微生物合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮的研究進(jìn)展

宋金鵬，仲秀芳，李學(xué)思，曹振華，彭新輝，范光森*

（1.德州市纖維檢驗所，山東 德州 253000；2.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京 100048；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450046；4.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265；5.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，湖南 長沙 410000）

4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H）-furanone，HDMF），商品名稱為呋喃酮，又名草莓酮或菠蘿酮，廣泛分布于自然界中，如在草莓、菠蘿、橙桔、黑莓、葡萄、芒果、覆盆子等水果中都有檢測出HDMF。另外，在牛肉清湯、新烤面包、炒杏仁、炒榛子、葡萄酒、白蘭地酒、爆玉米花、咖啡、木材和煙等眾多產(chǎn)品中也有HDMF的發(fā)現(xiàn)[1-4]。HDMF香氣復(fù)雜，是一種具有類似麥芽酚強(qiáng)烈焙烤焦糖氣的雜環(huán)香料，在低質(zhì)量濃度時呈現(xiàn)清香的草莓、菠蘿的香氣特征，高質(zhì)量濃度時呈現(xiàn)焦糖味，同時具有濃郁的水果香氣及果醬味[5-6]。HDMF香氣閾值很低，為0.04 μg/L，香味強(qiáng)度分別為麥芽酚和乙基麥芽酚的12.5倍和2.5倍，增香效果明顯，且香味持久，是一種優(yōu)良的甜味香料和增香劑，廣泛被用作食品、煙草和飲料等產(chǎn)品中的增香劑，是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》、美國食用香料與提取物制造者協(xié)會（the flavor and extract manufacturers association of the United States，F(xiàn)EMA）（登記號3174）和歐洲理事會（Council of Europe，COE）（登記號536）認(rèn)可允許使用的安全食用香料，并被業(yè)界冠以“香料之王”的美稱[1，4，7-9]。

鑒于HDMF閾值低、香勢好和特征性強(qiáng)等優(yōu)良呈香特性，市場對HDMF的需求量越來越大。然而，天然產(chǎn)物中HDMF的含量很少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足迅速發(fā)展的香料及其他工業(yè)的需要，而當(dāng)前普遍采用的化學(xué)合成法則由于存在合成步驟多、純度不高、產(chǎn)品香氣特征不佳且有溶劑及其他中間產(chǎn)物殘留等問題，在一些產(chǎn)品中，尤其是崇尚天然的食品中的應(yīng)用受到限制。通過生物方法，即利用微生物的代謝合成HDMF成為了一種趨勢[6]。為此，本文將對HDMF的研究現(xiàn)狀，尤其是微生物法合成HDMF的現(xiàn)狀進(jìn)行簡述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 HDMF的應(yīng)用

因其獨特的感官特性，HDMF在食品、煙草和化妝品等產(chǎn)品中都有著廣泛的應(yīng)用，具有明顯增香和增味的作用。如在成品啤酒中，具有焦糖和烘烤香的HDMF含量遠(yuǎn)高于其風(fēng)味閾值，對啤酒風(fēng)味有著顯著貢獻(xiàn)，是啤酒呈現(xiàn)麥芽香的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]；在黍米黃酒中，HDMF有較高的香氣活力值，對黃酒香味貢獻(xiàn)較為明顯，尤其是在半甜、甜型的黍米黃酒中能顯著增加產(chǎn)品中的焦甜香味[11]；在葡萄酒中，HDMF則與4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）-furanone，HEME）共同賦予葡萄酒的果味和焦糖味[12-13]；在醬油中，HDMF是重要的特征風(fēng)味物質(zhì)，為醬油貢獻(xiàn)焦糖香味和醬香味[14]；HDMF在茶香中也具有重要的作用，是茶烘焙過程中具有獨特甜味和焦糖香的主要貢獻(xiàn)者[15]；HDMF在煙草產(chǎn)品中可以提高煙草口感和香味品質(zhì)，是卷煙主流煙氣中焦甜香關(guān)鍵成分之一[16]；除此之外，HDMF還有屏蔽不愉快味道、抗菌抑菌、預(yù)防白內(nèi)障、抑制黑色素等功能[17-20]，如HDMF可用來調(diào)配食用香精，在牛肉香精中添加HDMF可增加焦甜香，對牛肉整體風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)，模擬出的烤牛肉香精和實際樣品香氣相似度達(dá)90%以上[21-22]；GULE N P等[23]則采用含HDMF的聚乙烯醇制備了具有良好抗菌和抑菌作用的納米纖維膜；DEVADAS S M等[24]將HDMF用作涂層生物材料，降低了醫(yī)療器械的相關(guān)感染；LEE J等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HDMF可以通過抑制環(huán)磷酸腺苷信號通路來抑制黑色素生成，推測HDMF可有效抑制色素的過度沉著，應(yīng)用于皮膚美白產(chǎn)品中。

