高溫大曲中功能紅曲霉菌株的篩選與功能淺析

張 柱，黃 鈞，周榮清，2*，雷梓倫，唐秋香，萬營(yíng)東，張宿義，秦 輝，董 異，王 超，王小軍，冉茂芳

（1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610056；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

紅曲霉（Monascussp.）是一類嗜醇喜酸真菌，幼齡時(shí)其菌絲為白色，因菌絲成熟過程中產(chǎn)色素，逐漸由白色變?yōu)榧t色。紅曲霉的最適生長(zhǎng)pH和溫度分別是3.5～5.0和25～30 ℃[1-2]，可產(chǎn)糖化酶、酯化酶、蛋白酶等多種酶系，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品（白酒、黃酒和食醋等）生產(chǎn)中常見的功能菌之一[3]。

隨著白酒生產(chǎn)過程中功能菌株的不斷挖掘，紅曲霉在白酒釀造中的貢獻(xiàn)亦引起了廣泛的重視[4-5]。已有的研究結(jié)果表明，Monascus在多種大曲中都是優(yōu)勢(shì)真菌[6-7]。目前，接種Monascus強(qiáng)化濃、清香型大曲的技術(shù)已被證明是改善大曲品質(zhì)及提高基酒品質(zhì)與產(chǎn)率的有效措施之一。如羅小葉等[8]利用高產(chǎn)酯化酶的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）生產(chǎn)的高酯化大曲，顯著提高了濃香型基酒的酸類和酯類揮發(fā)組分的含量及產(chǎn)率；劉新宇[9]利用煙色紅曲霉（Monascus rubber）和橙色紅曲霉（Monascus aurantiacus）強(qiáng)化清香型大曲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒體特征和香氣組分均得到了改善。此外，黃酒生產(chǎn)中應(yīng)用紅曲霉菌，不僅賦予了紅艷、香甜、味醇等感官特色，且提高了酯類組分的含量[10-11]，但其在醬香型白酒及其大曲生產(chǎn)方面的應(yīng)用研究則鮮見報(bào)道。

本研究采用可培養(yǎng)技術(shù)從呈粉紅色的高溫大曲中分離紅曲霉（Monascus）菌株，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究其在純培養(yǎng)麥曲、模擬白酒固態(tài)發(fā)酵及強(qiáng)化大曲中的代謝特征，進(jìn)而篩選優(yōu)良的功能紅曲霉菌株，并通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，旨在解析紅曲霉功能菌株在高溫及高酸、醇環(huán)境中的代謝多樣性特征，為開發(fā)高溫強(qiáng)化大曲生產(chǎn)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

小麥、高粱和工廠生產(chǎn)用高溫大曲粉：四川瀘州老窖股份有限公司；呈粉紅色的高溫大曲：貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某知名酒企。

1.1.2 試劑

草酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和辛酸甲酯等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜級(jí)）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、己酸、無水乙醇、葡萄糖和淀粉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；植物脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（通用型）：北京擎科生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[12]：麥芽糖度10°Bx，加瓊脂2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

麥曲培養(yǎng)基：在63 g的小麥粉中加入37 g水，攪拌均勻，潤(rùn)料30 min，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國(guó)Supelco公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司；Alltech OA-1000有機(jī)酸色譜柱（300×6.5 mm）：美國(guó)格雷斯公司；C18固相萃取小柱（solid phase extraction column，SPEC）：成都思為科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 功能紅曲霉菌株的分離及篩選

稱取呈粉紅色的高溫大曲粉2.00 g，加入無菌生理鹽水制備成均勻的菌團(tuán)懸浮液，10倍梯度稀釋并血球計(jì)數(shù)后，取活菌數(shù)為1×102～1×104CFU/mL的稀釋液涂布于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板上，于30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。挑取呈白色菌絲的菌落接種于相同培養(yǎng)基斜面，同樣溫度條件下培養(yǎng)2～3 d，將菌絲呈紅色的菌株作為分離菌株，經(jīng)多次純化后得到純菌株。按1%的接種量將分離菌株接種于麥曲培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d，長(zhǎng)滿呈紅色的菌絲（麥曲）后，45 ℃烘干，粉碎（麥曲粉），參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》和岳建明等[13]的方法測(cè)定其糖化力、液化力、酯化力和色價(jià)。

