王 鑫,彭仕樂,張旭屹,張宏森,毛國濤,謝 慧*,宋安東
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002)
中國秸稈資源豐富,玉米、小麥和水稻等可收集農(nóng)作物的秸稈年產(chǎn)量約7億t。截至2022年10月,全國農(nóng)作物秸稈利用量達6.47億t,綜合利用率為88.1%[1],包括生物降解、飼料加工、氣化、造紙工藝等。目前,美國、日本、丹麥及澳大利亞等國家除了將秸稈用作飼料與能源外,大量的秸稈被以還田的方式作為肥料使用[2]。而我國秸稈資源同樣以肥料化和飼料化利用方式為主,約占所有秸稈利用方式的77.5%[3]。秸稈還田不僅有利于提高土壤有機質(zhì)含量、改善土壤物理結(jié)構(gòu)及促進土壤微生物的生長繁殖,還能夠替代部分化學(xué)氮肥施用,降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本。秸稈還田養(yǎng)分理論當季歸還量(化肥可替代量)年均值近300萬t。利用高溫堆肥發(fā)酵制備有機肥是對秸稈最有效利用的方法之一,其可有效減少因秸稈高強度直接還田所引起的病蟲害加劇的風(fēng)險。
秸稈堆肥的腐熟過程是由多種微生物主導(dǎo)的,對復(fù)雜有機物質(zhì)的生物降解過程[4],也是由各類功能微生物分泌多種酶對其進行生物降解,所以該過程也是一個復(fù)雜的酶學(xué)過程,需要多種酶的協(xié)同作用來完成[5]。在堆肥過程中微生物的變化為:在堆肥初期,細菌和絲狀真菌開始快速分解易降解的有機物(蛋白質(zhì)、淀粉類物質(zhì)、簡單的糖類)并產(chǎn)生大量熱量。當堆體進入高溫時期(50 ℃)后,除部分殘留下來的以及新形成的水溶性有機物繼續(xù)分解外,復(fù)雜有機物(纖維素、半纖維素)也進行了強烈的分解,該階段以高溫微生物活動為主。當堆體溫度達到60 ℃后,嗜熱放線菌(Thermophilic actinomycetes)和芽孢桿菌屬(Bacillus)成為主要菌群,而好熱絲狀真菌幾乎全部停止活動。當堆體溫度達到70 ℃以上,只有好熱芽孢桿菌在活動,其他微生物大量死亡或進入休眠狀態(tài),堆體溫度開始下降,當下降到適當溫度時,休眠狀態(tài)的好熱微生物恢復(fù)生命活動,堆體溫度又會再次上升[6]。因此,使秸稈堆肥高效腐熟的關(guān)鍵在于明晰所采用堆肥材料的結(jié)構(gòu)特性及堆肥過程中各類關(guān)鍵微生物的具體功能。
本文詳細介紹了秸稈降解的功能微生物、高效降解菌劑及其應(yīng)用效果,闡述了多種功能微生物在降解秸稈間的協(xié)同作用,并對多功能秸稈降解菌劑的研究現(xiàn)狀和存在問題進行分析,為今后開發(fā)高效多效秸稈降解菌劑提供了理論基礎(chǔ)。
秸稈中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量高,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,微生物難以利用,因此加快木質(zhì)纖維素的降解是提高堆肥腐熟進程的關(guān)鍵。據(jù)報道,秸稈堆肥中具有木質(zhì)纖維素降解功能的微生物主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等[7-8]。其中,Bacillus在堆肥前期降解纖維素及木質(zhì)素具有主要貢獻[9],而嗜熱真菌在秸稈堆肥過程中對復(fù)雜聚合物具有較強的降解能力,在高溫階段,Aspergillus在真菌群落中占據(jù)主導(dǎo)地位[10]。而ANTUNES L P等[11]研究發(fā)現(xiàn),在高溫堆肥溫度超過65 ℃時很難檢測到真菌,這表明在堆肥高溫階段真菌的降解活性和細菌相比微不足道,因此,細菌是堆肥升溫和高溫階段的主要降解菌,而真菌的降解作用主要集中在冷卻與固化階段。