2 HDMF的檢測

HDMF存在于許多產(chǎn)品中，對這些產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)有著重要的作用，甚至成為衡量這些產(chǎn)品品質(zhì)以及品種的重要參數(shù)，有必要對這些產(chǎn)品中HDMF含量進(jìn)行測定。另外，在HDMF生產(chǎn)合成過程中，也需要對其含量進(jìn)行檢測，以此評估該合成方法的效率。因此，建立有效的HDMF檢測方法十分重要。

2.1 前處理

雖然HDMF廣泛存在于多種水果、食品、煙草和化妝品中，但其含量都比較低，并且這些產(chǎn)品中還存在著其他復(fù)雜的成分。因此，對這些產(chǎn)品中HDMF的含量進(jìn)行檢測十分困難，需要對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚恚拍苡行У販?zhǔn)確檢測到這些產(chǎn)品中HDMF的含量。另外，在以微生物法合成HDMF中，其含量也往往較低，并且發(fā)酵體系中同樣存在著較復(fù)雜的其他代謝產(chǎn)物，對其含量的檢測產(chǎn)生干擾，為此，也需要預(yù)先對發(fā)酵液進(jìn)行前處理。目前，檢測HDMF常用的前處理方法主要為液液萃取和頂空-固相微萃取等。

液液萃取適用于所有沸點范圍的化合物，雖然費時、污染、浪費等問題突出，但萃取成本低、重現(xiàn)性好，是測定食品、煙草等產(chǎn)品中HDMF含量有效的前處理方法[25]。WANG X J等[26]采用液液萃取方法對5種高鹽稀態(tài)醬油進(jìn)行前處理，結(jié)合全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析表明，HDMF是醬油中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物；張增顯[27]采用液液萃取法前處理啤酒，并檢測了萃取物中的甜味化合物，結(jié)果表明，HDMF對啤酒焦糖甜味和香味具有重要作用。

頂空-固相微萃取利用吸附/脫附技術(shù)富集樣品中的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分，無需有機(jī)溶劑、所需樣品量少、靈敏度高且可直接與氣質(zhì)聯(lián)用儀或液相色譜儀聯(lián)用，是檢測樣品中HDMF含量的一種有效的前處理方法。如，VAN DE CANS M G等[28]利用頂空固相微萃取法對特種麥芽中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行前處理，后采用氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDMF是麥芽呈焦糖味的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)之一。

2.2 檢測方法

當(dāng)前，有關(guān)HDMF的檢測主要是氣相色譜法和高效液相色譜法。氣相色譜法適合分析揮發(fā)性物質(zhì)，常與質(zhì)譜、三重四級桿質(zhì)譜、嗅聞技術(shù)聯(lián)用，在對樣品中HDMF定性和定量分析方面具有靈敏度高和精密度好的特點，是分析檢測HDMF含量的主要方法。張海林等[9]采用氣相色譜方法對酵母菌發(fā)酵產(chǎn)HDMF進(jìn)行了定量測定；張澤宇等[29]采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析了儲存期間熱反應(yīng)香味料的香辛料香氣屬性，結(jié)果表明HDMF與其香氣屬性具有強(qiáng)相關(guān)性，是區(qū)分熱反應(yīng)香味料是否添加香辛料的關(guān)鍵化合物之一。雖然氣相色譜法在檢測樣品中HDMF含量時需要對樣品進(jìn)行前處理，不能直接進(jìn)樣，但十分適合于食品等復(fù)雜體系中風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測。

高效液相色譜法是一種普及性好，簡便易操作，靈敏度高，分析速度快，樣品處理相對簡單，選擇性好的方法，也常被用于檢測樣品中HDMF含量，尤其是在合成HDMF產(chǎn)物含量的檢測中。如王鵬霄等[30-31]在研究產(chǎn)呋喃酮酵母菌分離和發(fā)酵條件優(yōu)化時，都采用了高效液相法對其含量進(jìn)行檢測，但在具體方法參數(shù)上存在一定差異，這主要與其所選用的色譜柱不同有關(guān)。高效液相色譜法無需對樣品進(jìn)行前處理即可檢測其中HDMF含量，但對于含量極少且成分非常復(fù)雜的樣品則可能受限于其檢測靈敏度及色譜柱的分離效果而無法采用。