1.3.2 篩選菌株代謝特性分析

測(cè)定麥曲粉中的有機(jī)酸和揮發(fā)性代謝組分，并將麥曲粉按2%的接種量接種于常壓蒸煮的高粱中進(jìn)行模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵。高粱固態(tài)發(fā)酵模擬釀酒試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]并略作修改：將粉碎的高粱（粉碎度＜20目篩的高粱質(zhì)量占比約為85%）以80 ℃熱水（水與高粱的質(zhì)量比為2∶1）浸泡1 h后，加入20%（以干高粱計(jì)）提前蒸至無異味的稻殼，蒸煮約30 min（高粱透明無白心），出甑后適量打量水（撒90 ℃熱水），攤晾鼓風(fēng)冷卻至溫度低于40 ℃，實(shí)驗(yàn)組加入生產(chǎn)用高溫大曲粉15%和麥曲粉2%，對(duì)照組（KB）只加入15%生產(chǎn)用高溫大曲粉（以干高粱計(jì)）。室溫堆積糖化1 d后，將其分裝至滅菌的塑料盒（28 cm×19 cm×14 cm），封口膜覆蓋后，置于真空袋中抽真空，30 ℃恒溫厭氧發(fā)酵28 d。每隔7 d取樣一次，檢測(cè)糟醅的理化指標(biāo)，并檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束后糟醅的代謝組分。

1.3.3 篩選菌株強(qiáng)化高溫大曲

將篩選菌株制備的麥曲粉按3%接種于碎小麥（過20目篩，50%半細(xì)粉和50%粗粉及麥皮）中，加水拌料、混勻，人工踩曲為曲坯（曲培的含水量為37%左右），攤晾30 min，置于曲房蓋滿稻草后自然發(fā)酵，待曲心溫度高于65 ℃時(shí)，進(jìn)行第一次翻曲后再發(fā)酵，當(dāng)曲心溫度再次高于65 ℃時(shí)，第二次翻曲，繼續(xù)發(fā)酵28 d，轉(zhuǎn)房貯存。隨機(jī)挑選不同菌株強(qiáng)化的高溫大曲，粉碎后取樣，于-20 ℃下保存，測(cè)定其理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味組分。

1.3.4 篩選菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察[15]：將復(fù)篩菌株接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，通過光學(xué)顯微鏡觀察其菌體及菌落的形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：使用植物DNA提取試劑盒（通用型）提取復(fù)篩菌株的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和IST4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增ITS區(qū)基因序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性檢索，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 分析檢測(cè)方法

有機(jī)酸測(cè)定：參考ZHANG L Q等[16]的HPLC法。

揮發(fā)性代謝組分測(cè)定：參考ZHENG J等[17]的頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）-GC-MS法。

理化指標(biāo)（水分、還原糖、總糖、總酸和酒精度）的測(cè)定：按照《白酒分析與檢測(cè)技術(shù)》[18]和QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》規(guī)定的方法，并計(jì)算總糖利用率，其計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 25.0軟件和Duncan方法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重測(cè)試分析。采用Simca 14.1軟件對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）；采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉菌株的分離及篩選

從麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中共挑取出40株（H1～H40）菌絲呈白色的菌株，經(jīng)麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，僅獲得12株菌絲呈紅色的分離菌株。將12株分離菌株純培養(yǎng)麥曲后，測(cè)定麥曲的酯化力、糖化力、液化力和色價(jià)，結(jié)果見表1。

表1 不同菌株純培養(yǎng)麥曲酯化力、糖化力、液化力及色價(jià)的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of esterifying power, saccharifying power, liquefying power and color value of pure culture wheat Qu with different strains

