一株粉狀米勒氏酵母的耐受性及所產揮發(fā)性風味物質研究

張 霞，雷學俊，王曉妹，盧彥坪，李站勝，趙 東，2，李俁珠，鄭 佳，2*

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000）

粉狀米勒氏酵母（Millerozyma farinose）屬于畢赤酵母屬（Pichia）[1]，廣泛分布于白酒酒醅[2]、包包曲[3]、醬油[4]、泡菜[5]、大豆醬[6]中。藍翔等[7]從發(fā)酵醬油中篩選到一株可將組胺高效降解為氨類物質的Millerozyma farinose，此菌株在發(fā)酵魚露中也表現(xiàn)出良好的降胺能力，發(fā)酵60 d時生物胺降解效率最高可達57.13%，具有廣泛的應用前景。李瑩等[8]從特香型白酒酒醅中篩選出一株Millerozyma farinose，并對其進行乙醇耐受適應性進化研究，最終獲得1株最高可耐受體積分數13%乙醇的Millerozyma farinosaNCUF 304.1-1。王靖雯等[9]從高鹽稀態(tài)醬醪中篩選出一株Millerozyma farinose，因其繁殖代謝會大幅提高醬油中2-辛酮、2-壬酮和1,2,3-三甲氧基苯的含量，所以對醬油風味具有負面影響。張霞等[10]從濃香型白酒釀造環(huán)境中分離出一株Millerozyma farinose，保藏編號為CGMCC No.22621，通過五糧粉液態(tài)靜置發(fā)酵和五糧粉固態(tài)模擬窖池發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵產物中均有濃郁的蠟香和柑橘香的復合氣味。

目前，在濃香型白酒釀造的多個環(huán)節(jié)中均已發(fā)現(xiàn)粉狀米勒氏酵母（Millerozyma farinose）[2，3，10]，但其能否利用糟醅進行發(fā)酵以及其在白酒釀造中的作用還鮮見報道。濃香型白酒發(fā)酵后期窖池內部呈現(xiàn)出對微生物生長發(fā)酵不利的環(huán)境，酵母作為白酒發(fā)酵中常用的菌株之一，在發(fā)酵過程中，自身代謝易受環(huán)境的影響，對脅迫環(huán)境的耐受性直接影響到發(fā)酵程度、發(fā)酵結果、代謝產物，最終影響白酒的品質[11]。對脅迫環(huán)境耐受性能強的酵母菌在發(fā)酵過程中具有更強的競爭力，因此了解菌株的耐受性能更好地掌握其能否適應濃香型白酒窖池環(huán)境。為了探究粉狀米勒氏酵母（Millerozyma farinose）在濃香型白酒糟醅環(huán)境中的適應性，本研究以分離自濃香型白酒釀造環(huán)境中的一株Millerozyma farinose為研究對象，對其耐受性及風味物質代謝情況進行分析，旨在考察該菌能否適應濃香型白酒窖池環(huán)境并利用糟醅進行發(fā)酵，為研究粉狀米勒氏酵母在濃香型白酒釀造窖池中的發(fā)酵提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

五糧粉（高粱、大米、糯米、玉米和小麥）、糧食糟和丟糟：五糧液股份有限公司釀酒車間；粉狀米勒氏酵母（Millerozyma farinose）WLY-Y-91：分離自濃香型白酒釀造環(huán)境中，保藏于本實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[12]：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體中添加瓊脂20 g/L。

五糧粉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：水煮沸，按照五糧粉與水質量體積比為1∶10加入五糧粉，煮至稀粥狀，冷卻；五糧粉糖化液中加入1.80%液化酶，65 ℃保溫3 h；再加入1.80%糖化酶，62 ℃保溫3 h；過濾，將糖度調至12～13°Bx；121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；4-辛醇（色譜純）：德國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TG-WAX毛細管色譜柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Thermo公司；57330-U固相微萃取手柄、50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭：美國Supelco公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；5810R離心機、22331 Hamburg分光光度計：德國Eppendorf公司；FE28 pH計：德國WTW公司；BPC-250F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91生長曲線的測定

參照馬勇等[14]的方法采用分光光度計比濁法測定粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的生長曲線，確定菌體生長規(guī)律。將粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91接種于YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)16 h作為種子液。將種子液以1%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)，分別在0、4 h、8 h、12 h、24 h、28 h、32 h、36 h、48 h、54 h、59 h取菌液測定其OD600nm值，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基作為空白對照，重復3次，結果取其平均值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制菌株WLY-Y-91生長曲線。

1.3.2 耐受性研究[15-18]

將粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min條件下活化培養(yǎng)到對數生長期（OD600nm值=1.8），將種子液按5%（V/V）的接種量接種到含有不同體積分數乙醇（14%、15%、16%、17%）、不同質量濃度NaCl（150 g/L、160 g/L、170 g/L、180 g/L、190 g/L、200 g/L）、不同pH值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）及不同葡萄糖質量濃度（400 g/L、500 g/L、600 g/L、700 g/L、800 g/L、900 g/L、1 000 g/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h，采用分光光度計測定OD600nm值，考察粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的乙醇、NaCl、pH及葡萄糖耐受性。以5%（V/V）的接種量接種到YPD液體培養(yǎng)基中，在不同培養(yǎng)溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）下培養(yǎng)48 h，采用分光光度計測定OD600nm值，考察粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的高溫耐受性。

1.3.3 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的發(fā)酵

液態(tài)發(fā)酵：將種子液以5%（V/V）的接種量分別接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基和50 mL五糧粉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃靜置培養(yǎng)72 h。

模擬白酒固態(tài)發(fā)酵：將種子液以10%（V/V）的接種量分別接種至濃香型白酒糧食糟和丟糟中，混勻，密封，分別置于28 ℃靜置培養(yǎng)70 d和30 d，同時以未接種的糧食糟和丟糟為空白對照。

1.3.4 模擬白酒固態(tài)發(fā)酵糟醅理化指標的檢測

參照文獻[19]對糟醅的水分、酸度、殘留淀粉含量（殘淀）和殘留總糖含量（殘?zhí)牵┻M行檢測。其中酸度表示10 g糟醅消耗1 mmol NaOH標準液體的毫摩爾數，以“mmol/10 g”表示。

1.3.5 揮發(fā)性風味物質的測定

液態(tài)發(fā)酵結束后，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，備用。固態(tài)發(fā)酵結束后，取樣品與體積分數10%乙醇按體積比1∶1混勻，振蕩30 min，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，參照文獻[20]采用頂空固相微萃?。╤ead space solid phase microextraction，HS-SPME）結合GC-MS法測定揮發(fā)性風味物質成分。

1.3.6 數據分析

每個試驗重復3次，利用Excel 2010軟件處理數據，結果用“平均值±標準差”表示，采用Origin 2021軟件進行方差分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的生長曲線

粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91在YPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖1。由圖1可知，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91在發(fā)酵0～12 h時處于延滯期，發(fā)酵12～48 h時處于對數生長期，發(fā)酵48 h之后進入穩(wěn)定期。

圖1 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Millerozyma farinose WLY-Y-91

2.2 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的耐受性分析

粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91對不同環(huán)境的耐受性見圖2。

圖2 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91的耐受性測定結果Fig. 2 Results of tolerance tests of Millerozyma farinose WLY-Y-91

高濃度的乙醇會結合到酵母細胞膜的疏水區(qū)，降低疏水性的相互作用，導致酵母蛋白變性，細胞膜破裂，降低酵母細胞的生存率終止發(fā)酵[21]。濃香型白酒發(fā)酵窖池在發(fā)酵后期主要進行無氧發(fā)酵，乙醇含量高達5%左右[22]。因此酵母菌對乙醇的耐受性格外重要，可耐受高濃度乙醇的酵母菌在白酒發(fā)酵中更占優(yōu)勢[23]。由圖2A可知，當乙醇體積分數為16%時，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵液的OD600nm值為0.13，而當乙醇體積分數為17%時，OD600nm值幾乎為零，說明粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91最高可耐受乙醇體積分數16%。

酵母細胞在高鹽環(huán)境下會積累過量有毒陽離子，造成細胞內外較大的滲透壓，使細胞膜因細胞缺水而皺縮[24]，從而影響酵母生長。由圖2B可知，當NaCl質量濃度為190 g/L時，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵液的OD600nm值為0.69，而當NaCl質量濃度為200 g/L時，OD600nm值為0.19，幾乎不生長，說明粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91最高可耐受NaCl質量濃度190 g/L。

低pH值會改變細胞壁結構，使質膜喪失完整性，從而影響酵母菌的生長和發(fā)酵代謝功能[25]。濃香型白酒發(fā)酵中后期窖池內兼性厭氧或厭氧菌大量繁殖，尤其是乳酸菌，產生大量乳酸，使得窖池內酸度越來越高[26]，酸度可高達5 mmol/10 g左右[27]，因此，酵母菌耐受高酸能力尤顯重要。由圖2C可知，當pH為2.0時，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵液的OD600nm值為0.48，生長狀態(tài)較差，因此，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91可耐受的最低pH為2.0。