3 HDMF的生產(chǎn)方法

HDMF生產(chǎn)方法有天然提取、化學(xué)合成和生物合成3種[32]。

3.1 天然提取

1965年，RODIN J O等[4]首次在菠蘿中發(fā)現(xiàn)并用乙醚萃取方法分離出了呋喃酮，呋喃酮類化合物在食品風(fēng)味中的重要性引起了關(guān)注。呋喃酮廣泛存在于多種植物體內(nèi)，主要以四種形式存在：4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-羥基-2,5-二甲基-2H-呋喃-3-酮葡糖苷、4-羥基-2,5-二甲基-2H-呋喃-3-酮6'-O-丙二?；?β-D-吡喃葡萄糖苷和游離糖苷元，因此，可以從含有HDMF的菠蘿、草莓等蔬菜水果中直接提取和分離[2，33]。但是，由于植物體內(nèi)呋喃酮含量均較低，分離、提取困難且成本較高，無法滿足當(dāng)前工業(yè)應(yīng)用中對HDMF的需求量。

3.2 化學(xué)合成

1966年，HENRY D W等[34]采用化學(xué)合成方法獲得了HDMF，后續(xù)圍繞化學(xué)合成HDMF開展了大量的科學(xué)研究，開發(fā)出了多種化學(xué)合成HDMF的方法，如以化學(xué)合成原料的來源不同分為：①以烯醇和炔醇為原料；②以丙酮醛為原料；③以3,4-己二酮及其鹵化物為原料；④以有機(jī)羧酸以及羧酸酯為原料；⑤以呋喃類及吡喃類化合物為原料；⑥以糖類化合物為原料（圖1）[5，7，35-36]。

圖1 2,5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮的化學(xué)合成方法Fig. 1 Chemical synthesis methods of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone

由于化學(xué)合成方法合成速率快，所以目前一般采用此方法生產(chǎn)HDMF。但隨著人們生活水平的提高，人們越來越崇尚天然制品?；瘜W(xué)合成方法存在的眾多弊端，諸如合成步驟較多、得率低、生產(chǎn)成本仍較高、尤其是污染物排放量大、產(chǎn)物香氣特征不佳及存在溶劑殘留等問題日益顯現(xiàn)，不符合人們對當(dāng)前產(chǎn)品質(zhì)量的高要求，特別是將其應(yīng)用于食品產(chǎn)品中[11]。

3.3 生物合成

按照歐洲和美國食品法規(guī)的規(guī)定，生物技術(shù)法生產(chǎn)的HDMF與從蔬菜水果中提取獲得的HDMF一樣，也屬于“天然的”HDMF，與化學(xué)合成的HDMF相比，該方法獲得HDMF不僅香氣純正濃厚、香韻好、品質(zhì)高，而且安全性更好，具有不可替代性，逐漸成為生產(chǎn)天然HDMF主流趨勢，受到眾多研究者的關(guān)注[6，32-33]。目前，生物合成法生產(chǎn)HDMF的研究尚處于探索階段，主要用微生物模擬植物次級代謝產(chǎn)HDMF為主，集中于篩選產(chǎn)HDMF微生物菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化等相關(guān)研究。除此之外，也有少量研究側(cè)重于微生物合成HDMF的機(jī)制研究，探究其代謝途徑[9，30-31]。目前研究發(fā)現(xiàn)，能夠代謝合成HDMF的微生物種類比較少，且產(chǎn)量普遍偏低，所利用的培養(yǎng)基成本相對較高，尚不能滿足市場對天然HDMF的需求量。但相比天然提取而言，其產(chǎn)量相對較高，且步驟簡單，是滿足人們對天然HDMF需求量日益增加的有效方法。為此，應(yīng)加強(qiáng)高產(chǎn)HDMF菌種的研究，尤其是利用廉價培養(yǎng)基篩選高產(chǎn)HDMF菌種和優(yōu)化發(fā)酵條件，并解析其形成HDMF的代謝途徑及關(guān)鍵酶，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)改造和構(gòu)建高產(chǎn)HDMF的工程菌株，從而提高微生物合成HDMF的能力。

4 合成HDMF的微生物種類

起初，研究者認(rèn)為醬油等食品中的HDMF形成于生產(chǎn)制造過程中的美拉德反應(yīng)，但隨著在更多有酵母菌和乳酸菌參與發(fā)酵的食品中（如啤酒、味噌和奶酪等）檢測出HDMF，研究者們逐漸意識到微生物在食品HDMF的形成中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，某些昆蟲、酵母菌和細(xì)菌在固定培養(yǎng)基中或特定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可通過次級代謝合成呋喃酮類化合物。目前，國內(nèi)外有關(guān)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)HDMF的研究仍相對較少，已報道能夠產(chǎn)HDMF的微生物種類不多，主要有魯氏酵母（Zygosaccharomycessp.）、畢赤酵母（Pichiasp.）和乳酸菌等，并且主要集中于酵母菌株（表1）。由表1可知，在已有報道微生物中，其所產(chǎn)HDMF含量普遍較低，且發(fā)酵培養(yǎng)中普遍含有1,6-二磷酸果糖（fructose-1,6-diphosphate，F(xiàn)DP）前體物質(zhì)。

