001139）信息，選取LEU1基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用SnapGene軟件找到間隔序列前體旁基序位點(diǎn)（5-NGG或NAG結(jié)構(gòu)）。通過(guò)融合PCR技術(shù)得到含有20 ntLEU1靶點(diǎn)序列的片段（60 bp），以質(zhì)粒p426-gRNA-kanMX為模板，LEU1r-F和LEU1r-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與含有LEU1靶點(diǎn)序列片段末端20 bp序列同源的片段（6 375 bp）；將兩個(gè)片段混合后，用同源重組試劑盒實(shí)現(xiàn)DNA的體外環(huán)化。直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，取100μL轉(zhuǎn)化液涂布于含有100mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到能夠識(shí)別LEU1靶點(diǎn)的gRNA表達(dá)質(zhì)粒p426-gRNA.LEU1-kanMX。

以釀酒酵母S288c基因組為模板，在LEU1靶點(diǎn)序列的上游和下游，分別用引物L(fēng)T-F1和LT-R1、LT-F2和LT-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到上下游兩段同源臂，再通過(guò)融合PCR技術(shù)即可得到donor DNA。

1.3.2 釀酒酵母電轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

將1 μL純化后的p414-Cas9-BleoR質(zhì)粒加到100 μL釀酒酵母XF0感受態(tài)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，30 ℃溫育30 min后涂布于含有200 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。在此酵母的基礎(chǔ)上制備感受態(tài)，加入1 μL純化后的p426-gRNA.LEU1-kanMX質(zhì)粒和10 μL donor DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，30 ℃溫育30 min，將溫育的轉(zhuǎn)化子涂布于含有100 μg/mL G418抗生素的YPD平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證[23]。

1.3.3 基因敲除菌的篩選驗(yàn)證

將菌落振蕩裂解，采用引物L(fēng)EU1-A/LEU1-D進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)donor DNA通過(guò)酵母的同源重組修復(fù)機(jī)制正確地整合到基因組上。用酵母總RNA快速抽提試劑盒提取陽(yáng)性菌株總RNA，以其為模板再用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3.4 質(zhì)粒丟失

將驗(yàn)證陽(yáng)性的菌株劃線至YPD平板，挑取單菌落接種于10 mL液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)12代以上，用含200 μg/mL博來(lái)霉素平板和100 μg/mL G418抗生素平板挑選質(zhì)粒丟失、沒有抗性的重組酵母菌XF0-L[9]。

1.3.5 生長(zhǎng)曲線的繪制

取3 mL酵母種子液接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每2 h取2 mL菌液測(cè)定OD600nm值。

1.3.6 模擬發(fā)酵酒的制備

將斜面保存的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h得到種子液。取3 mL種子液接種到100mL模擬發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃靜置發(fā)酵4d，即得模擬發(fā)酵酒。

1.3.7 米酒的制備

將80 g米煮飯冷卻后置于500 mL燒杯中，加20%無(wú)酵母米酒酒曲和100 mL水，接種12%酵母種子液，33 ℃靜置發(fā)酵10 d，即得米酒。

1.3.8 分析方法

將模擬發(fā)酵酒液過(guò)濾后測(cè)定CO2產(chǎn)生量、pH值、還原糖含量、酒精度及高級(jí)醇；將米酒蒸餾出100 mL酒液，測(cè)定高級(jí)醇。

CO2產(chǎn)生量：稱量法測(cè)定[24]；還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測(cè)定[25]；pH值：pH計(jì)測(cè)定；酒精度：酒精計(jì)測(cè)定；高級(jí)醇：氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定[26-27]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，通過(guò)SPSS 29.0軟件進(jìn)行顯著性分析，使用Origin pro 2021軟件繪制柱狀圖、生長(zhǎng)曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒p414-Cas9-BleoR的構(gòu)建

重組質(zhì)粒p414-Cas9-BleoR的構(gòu)建結(jié)果見圖1。將重組質(zhì)粒委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，質(zhì)粒序列正確，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒p414-Cas9-BleoR的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid p414-Cas9-BleoR

2.1.2LEU1基因gRNA打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒p426-gRNA.LEU1-kanMX的構(gòu)建結(jié)果見圖2。將重組質(zhì)粒委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，質(zhì)粒序列正確，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒p426-gRNA.LEU1-kanMX的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid p426-gRNA.LEU1-kanMX

2.2 LEU1靶點(diǎn)基因敲除的結(jié)果

電轉(zhuǎn)化后篩選出重組菌株XF0-L，以其基因組DNA為模板，出發(fā)菌株XF0基因組DNA為陰性對(duì)照，采用引物L(fēng)EU1-A和LEU1-D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，以重組菌株XF0-L和出發(fā)菌株XF0基因組DNA為模板分別擴(kuò)增出1 279 bp（敲除510 bp）和1 789 bp片段，結(jié)果與預(yù)期一致，證明LEU1基因已成功被敲除。

圖3 重組菌株XF0-L的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig. 3 PCR validation results of recombinant strain XF0-L

為進(jìn)一步驗(yàn)證LEU1基因是否被敲除，提取重組菌株XF0-L和出發(fā)菌株XF0的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析LEU1基因的表達(dá)量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，重組菌株XF0-L的LEU1基因表達(dá)量極低，這說(shuō)明LEU1基因已成功被敲除。

圖4 出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L中LEU1基因表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果Fig. 4 Determination results of LEU1 gene expression in original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.3 質(zhì)粒丟失驗(yàn)證