由表1可知，分離菌株H30的酯化力最高，為2 494.15 mg/（50 g·7 d）；分離菌株H26的糖化力最高，為423.85 mg/（g·h）；分離菌株H14的色價(jià)最高，為50.65 U；分離菌株H39的糖化力[8.16 mg/（g·h）]顯著低于其他分離菌株（P＜0.05），且酯化力[479.51 mg/（50 g·7 d）]和色價(jià)（13.18 U）也較低，此外，所有菌株的液化力都較低。綜上，選取H14、H26、H30和H39（對(duì)比）4株分離菌株進(jìn)一步探究。

2.2 篩選菌株代謝特性的研究

2.2.1 不同篩選菌株純培養(yǎng)麥曲代謝組分間的差異

不同篩選菌株純培養(yǎng)麥曲的有機(jī)酸種類及含量見圖1。由圖1可知，從4種麥曲中均檢測(cè)出3種有機(jī)酸，分別為乙酸、蘋果酸和檸檬酸，且均以乙酸和蘋果酸為主。其中菌株H14產(chǎn)有機(jī)酸的能力最強(qiáng)，有機(jī)酸含量達(dá)22.36 mg/kg。不同菌株產(chǎn)有機(jī)酸能力具有差異，如菌株H14和H26分別產(chǎn)乙酸和蘋果酸的能力最強(qiáng)。

圖1 不同菌株純培養(yǎng)麥曲有機(jī)酸種類及含量的檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Determination results of organic acids species and contents of pure culture wheat Qu with different strains

采用HS-SPME-GC-MS法檢測(cè)不同初篩菌株純培養(yǎng)麥曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果見表2。

表2 不同菌株純培養(yǎng)麥曲揮發(fā)性代謝組分GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of volatile metabolites of pure culture wheat Qu with different strains μg/kg

由表2可知，從純培養(yǎng)麥曲中共檢出39種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括醇類（4種）、醛類（1種）、酚類（3種）、酯類（26種）、酮類（2種）和吡嗪（3種）6類。不同菌株間的揮發(fā)性風(fēng)味成分組成的輪廓不同。除菌株H26外，其余3株菌株純培養(yǎng)麥曲中的酯類物質(zhì)相對(duì)含量＞60%，且主要為棕櫚酸甲酯等長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯。菌株H26純培養(yǎng)麥曲中的吡嗪類物質(zhì)含量最高，相對(duì)含量達(dá)到48.67%，其次為醇類物質(zhì)，相對(duì)含量為23.58%。這些菌株純培養(yǎng)麥曲中含有12種共有的揮發(fā)性風(fēng)味成分，主要包括2,3-丁二酮、乙偶姻、2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醇、己醛、癸酸甲酯和棕櫚酸甲酯等。此外，菌株H14、H26、H30和H39分別有4種、2種、3種和3種獨(dú)有的成分。

基于PLS-DA模型解析菌株對(duì)麥曲揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，自變量擬合指數(shù)（R2X）、因變量擬合指數(shù)（R2Y）和模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）分別為0.994、0.995和0.989，R2和Q2均接近1，表明模型可靠。菌株H26純培養(yǎng)麥曲位于PLS1軸的負(fù)半軸，菌株H14、H30和H39純培養(yǎng)麥曲均位于PLS1軸的正半軸，說明菌株H26和其他3種菌株代謝的揮發(fā)性成分輪廓不同，且主要由2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二醇和一些酯類物質(zhì)的含量所致。由此可見，菌株H14、H30和H39主要代謝組分為酯類，而菌株H26主要代謝組分則是吡嗪類。

圖2 不同菌株純培養(yǎng)麥曲揮發(fā)性代謝組分的偏最小二乘判別分析得分圖（A）與載荷圖（B）Fig. 2 Partial least squares discriminant analysis score chart (A) and load chart (B) of pure culture wheat Qu with different strains

基于變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1得到8種顯著影響其風(fēng)味特征的揮發(fā)性代謝組分，分別為2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、苯乙醇、亞油酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯和癸酸甲酯。同屬的種/株間對(duì)特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)差異顯著，菌株H26合成2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3-丁二醇的能力最強(qiáng)，后者是合成前者的前體物質(zhì)[19]，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪具有烘焙香和甜香味，是醬香型白酒重要呈香組分[20-21]。菌株H14則是合成賦予玫瑰花香的苯乙醇的能力顯著高于其余菌株[22]。菌株H30則是合成賦予水果香和花香的油酸甲酯和癸酸甲酯的能力較強(qiáng)[23-24]。而菌株H39對(duì)差異代謝物的貢獻(xiàn)都較低。