酵母菌可以利用葡萄糖作為主要碳源，但葡萄糖質量濃度過高會引起高滲透壓脅迫，使酵母細胞失水皺縮，影響細胞膜上的蛋白質活性和離子通道，進而抑制酵母菌的生長代謝[28-29]。由圖2D可知，當葡萄糖質量濃度為900 g/L時，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵液的OD600nm值為2.65，而當葡萄糖質量濃度為1 000 g/L時，OD600nm值為0.77，幾乎不生長，說明粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91最高可耐受的葡萄糖質量濃度為1 000 g/L。

濃香型白酒發(fā)酵過程中，窖池內溫度可高達35 ℃，一般適宜酵母菌生長的溫度范圍為25～30 ℃[30]，高溫會使蛋白或脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）變性，破壞酵母菌細胞膜的結構和功能，從而抑制酵母的生長[31]。因此，對高溫環(huán)境有很好耐受性的酵母菌可以更好地適應發(fā)酵環(huán)境。由圖2E可知，當培養(yǎng)溫度為45 ℃時，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵液的OD600nm值為14.96，生長良好，而當培養(yǎng)溫度升至50 ℃時，OD600nm值為1.26，生長變緩，說明粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91最高可耐受的溫度為50 ℃。

2.3 液體發(fā)酵揮發(fā)性風味物質分析

酵母在發(fā)酵過程中能產生一些代謝產物，如高級醇類、酸類、酯類、酚類、吡嗪類等，這些物質決定著白酒的風格[32]。因五糧液釀造原料是五種糧食混合物，先將菌株WLY-Y-91接種至五糧粉糖化液中研究其能否產生白酒有益風味物質。菌株WLY-Y-91在YPD和五糧粉液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)3 d后，利用HS-SPME-GC-MS檢測其發(fā)酵液中揮發(fā)性風味物質成分，結果見表1。

表1 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91液體發(fā)酵揮發(fā)性風味物質GC-MS分析結果Table 1 Volatile flavor substances in liquid-state fermentation of Millerozyma farinose WLY-Y-91 analyzed by GC-MS

由表1可知，從兩種發(fā)酵液中共檢出56種揮發(fā)性風味成分，包括10種酯類、12種醇類、9種酸類和25種其他微量成分。其中15種在兩種發(fā)酵液中均被檢出，包括2-庚醇、2-十一醇、十二醇、乙酸、壬酸、苯甲酸和高級脂肪酸酯類等，4-乙烯基愈瘡木酚呈發(fā)酵香氣，略帶甜味，微帶酚的氣息，是決定酒類、醬油、茶葉、咖啡、干酪等食品品位及質量的一個主要香味成分[33]。趙東等[34]首次在國內白酒中檢測出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。

五糧粉發(fā)酵液中特有的揮發(fā)性風味成分有18種，包括丙酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等酸類，異丁醇、4-辛醇、2,3-丁二醇、2-壬醇、2-戊醇等醇類，乙酸乙酯、2,3-丁二醇二硝酸酯、癸酸乙酯等酯類，此外還檢測到乙偶姻，乙偶姻具有特殊奶油香氣，是白酒微量風味的重要組成成分，也是多種微生物糖代謝的中間產物[35-36]。YPD發(fā)酵液中特有的揮發(fā)性風味成分有23種，主要是吡嗪類物質，吡嗪類物質具有明顯的焦香或烤堅果香味，是白酒中含氮微量成分，同時也是白酒香氣成分的重要組成物質[37]。綜上，粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91在YPD和五糧粉糖化液中均能產生白酒重要香味成分，在五糧粉糖化液中能夠產生更多的酯類物質，更有益于濃香型白酒生產。

2.4 模擬白酒固態(tài)發(fā)酵

2.4.1 糟醅的理化指標分析

糟醅的理化指標測定結果見圖3。由圖3可知，糟醅的水分含量均＞60%，且粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵糧食糟和丟糟水分含量高于空白對照，分析原因可能是菌株代謝活動產生水分所致；粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵糧食糟的殘淀和殘?zhí)呛浚?0%和0.2%）分別低于空白對照（14%和1.2%），粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵丟糟的殘淀和殘?zhí)呛浚?%和0.2%）也都低于空白對照（8.5%和0.9%），說明菌株利用糧食糟和丟糟繼續(xù)發(fā)酵，利用了其中的淀粉和糖類進行代謝。粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵糧食糟與空白對照組的酸度均在4.00 mmol/10 g糟醅左右；粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91發(fā)酵丟糟的酸度（5.60 mmol/10 g糟醅）高于空白對照組的酸度（4.70 mmol/10 g糟醅），分析原因可能是粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91在利用糧食糟進行發(fā)酵時產生的酸類物質較少，而利用丟糟進行發(fā)酵時更有利于酸類物質的合成和積累。