秸稈分解的主要過程是利用功能微生物對各種有機質(zhì)進行轉(zhuǎn)化,包括以下三個過程:第一階段主要以細菌為主,利用秸稈中的可溶性營養(yǎng)物質(zhì)繁殖,并積累腐殖質(zhì);第二階段則是以真菌的快速分解木質(zhì)素為主;第三階段以放線菌的作用為主,開始對前期積累的腐殖質(zhì)進行分解[12]。
GAVANDE P V等[13]研究發(fā)現(xiàn),厚壁菌門(Firmicutes)中Bacillus在半纖維素的降解中起重要作用,而變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)分別可以促進纖維素和木質(zhì)素的降解。目前針對加速秸稈腐熟研究較多的芽孢桿菌屬,包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliticus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)等[14-18],如表1所示。ZHANG S B等[9]在水稻秸稈堆肥中分別接種暹羅芽孢桿菌(Bacillus siamensis)、B.licheniformis及嗜堿芽孢桿菌(Bacillus basophilus),發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的作用類似于群落演替中的先鋒細菌,在堆肥初期改善堆肥中的微環(huán)境,并使那些資源獲取能力強的微生物大量繁殖,微生物群落分解木質(zhì)纖維素的能力增強從而縮短堆肥周期。李紅亞等[14]通過傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,F(xiàn)TIR)和核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)等分析接種B.amyloliticus后對玉米秸稈降解的影響,發(fā)現(xiàn)接種后的處理組在甲基、亞甲基和羰基的吸收峰強度均低于空白對照,木質(zhì)纖維素分子結(jié)構(gòu)中的主要共價鍵、木質(zhì)素與碳水化合物的連接鍵和碳水化合物中糖環(huán)內(nèi)的共價鍵出現(xiàn)明顯斷裂,說明B.amyloliticus可將玉米秸稈中的多糖結(jié)構(gòu)降解為還原性單糖,并利用這些單糖進行自身的生物代謝。
表1 秸稈堆肥的主要細菌及其作用Table 1 Main bacterial species and their functions in straw composting
表2 秸稈堆肥的主要真菌及其作用Table 2 Main fungal species and their functions in straw composting
目前,能夠降解秸稈的放線菌主要是Streptomyces,其可以產(chǎn)生更高活性的纖維素酶。徐杰等[19]在水稻堆肥中添加灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens),發(fā)現(xiàn)接種S.griseorubens的堆肥在第3天進入高溫期(>45 ℃),高溫持續(xù)17 d。自然堆肥在第4天進入高溫期,高溫僅持續(xù)10 d。木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的大幅降解也發(fā)生在高溫期,分別比自然堆肥提高29.94%、18.78%、12.77%。結(jié)果表明,接種放線菌后不僅顯著延長高溫期,更重要的是加快堆肥中木質(zhì)纖維素的降解。劉曉飛等[20]從寒地黑土腐殖質(zhì)中篩選出一株具有高效降解纖維素能力的放線菌,經(jīng)鑒定該菌株為鏈霉菌(Streptomycessp.),將該菌株接種于玉米秸稈液態(tài)發(fā)酵第7天時的降解率為17.8%。玉米秸稈紅外光譜的結(jié)果表明該鏈霉菌可有效降解玉米秸稈中的纖維素和半纖維素成分。
熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)在秸稈降解方面也起到非常重要的作用。王旭輝等[21]在赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基中添加玉米秸稈纖維素并接種1株P(guān).fluorescens,發(fā)現(xiàn)該菌株對玉米秸稈纖維素的降解率達到45.4%。周俊強等[22]通過濾紙條崩解實驗,發(fā)現(xiàn)P.fluorescens對麩皮和濾紙的降解率分別達到45.0%和33.3%,表明該菌株具有較強的纖維素降解能力。張鑫鵬等[23]在土壤中分離出1株具有纖維素降解能力的假單胞菌(Pseudomonassp.),在油菜秸稈堆肥試驗中,發(fā)現(xiàn)添加該菌株的堆體在第1天就進入高溫階段(>45 ℃),堆體溫度維持在50 ℃以上的時間為26 d,具有堆體升溫快,高溫時間長的特點,從而加快堆肥腐熟并提高堆肥質(zhì)量。
真菌在秸稈堆肥過程中主要起到分解與維持物料穩(wěn)定的作用。相比于細菌,真菌不僅可以分泌能降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的胞外酶,其菌絲還具備機械穿插作用,可以破壞秸稈的天然結(jié)構(gòu),更易降解秸稈,因此在秸稈降解方面受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。
木霉屬(Trichoderma)能夠產(chǎn)生完整的纖維素酶系,具有溶解天然纖維素的作用,同時其屬中被廣泛應(yīng)用在農(nóng)作物產(chǎn)品上的生防菌,對作物生長發(fā)育條件也非常友好。里氏木霉(Trichoderma reedi)、長枝木霉(Trichoderma longiformis)、綠色木霉(Trichoderma viridis)及康氏木霉(Trichoderma koni)等真菌在秸稈的發(fā)酵領(lǐng)域中應(yīng)用較多,如T.reedi可產(chǎn)生多種分解酶來降解秸稈。SARANGI S等[26]在水稻秸稈堆肥中接種里氏木霉NRRIT-26和NRRIT-27,發(fā)現(xiàn)不僅可以提高堆肥品質(zhì),且提高了水稻幼苗的活力及總?cè)~綠素含量。李立波等[15]在玉米秸稈堆肥中接種了一株哈茨木霉(Trichoderma harzianum),固態(tài)發(fā)酵12 d時纖維素酶活達到3.61 FPU/mL,25 d后纖維素降解21.79%,同時T.harzianum還是一種可以抑制土壤及植物病原菌的有益菌[27]。
作為真菌的重要組成部分,曲霉屬(Aspergillus)在提高秸稈堆肥腐熟進程方面同樣發(fā)揮著不可忽視的作用。研究報道,黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、亮白曲霉(Aspergillus albus)等可降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[28-29]。陳露露[30]分析了接種A.fumigatus對玉米秸稈降解的影響,結(jié)果表明,A.fumigatus能分泌β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase,CMCase)、濾紙酶和過氧化氫等多種木質(zhì)纖維素酶,發(fā)酵第60天時秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分別降低了44.78%、33.86%和52.22%,A.fumigatus具備良好的木質(zhì)素降解能力。楊娜等[31]在自然秸稈堆肥樣品中篩選到一株A.niger,經(jīng)測試,其濾紙酶活為17.7 U/mL,β-葡聚糖苷酶活為79.26 U/mL,顯著高于實驗中其他降解菌,具有高效的纖維素降解能力。