2.2.2 模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵糟醅主要代謝組分的差異

將不同菌株純培養(yǎng)麥曲應(yīng)用于模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵中，測(cè)定糟醅的理化性質(zhì)，并計(jì)算總糖利用率，結(jié)果見表3。

表3 不同菌株模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵過程糟醅理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果及總糖利用率Table 3 Determination results of physicochemical indexes and total sugar utilization in fermented grains of different strains during simulated solid-state brewing

由表3可知，發(fā)酵過程中，不同糟醅間的主要理化性質(zhì)變化趨勢(shì)不同。其中，菌株H14的總糖利用率最高（35.23%），且入池坯的水分含量較高（46.52%），發(fā)酵0～14 d總糖含量急劇降低，發(fā)酵7～14 d酒精度急劇升高，發(fā)酵14 d時(shí)，酒精度最高達(dá)到8.3%vol，總酸和還原糖含量變化趨勢(shì)平緩。發(fā)酵結(jié)束時(shí)（28 d），糟醅的水分含量為54.03%，酒精度為7.5%vol，酒精度顯著高于其他組和KB組（P＜0.05），說明菌株H14顯著提高了出酒率。此外，菌株H30和H39發(fā)酵過程中糟醅的水分呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(shì)，菌株H39和H26發(fā)酵過程中糟醅的總酸含量也呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(shì)。值得注意的是，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌株H26、H30和H39的總糖利用率和酒精度都低于KB。

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，采用HPLC測(cè)定糟醅的有機(jī)酸種類及含量，結(jié)果見圖3。

圖3 不同菌株模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵糟醅有機(jī)酸含量的測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination results of organic acid content in fermented grains of different strains during simulated solid-state brewing

由圖3可知，在所有糟醅中均檢測(cè)出5種有機(jī)酸，其中菌株H14發(fā)酵糟醅中雖然總有機(jī)酸酸含量（1.13 mg/kg）最低，但檸檬酸含量（0.13 mg/kg）最高，菌株H26發(fā)酵糟醅中蘋果酸（0.73 mg/kg）含量最高，而菌株H30發(fā)酵糟醅中則是乙酸含量最高（0.97 mg/kg）。

采用HS-SPME-GC-MS法從發(fā)酵結(jié)束的糟醅中共檢出34種揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果見圖4。

圖4 不同菌株模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵糟醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Fig. 4 Determination results of volatile flavor substance contents of different strains during simulated solid-state brewing

由圖4可知，不同篩選菌株發(fā)酵對(duì)糟醅揮發(fā)性成分含量及輪廓的影響具有一定差異。菌株H14發(fā)酵糟醅的總揮發(fā)性風(fēng)味成分含量最高（33.12 mg/kg），其酯類和醇類的含量分別為27.07 mg/kg和4.02 mg/kg，較KB分別高13.84%和33.00%。此外，其較高的酯類含量和較低的有機(jī)酸含量可能是醇酸間縮合反應(yīng)消耗了有機(jī)酸所致，其中酯類物質(zhì)含量的增加與鄭翠銀等[10-11]將紅曲霉應(yīng)用于黃酒的研究結(jié)果類似。

基于PLS-DA模型解析不同篩選菌株對(duì)糟醅揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同菌株模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵糟醅揮發(fā)性代謝組分的偏最小二乘判別分析結(jié)果Fig. 5 Partial least squares discriminant analysis results of volatile metabolites of different strains during simulated solid-state brewing

由圖5可知，R2和Q2均接近1，表明模型可靠，菌株H14發(fā)酵糟醅和KB分別位于第I和第IV象限，菌株H26、H30和H39發(fā)酵糟醅則均位于第II象限，且距離非常接近，表明其揮發(fā)性成分的組成類似。