圖3 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91模擬白酒固態(tài)發(fā)酵糟醅理化指標的測定結果Fig. 3 Determination results of physicochemical indexes of Millerozyma farinose WLY-Y-91 in simulated solidstate fermentation of Baijiu

2.4.2 糟醅的揮發(fā)性風味物質分析

微生物經發(fā)酵能產生風味化合物，將微生物接種于糟醅中可改變糟醅中風味化合物的組成。王松等[38]將人工強化后的長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）應用于復糟酒生產，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵完成后處理組糟醅中乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸異戊酯、β-苯乙醇等風味物質含量上升。簡曉平等[39]將1株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）接種至糟醅中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)此酵母菌可減少糟醅中乙酸、乳酸、異戊醇、苯甲醇、丁酸乙酯和己酸乙酯的生成，可使糟醅中正丁醇、仲丁醇顯著增高。酵母菌代謝產生的揮發(fā)性風味物質主要為醇類和酯類物質，正丙醇、異丁醇、正丁醇和異戊醇屬于高級醇，乙酸乙酯和高級醇均為酵母菌在酒精發(fā)酵時的副產物，對白酒影響比較大，與白酒骨架成分相關[12]。因此，關注菌株WLY-Y-91固態(tài)模擬發(fā)酵糟醅中乙酸乙酯和高級醇含量的變化對進一步研究其能否在濃香型白酒窖池中利用糟醅發(fā)酵產生白酒揮發(fā)性風味物質具有一定的幫助。將菌株WLY-Y-91接種至濃香型白酒發(fā)酵糟醅中，采用GC-MS測定糟醅中的主要揮發(fā)性風味成分，結果見圖4。由圖4可知，菌株WLY-Y-91利用糧食糟和丟糟發(fā)酵均可產生少量的乙酸乙酯和高級醇類，利用糧食糟進行發(fā)酵時，乙酸乙酯、異戊醇及正丙醇含量（3.90 mg/kg、12.30 mg/kg、8.90 mg/kg）分別比糧食糟空白對照（1.60 mg/kg、5.30 mg/kg、7.40 mg/kg）增加143.8%、132.1%、20.3%，而異丁醇和正丁醇含量略微下降。利用丟糟進行發(fā)酵時，乙酸乙酯和高級醇含量均比丟糟空白對照有所增加，其中乙酸乙酯和正丁醇含量（13.70 mg/kg和14.30 mg/kg）增加比例最大，分別為44.2%和55.4%。綜上，菌株WLY-Y-91可利用濃香型白酒糧食糟和丟糟進行發(fā)酵產生白酒重要揮發(fā)性風味成分。

圖4 粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91模擬白酒固態(tài)發(fā)酵糟醅揮發(fā)性風味成分GC-MS分析結果Fig. 4 Volatile flavor substances in solid fermentation of Millerozyma farinose WLY-Y-91

3 結論

粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91具有良好耐受性能，可以耐受乙醇體積分數16%、NaCl 200 g/L和葡萄糖1 000 g/L，耐受最高溫度和最低pH值分別為50 ℃、pH2.0，能適應濃香型白酒發(fā)酵環(huán)境。從菌株WLY-Y-91的YPD及五糧粉發(fā)酵液中共檢測出56種揮發(fā)性風味物質，兩種發(fā)酵液中的揮發(fā)性風味物質種類差異較大，共有的揮發(fā)性風味物質有15種；在五糧粉發(fā)酵液中特有的揮發(fā)性風味成分有18種，主要為醇、酯類以及乙偶姻；在YPD發(fā)酵液中特有的揮發(fā)性風味成分有23種，主要為吡嗪類物質，說明菌株WLY-Y-91可以利用五糧粉發(fā)酵產生白酒風味成分。進一步通過實驗室水平模擬白酒固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，接種菌株WLY-Y-91發(fā)酵使糧食糟和丟糟中的殘淀和殘?zhí)呛糠謩e降低25.50%、76.27%和20.52%、90%，乙酸乙酯、正丙醇及異戊醇含量分別升高143.8%、20.3%、132.1%和44.2%、13.89%、32.67%，說明該菌株可以利用糧食糟和丟糟合成揮發(fā)性風味物質乙酸乙酯、正丙醇和異戊醇。這對進一步研究此粉狀米勒氏酵母WLY-Y-91能否在濃香型白酒釀造窖池中進行發(fā)酵提供理論支撐。