青霉菌(Penicilliumsp.)是一種重要的木質(zhì)纖維素降解菌。目前,有關(guān)青霉菌降解木質(zhì)纖維素的研究主要集中在木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶的合成機理與條件優(yōu)化方面。趙玉鑫等[32]在青霉菌(Penicilliumsp.)對玉米秸稈復(fù)合菌系好氧發(fā)酵的影響中發(fā)現(xiàn),接種青霉菌可以有效提高漆酶的活性,從而提高秸稈復(fù)合菌系對木質(zhì)纖維素的降解,但對木質(zhì)素過氧化物酶的活性有不利影響。趙旭等[33]篩選到一株P(guān)enicilliumsp.,其濾紙酶活為29.6 U/mL,纖維素酶酶活為31.5 U/mL,在玉米秸稈降解實驗中發(fā)現(xiàn),接種青霉菌的處理組纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量較空白對照均有減少,最終降解率為29.8%,表明青霉菌在秸稈降解方面具有巨大潛力。
近年來,許多研究人員針對秸稈中木質(zhì)素難以降解的現(xiàn)狀,陸續(xù)分離出了一些木質(zhì)素降解能力極為顯著的微生物。其中白腐菌(Phlebia)是擔(dān)子菌亞門中的一類大型真菌,也是已知能將木質(zhì)素徹底降解為二氧化碳和水的唯一生物。其作用機制是一個以自由基為基礎(chǔ)所進行的鏈式反應(yīng)過程,過氧化物酶、錳過氧化物酶以及木質(zhì)素過氧化物酶對整個反應(yīng)過程的啟動和催化起著關(guān)鍵作用[34]。目前,關(guān)于利用白腐菌加速秸稈降解的研究較多的菌株包括香菇(Lentinus)、云芝(Polystictus)和側(cè)耳(Pleurotus)[35-36]。
秸稈堆肥腐熟過程實際是由多種微生物共同主導(dǎo)的發(fā)酵過程,且微生物菌群的數(shù)量及多樣性會隨堆肥時期的變化而改變[43]。在升溫期,優(yōu)勢菌群包括Bacillus和假單孢菌屬(Pseudomonas)等,該階段內(nèi)易降解的有機物快速分解為二氧化碳和水,難降解的有機物(纖維素、半纖維素及木質(zhì)素)開始緩慢降解[44];進入高溫期后,優(yōu)勢菌群轉(zhuǎn)變?yōu)楦邷仉p歧菌屬(Thermobifida)、Aspergillus、Bacillus等[45];隨著高溫期結(jié)束,堆體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏,該階段的優(yōu)勢微生物活動減弱,堆體溫度下降進入降溫階段及腐熟階段,該階段內(nèi)嗜溫微生物重新占據(jù)主導(dǎo)地位,并開始繼續(xù)分解難降解的有機物,這個時期優(yōu)勢菌群包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、束村氏菌屬(Tsukamurelia)、Bacillus、Streptomyces、小單孢菌屬(Micromonospora)等[46]。孟慶欣[44]在對牛糞玉米堆肥中微生物群落演替的研究中發(fā)現(xiàn),堆肥各個時期中細菌群落的超1(Chao1)指數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并在升溫期達到最大值;辛普森(Simpson)指數(shù)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,說明在堆肥的升溫期,細菌的豐富度和多樣性均顯著提升,進入高溫期后緩慢下降,在腐熟期細菌的多樣性顯著下降,并趨于穩(wěn)定。堆肥過程中微生物的群落演替也表明微生物群落的代謝功能發(fā)生變化,張超[47]在綠豆皮與玉米秸稈混合發(fā)酵的實驗中通過Tax4Fun預(yù)測了細菌操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)的微生物功能,發(fā)現(xiàn)與糖類代謝相關(guān)的序列在堆肥的升溫期豐度最高,與氨基酸代謝相關(guān)的序列在高溫期有顯著提升,并在堆肥后期保持穩(wěn)定,該研究表明氨基酸可以在堆肥中產(chǎn)生,并在高溫期被大量利用。