基于VIP值＞1篩選得到12種顯著影響其風(fēng)味特征的差異揮發(fā)性代謝組分，結(jié)果見表4。由表4可知，12種差異揮發(fā)性代謝組分分別為棕櫚酸乙酯、反油酸乙酯、2,3-丁二醇、丁酸乙酯、苯酚、苯乙醇、3-糠醛、乙酸乙酯、異戊醇、琥珀酸二乙酯、棕櫚酸甲酯和4-乙基愈創(chuàng)木酚。菌株H14發(fā)酵糟醅中棕櫚酸乙酯、反油酸乙酯和2,3-丁二醇3種成分含量顯著高于其他樣品（P＜0.05），其中棕櫚酸乙酯和2,3-丁二醇是優(yōu)勢(shì)組分，前者呈微弱蠟香、奶油香和堅(jiān)果香，是酒中常見酯類物質(zhì)[25-26]，該結(jié)果亦揭示紅曲霉菌具有提高合成棕櫚酸乙酯的結(jié)果[11-12]。而在菌株H39發(fā)酵糟醅中丁酸乙酯含量更高，在菌株H30發(fā)酵糟醅中苯酚和3-糠醛含量更高。但是，致使其麥曲揮發(fā)性成分輪廓差異的2,3,5,6-四甲基吡嗪在糟醅中都未檢出，其原因待進(jìn)一步探討。綜上表明，這些篩選菌株顯著提高了糟醅中酒精和酸的積累以及淀粉的利用，此外，這些分離菌株亦改善了糟醅的風(fēng)味輪廓。

表4 不同菌株模擬固態(tài)釀酒發(fā)酵糟醅中的主要差異代謝揮發(fā)性組分Table 4 Main differential volatile metabolites of volatile metabolites of different strains during simulated solid-state brewing mg/kg

2.3 不同篩選菌株對(duì)高溫大曲貢獻(xiàn)的差異

2.3.1 高溫大曲的理化性質(zhì)

將4株篩選菌株純培養(yǎng)麥曲粉接種到曲坯中生產(chǎn)高溫大曲，測(cè)定其主要理化指標(biāo)，結(jié)果見表5。

表5 4株篩選菌株對(duì)高溫大曲理化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of 4 screened strains on physicochemical indexes of high temperature Daqu

由表5可知，不同菌株對(duì)大曲理化性質(zhì)貢獻(xiàn)不同，菌株H30對(duì)糖化力[112.42 mg/（g·h）]、酯化力[24.98 mg/（50 g·7 d）]及氨基酸態(tài)氮含量（4.08 g/kg）的貢獻(xiàn)程度顯著高于其余菌株（P＜0.05）；菌株H14的發(fā)酵力[0.34 g/（0.5 g·72 h）]顯著高于其他菌株（P＜0.05），有提高出酒率的潛力。由此可見，實(shí)際體系因涉及與多種種屬微生物的互作關(guān)系，改變了菌株的貢獻(xiàn)，其機(jī)制待進(jìn)一步深入探討。

2.3.2 高溫大曲的揮發(fā)性代謝組分

采用HS-SPME-GC-MS對(duì)4株菌株強(qiáng)化的高溫大曲中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖6。

圖6 不同菌株強(qiáng)化高溫大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Fig. 6 Determination results of volatile flavor substance in high temperature Daqu fortified by different strains

由圖6可知，從4株菌株強(qiáng)化的高溫大曲中共檢出29種揮發(fā)性代謝成分，包括酯類（5種）、醇類（3種）、醛類（9種）、吡嗪類（4種）、酸類（1種）和其他（7種）6類。結(jié)合表2可知，相對(duì)純培養(yǎng)的麥曲，4種強(qiáng)化大曲的酯類物質(zhì)的種類從26降至5種，醛類物質(zhì)的種類增加了8種。而且菌株H26強(qiáng)化大曲亦是吡嗪類含量最高，菌株H14和H39強(qiáng)化大曲則是酯類和醇類物質(zhì)含量最高。表明菌株H26在麥曲和強(qiáng)化大曲中對(duì)吡嗪類物質(zhì)的合成都具有較大的貢獻(xiàn)。