表1 合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮的微生物Table 1 Microorganisms for synthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone

4.1 魯氏酵母

在研究醬油HDMF的形成機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，醬油釀造期間魯氏酵母可通過次級代謝作用產(chǎn)生HDMF，在醬油獨特風(fēng)味的形成中發(fā)揮著積極的作用[47-50]?；诖吮尘?，科研人員加強(qiáng)了對魯氏酵母產(chǎn)HDMF的研究，相關(guān)研究主要是從不同醬油釀造環(huán)境中篩選獲得魯氏酵母，并對其發(fā)酵產(chǎn)HDMF條件進(jìn)行優(yōu)化，如DAHLENT等[38，51]優(yōu)化了魯氏酵母產(chǎn)HDMF的培養(yǎng)基組成，在添加10 g/LD-葡萄糖、80 g/L FDP、50 g/L CaCl2和120g/LNaCl的培養(yǎng)基中產(chǎn)HDMF最高，約為35mg/L；周亞男[39]優(yōu)化了高密度發(fā)酵產(chǎn)呋喃酮風(fēng)味物質(zhì)的培養(yǎng)條件，結(jié)果表明當(dāng)接種量為5×108CFU/mL、FDP添加量為120 g/L、NaCl添加量為180 g/L、培養(yǎng)5 d時，HDMF產(chǎn)量最高，為6.77 mg/L；HECQUET L等[37]研究則表明，魯氏酵母在添加10%的FDP和5%D-葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵11 d，培養(yǎng)基中HDMF的質(zhì)量濃度達(dá)到最高，約為80 mg/L（表1）。由上述可見，魯氏酵母是產(chǎn)HDMF的主要微生物菌種，也是研究微生物產(chǎn)HDMF最早的菌種，有關(guān)微生物產(chǎn)HDMF的相關(guān)機(jī)制也主要是基于此菌種開展的，但總體而言，該菌株所產(chǎn)HDMF能力有限，且相關(guān)研究多在以高價格的FDP為底物的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，發(fā)酵成本較高。

4.2 畢赤酵母

畢赤酵母是另一類能代謝合成HDMF的酵母，早期研究發(fā)現(xiàn)該酵母可以轉(zhuǎn)化L-（+）-鼠李糖代謝合成HDMF，如莢膜畢赤酵母（Pichia capsulata）在含有鼠李糖和酪蛋白培養(yǎng)基中可以產(chǎn)HDMF，產(chǎn)量最高約為2 mg/L[52]。另外，該酵母菌屬也可利用FDP或果糖產(chǎn)HDMF，如從酒曲中分離篩選獲得的季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）SX-21，在高濃度的NaCl和FDP培養(yǎng)基中，其產(chǎn)量為100 mg/L，而從菠蘿、草莓等水果中分離篩選到的畢赤酵母在含有D-果糖的培養(yǎng)基中也能產(chǎn)HDMF，產(chǎn)量可達(dá)6.84 mg/L[9，30]。值得注意的是，已報道最高產(chǎn)HDMF的菌株是該菌屬中的一株突變株，即經(jīng)亞硝基胍誘變季也蒙畢赤氏酵母的突變株，在含400 g/LFDP的培養(yǎng)基中HDMF產(chǎn)量高達(dá)700 mg/L以上（表1）[43]。

4.3 乳酸菌

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱，許多乳酸菌被公認(rèn)為安全的食品級微生物，在部分發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中能促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的形成。有研究表明，在含有瑞士乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus）的氨基酸脫脂牛奶培養(yǎng)基中檢測到HDMF，推測該菌株能產(chǎn)HDMF[53]，在后來的研究結(jié)果中也證實了該推測，瑞士乳酸桿菌和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）在乳清粉水懸液中都能產(chǎn)HDMF，培養(yǎng)7 d后分別產(chǎn)598 μg/L和427 μg/L[45]；廣泛用于乳酪生產(chǎn)的菌種-乳酸乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus lactissubsp.cremoris）在含有谷氨酸鈉和核糖或半乳糖培養(yǎng)基中均有HDMF產(chǎn)生，且在添加半乳糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)量較高，培養(yǎng)3 d時產(chǎn)量可達(dá)到1.17 mg/L（表1）[46]。