不同種類的秸稈堆肥的關(guān)鍵功能微生物群落同樣具有差異性,張麗麗[48]通過整合宏組學(xué)技術(shù)對玉米和小麥堆肥過程中的關(guān)鍵功能微生物群落進行研究,發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈堆肥中具有明顯的群落演替情況,而在小麥秸稈堆肥中沒有較明顯的微生物群落演替變化,這是由于小麥秸稈的組分和結(jié)構(gòu)差異造成的,并且未形成以纖維素降解微生物為主導(dǎo)的優(yōu)勢功能群落。黃丹蓮[49]通過對水稻秸稈與蔬菜根莖混合堆肥的醌指紋圖譜進行分析,發(fā)現(xiàn)初始堆肥中含9種醌,高溫期為12種,進入降溫期后,醌的種類增加至17種,說明該堆肥模式下的微生物群落演替主要發(fā)生在高溫期至降溫期階段。上述試驗均表明單一菌種很難在堆肥的各個時期都發(fā)揮出優(yōu)異的降解功能,因此復(fù)合菌劑比單一菌種對加快堆肥腐熟的效果更為顯著。
秸稈高溫復(fù)合降解菌系的研究報道主要集中在玉米、小麥與水稻秸稈,而秸稈低溫復(fù)合降解菌系的報道則主要集中在玉米秸稈,如表3所示。其體系構(gòu)成主要分為三類,第一類是由具有秸稈降解能力的多種細菌構(gòu)成。和真菌相比,細菌如Bacillus具有更快的生長速率及抗逆性(耐酸,耐堿,耐高溫),因此更易于工業(yè)化應(yīng)用[50],并在維持堆肥體系的穩(wěn)定以及加速腐熟方面發(fā)揮重要作用[51];第二類由多種細菌和真菌構(gòu)成,目前大部分秸稈降解菌劑采用這一類,其在堆肥的各個發(fā)酵時期都具有良好的降解特性;第三類是由具有秸稈降解功能的多種真菌構(gòu)成,其優(yōu)勢在于木質(zhì)素的微生物降解過程中真菌占主導(dǎo)地位[52]。秸稈的生物降解需要多種微生物及其分泌出的與降解有關(guān)的酶相互協(xié)同發(fā)揮作用,接種單一菌株很難對秸稈的快速降解產(chǎn)生作用[53],這也是目前所有的秸稈降解菌劑中為何使用細菌與真菌結(jié)合的構(gòu)建策略,因為真菌菌絲對木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的破壞能夠幫助細菌定殖,而細菌對木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的改性則能夠使真菌所產(chǎn)生的纖維素酶更加迅速的降解木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)[54]。除上述三種體系外,目前有學(xué)者將秸稈原有的本土降解菌群與具有秸稈降解能力的功能菌進行組合,陳雪麗等[55]將秸稈降解菌群TF18與B.subtilis、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)和B.amyloliticus組合,與玉米秸稈混合發(fā)酵8 d后,秸稈降解率達到21.3%。王一然等[56]對耐低溫秸稈降解菌群JZ5進行簡化,優(yōu)化過的降解菌群對玉米秸稈降解潛力顯著提高。唐玉等[57]從畜禽糞便和秸稈腐熟物中篩選到5類初始菌群并將這5類菌群相互組配,篩選出高效穩(wěn)定的降解菌群GDS-10,液態(tài)發(fā)酵15 d后玉米秸稈的分解率為63.09%,表明該降解菌群對玉米秸稈有高效的降解能力。
表3 秸稈堆肥中復(fù)合菌劑的組成及應(yīng)用效果Table 3 Composition and application effect of compound bacterial agents in straw composting