基于揮發(fā)性代謝組分對(duì)不同菌株強(qiáng)化高溫大曲進(jìn)行PLS-DA，并基于VIP值＞1篩選貢獻(xiàn)度較大的差異代謝成分，結(jié)果見圖7。

圖7 不同菌株強(qiáng)化高溫大曲中揮發(fā)性代謝組分的偏最小二乘-判別分析結(jié)果（A）及主要差異代謝物質(zhì)（B）Fig. 7 Partial least squares-discriminant analysis results (A) and main differential metabolites (B) of volatile metabolites in high-temperature Daqu fortified by different strains

由圖7A可知，R2和Q2均接近1，表明模型可靠。4種高溫大曲分別位于4個(gè)象限，說明揮發(fā)性代謝成分具有較大差異。由圖7B可知，基于VIP值＞1共篩選出了8種貢獻(xiàn)度較大的差異代謝成分，分別為2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醇、棕櫚酸甲酯、3-糠醛、十二烷、苯甲醇、棕櫚酸乙酯和苯乙醛，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醇和棕櫚酸甲酯和棕櫚酸乙酯是導(dǎo)致強(qiáng)化大曲揮發(fā)性成分輪廓差異的主要成分之一，其分別在菌株H26、H39、H30和H14強(qiáng)化大曲中含量最高，含量分別是0.27 mg/kg、0.41 mg/kg、0.18 mg/kg和0.08 mg/kg。綜上，紅曲霉具有改善高溫大曲理化性質(zhì)和代謝組分輪廓的潛在功能，但需解決與大曲內(nèi)生群落的種屬間的互作關(guān)系、營(yíng)養(yǎng)網(wǎng)絡(luò)及代謝調(diào)控的影響規(guī)律。

2.4 篩選菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

4株篩選菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖8。由圖8可知，所有菌株的菌落均呈圓形、中間呈紅色，四周呈白色，菌絲較粗壯，孢子絲上有連串的孢子。結(jié)合《紅曲菌的形態(tài)與分類學(xué)》[27]初步鑒定這4株菌株均為紅曲霉屬（Monascussp.）。

圖8 篩選菌株的細(xì)胞和菌落形態(tài)學(xué)特征Fig. 8 Morphological characteristics of cell and colonies of screened strains

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株H14、H26、H30和H39的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖9。

圖9 基于ITS基因序列4株篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 9 Phylogenetic tree of 4 screened strains based on ITS gene sequence

由圖9可知，菌株H14、H26和H30與佛羅里達(dá)紅曲霉（Monascus floridanus）聚于一簇，親緣關(guān)系最近；菌株H39與紫色紅曲霉（Monascus purpureus）聚于一簇，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株H14、H26和H30均鑒定為佛羅里達(dá)紅曲霉（Monascus floridanus），將菌株H39鑒定為紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。

3 結(jié)論

采用可培養(yǎng)技術(shù)從呈粉紅色的高溫大曲中共分離得到12株紅曲霉菌株，這些菌株雖然同屬，但種/株的理化性質(zhì)差異顯著。通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究其在純培養(yǎng)麥曲、模擬白酒固態(tài)發(fā)酵及強(qiáng)化大曲中的代謝特征，進(jìn)而篩選得到3株優(yōu)良的功能紅曲霉菌株，編號(hào)分別為H14、H26和H30。在純培養(yǎng)麥曲和強(qiáng)化的大曲中，菌株H26產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的能力顯著高于其余菌株，菌株H30的酯化力和菌株H14的發(fā)酵力分別顯著高于其他菌株。此外，模擬白酒固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株H14不僅有提高基酒產(chǎn)率（7.5%vol）的潛力，其對(duì)糟醅揮發(fā)性組分輪廓也具有改善作用，總揮發(fā)性物質(zhì)含量為33.12 mg/kg。通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株H14、H26和H30均為佛羅里達(dá)紅曲霉（Monascus floridanus）。本研究結(jié)果可為基于應(yīng)用對(duì)象的目標(biāo)產(chǎn)物的功能菌株篩選提供了可借鑒的策略，也為基于紅曲霉菌擾動(dòng)改善高溫大曲的性能提供了理論支撐。