通過(guò)影印平板法篩選傳代丟失質(zhì)粒的重組菌株XF0-L，結(jié)果見圖5。由圖5可知，重組菌株XF0-L在不含G418抗生素的平板上正常生長(zhǎng)，在含G418抗生素的平板上不會(huì)生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢。這說(shuō)明重組菌株XF0-L中質(zhì)粒p426-gRNA.LEU1-kanMX已成功被去除。

圖5 重組菌株XF0-L質(zhì)粒丟失驗(yàn)證結(jié)果Fig. 5 Verification results of plasmid loss of recombinant strain xf0-l

2.4 LEU1基因敲除對(duì)菌株生長(zhǎng)性能的影響

出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L的生長(zhǎng)曲線見圖6。由圖6可知，LEU1基因缺失重組菌株XF0-L的生長(zhǎng)速率與出發(fā)菌株XF0無(wú)明顯區(qū)別，說(shuō)明LEU1基因缺失不影響酵母菌的生長(zhǎng)性能。

圖6 出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L的生長(zhǎng)曲線Fig. 6 Growth curves of original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.5 LEU1基因敲除對(duì)菌株發(fā)酵性能的影響

出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒的理化指標(biāo)見表3。由表3可知，重組菌株XF0-L與出發(fā)菌株XF0模擬發(fā)酵后的CO2產(chǎn)生量、還原糖含量、pH值和酒精度均無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明LEU1基因缺失對(duì)酵母發(fā)酵性能沒有影響。

表3 出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of simulated fermented wine with original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.6 LEU1基因敲除對(duì)菌株生成高級(jí)醇的影響

采用出發(fā)菌株XF0與重組菌株XF0-L進(jìn)行發(fā)酵，模擬發(fā)酵酒和米酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇和總高級(jí)醇的含量檢測(cè)結(jié)果見圖7。

圖7 出發(fā)菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒（a）及發(fā)酵米酒（b）中的高級(jí)醇含量Fig. 7 Higher alcohols contents in simulated fermented wine (a)and fermented rice wine (b) with original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

由圖7a可知，重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒中正丙醇、異丁醇、總高級(jí)醇含量分別為26.27mg/L、88.64mg/L、256.72mg/L，比出發(fā)菌株XF0分別提高21.96%、85.25%、8.18%；異戊醇含量為141.82 mg/L，比出發(fā)菌株XF0降低15.53%。由圖7b可知，重組菌株XF0-L發(fā)酵米酒中正丙醇、異丁醇、總高級(jí)醇含量分別為268.67 mg/L、992.33 mg/L、2 277.33 mg/L，比出發(fā)菌株XF0分別提高14.17%、52.90%、10.53%，異戊醇含量為1 016.33 mg/L，比出發(fā)菌株XF0降低13.58%。重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒和發(fā)酵米酒中的異戊醇/正丙醇分別為5.39和3.78，比出發(fā)菌株XF0分別降低30.99%、24.40%；異戊醇/異丁醇分別為1.60和1.02，比出發(fā)菌株XF0分別降低54.42%、43.65%。

結(jié)果表明，利用LEU1基因敲除重組菌株XF0-L發(fā)酵酒能夠提高正丙醇和異丁醇含量，降低異戊醇含量。這與LI W等[11-12]敲除釀酒酵母LEU1基因使得正丙醇、異丁醇提高，異戊醇降低的結(jié)論類似。這證明LEU1基因的缺失影響了蘇氨酸及高絲氨酸合成α-酮丁酸的代謝流，導(dǎo)致正丙醇升高；LEU1基因的缺失阻礙了α-酮異己酸的合成，直接導(dǎo)致異戊醇生成量降低，而下游代謝途徑受阻導(dǎo)致α-酮異戊酸的積累，造成異丁醇生成量提高。

3 結(jié)論

本研究基于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX，建立了通過(guò)博來(lái)霉素和G418抗生素來(lái)篩選釀酒酵母的基因敲除系統(tǒng)，并通過(guò)電轉(zhuǎn)化成功獲得LEU1基因敲除的重組菌XF0-L。結(jié)果表明，菌株XF0-L與XF0模擬發(fā)酵酒的理化指標(biāo)無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明LEU1基因的缺失對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能無(wú)影響。相較于出發(fā)菌株XF0，重組菌株XF0-L模擬發(fā)酵酒中正丙醇（26.27 mg/L）和異丁醇含量（88.64 mg/L）分別提高21.96%和85.25%，異戊醇含量（141.82 mg/L）、異戊醇/正丙醇（5.39）、異戊醇/異丁醇（1.60）分別降低15.53%、30.99%、54.42%；相較于出發(fā)菌株XF0，重組菌株XF0-L發(fā)酵米酒中正丙醇（268.67 mg/L）和異丁醇含量（992.33 mg/L）分別提高14.17%、52.90%，異戊醇含量（1 016.33 mg/L）、異戊醇/正丙醇（3.78）、異戊醇/異丁醇（1.02）分別降低13.58%、24.40%、43.65%，說(shuō)明重組菌株XF0-L能夠顯著降低發(fā)酵酒中的異戊醇/正丙醇、異戊醇/異丁醇從而降低醉酒度（P＜0.05），這為釀造低醉酒度高品質(zhì)米酒提供了新的技術(shù)思路。綜上所述，利用CRISPR-Cas9技術(shù)改良釀酒酵母菌是優(yōu)化釀造酒中不同高級(jí)醇比例實(shí)現(xiàn)降低醉酒度和提高口感品質(zhì)的可行釀酒技術(shù)。