前人對秸稈發(fā)酵復(fù)合菌劑的研究較多,但大多只關(guān)注其對秸稈的降解能力,隨著微生物技術(shù)的發(fā)展,一些學(xué)者在秸稈降解菌劑的基礎(chǔ)上添加具有其他功能的微生物,使菌劑同時具有兩種及兩種以上的功能[57-59]。目前,關(guān)于此類復(fù)合菌劑的研究大多以雙功能菌劑為主,其功能大致分為以下幾類,第一具有促產(chǎn)特性的降解菌劑;第二具有生防特性的降解菌劑;第三具有環(huán)保特性的降解菌劑。馬志遠等[59]在秸稈降解復(fù)合菌系中添加生防菌構(gòu)建復(fù)合菌系,分析該復(fù)合菌劑對秸稈腐熟進程及對番茄生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),噴灑復(fù)合菌劑的處理組較噴灑清水的對照組提前4 d完全腐熟;秸稈還田時施加復(fù)合菌劑可以促進番茄生長,對番茄灰霉病的防治效果達到27.92%。袁洋等[60]構(gòu)建出一種多功能復(fù)合型微生物菌劑,接種后可有效縮短堆肥發(fā)酵周期,菌肥還田后在番茄上增產(chǎn)顯著,增產(chǎn)率為7%。楊艷銘[61]通過對篩選到的高效秸稈降解菌的抗病特性及促生特性進行研究,獲得2株同時具備高效秸稈降解、抗病及促生功能的菌株,利用酶活互補關(guān)系將其構(gòu)建為復(fù)合菌劑,水稻堆肥試驗結(jié)果表明,接種菌劑提高了高溫期持續(xù)時間,60 d后纖維素和半纖維素降解率分別為48.59%和38.53%,顯著高于空白對照,有效的促進了堆肥腐熟進程。
然而有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合菌劑中菌株組合的降解效果并非是簡單的疊加效應(yīng)[72],秸稈降解菌的豐富度并非越多越好,菌株之間可能存在一定的拮抗作用或資源競爭,從而減弱了復(fù)合菌劑對秸稈的降解效果[73],所以在構(gòu)建復(fù)合菌劑時需考慮各菌株在不同時期以及對秸稈的不同成分的降解效果。
秸稈是沒有被完全合理利用的寶貴資源,在我國華中地區(qū),玉米及小麥秸稈資源產(chǎn)量巨大。通過堆肥的方式將秸稈肥料化可以使其快速腐熟還田養(yǎng)土,而秸稈降解菌劑的添加不僅可以加速秸稈腐熟的過程,還田后不同程度的增加土壤中的總氮、總磷、總鉀和有機質(zhì)的含量,同時土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及活性也相應(yīng)發(fā)生顯著變化,為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的無害化處理資源化利用提供了良好的條件。但目前市面上的大部分微生物菌劑功能較為單一,在堆肥成本增加的同時,其實際應(yīng)用效果遠低于化肥與農(nóng)藥的共施,秸稈肥料化尚不能得到廣泛的應(yīng)用。因此,高效且多效的微生物菌劑在秸稈肥料化方面具有良好的市場前景。
作為未來應(yīng)用較多的高效多效秸稈降解菌劑,不僅需要滿足使秸稈堆肥快速腐熟的前提,還需發(fā)揮出其余一些有益功能,如減緩堆體氮素流失、生物防治、減少有害氣體排放和作物增產(chǎn)等;充分做到加速腐熟、以菌治污、以菌治蟲、以菌治菌,減少化學(xué)肥料、殺蟲劑和殺菌劑的使用,可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的良性發(fā)展做出突出貢獻。
秸稈堆肥過程是由具有秸稈降解能力的功能微生物主導(dǎo)的發(fā)酵過程。為滿足高溫堆肥技術(shù)標準以及縮短秸稈堆肥堆制周期,獲取秸稈降解的功能微生物和構(gòu)建高效秸稈降解菌劑成為關(guān)鍵因素。前者以篩選具有木質(zhì)纖維素降解能力的微生物為手段,以降解酶合成機理和優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件為主要研究方向,同時優(yōu)化選擇出具備生物安全性及工業(yè)生產(chǎn)條件的菌株,為秸稈降解菌劑的構(gòu)建提供更多選擇;后者以構(gòu)建多菌種協(xié)同作用的秸稈降解菌劑為手段,以菌株間相互關(guān)系和添加配比為主要研究方向,細化出各菌株發(fā)揮最佳作用的時間段,同時應(yīng)注意菌株間的拮抗關(guān)系、適用地區(qū)及秸稈類型。整體看來,基于對秸稈降解功能微生物及高效秸稈降解菌劑研究的逐漸深入,必將促進我國秸稈肥料化技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。