綜上可見，目前天然微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)HDMF的菌種種類較少，主要是魯氏酵母，其次為畢赤酵母和乳酸菌，并且所產(chǎn)HDMF能力都較低，通過微生物發(fā)酵法尚不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對HDMF的需求。但隨著對產(chǎn)HDMF微生物菌株研究的重視，將會有越來越多產(chǎn)HDMF的菌株被挖掘出來，如有研究發(fā)現(xiàn)，漢遜酵母（Hansenulasp.）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）、白假絲酵母（Candida albicans）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、東方伊薩酵母（Pichia kudriavzevii）、路德類酵母（Saccharomycodes ludwigii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜耳結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、佛氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）和扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）等菌株也能產(chǎn)HDMF，并且隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，可以通過基因構(gòu)建、改造或修飾來提高微生物法發(fā)酵產(chǎn)HDMF的能力[43-44，54-56]。

5 微生物合成HDMF的機(jī)制及其關(guān)鍵酶

目前，已知產(chǎn)HDMF的微生物菌株，無論是酵母菌還是細(xì)菌，其合成HDMF的內(nèi)在機(jī)制都處于探索階段，生產(chǎn)機(jī)理尚不清楚[57]。從已有研究中可知，微生物合成HDMF需要己糖存在，推測可能是微生物通過代謝己糖直接產(chǎn)生HDMF或者是代謝己糖與氨基酸在高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物生成HDMF，但均無完整且清晰的代謝途徑，這極大限制了微生物合成HDMF的深入研究和生物法工業(yè)化的生產(chǎn)[57-58]。相較而言，有關(guān)魯氏酵母生物合成HDMF代謝途徑的研究比較多，如HAYASHIDA Y等[55]認(rèn)為Mugi味噌、大豆醬和大麥曲等發(fā)酵基質(zhì)中含有的己糖和氨基酸首先經(jīng)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生Amadori中間產(chǎn)物，然后在魯氏酵母作用下轉(zhuǎn)化為6個碳的1-脫氧二酮糖后再轉(zhuǎn)化形成HDMF；DAHLEN T等[38]采用同位素標(biāo)記法分析發(fā)現(xiàn)，魯氏酵母細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上相關(guān)生物酶在催化FDP產(chǎn)生HDMF時發(fā)揮了重要的作用；隨后HAUCK T等[51]利用魯氏酵母細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)蛋白提取液將FDP成功轉(zhuǎn)化合成了HDMF，這表明HDMF的產(chǎn)生需要以上兩種提取液中的酶類參與。

基于已知微生物代謝合成HDMF時需要己糖類化合物存在的事實，學(xué)者推測與己糖代謝相關(guān)的糖酵解代謝途徑（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）及磷酸戊糖代謝途徑（pentose phosphate pathway，PPP）在微生物合成HDMF中發(fā)揮著重要的作用。基于此，有學(xué)者提出了如圖2所示的有關(guān)微生物合成HDMF的代謝途徑，有關(guān)微生物，尤其是魯氏酵母合成HDMF的機(jī)制基本上是通過以上兩條途徑展開研究的。

圖2 通過EMP和PPP途徑合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮Fig. 2 Metabolic synthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone through EMP and PPP pathways

5.1 通過EMP合成HDMF及其關(guān)鍵酶

在酵母糖類化合物代謝中，EMP發(fā)揮著重要的作用，因此，在酵母合成HDMF中發(fā)揮著積極的作用。EMP中磷酸果糖激酶（posphofructokinase，PFK1）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和己糖激酶（hexokinase，HK）三種單向酶在促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)能量方面起著關(guān)鍵性的作用[59]。果糖和葡萄糖在HK的作用下分別轉(zhuǎn)化為6-磷酸-果糖和6-磷酸-葡萄糖，而6-磷酸-葡萄糖在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase，G6PI）作用下轉(zhuǎn)化為6-磷酸-果糖，在PFK1作用下6-磷酸-果糖催化為FDP，隨后在醛縮酶（fructose-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA）作用下將FDP裂解為三磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，GAP）和二羥基磷酸丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP），后者再經(jīng)過一系列未知代謝途徑轉(zhuǎn)化為HDMF（圖2）[60]。

5.2 通過PPP合成HDMF及其關(guān)鍵酶

PPP也是微生物細(xì)胞中糖代謝的關(guān)鍵途徑，在微生物利用己糖合成HDMF中同樣發(fā)揮著重要的作用。在氧化過程中，6-磷酸-葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）作用下氧化為6-磷酸-葡萄糖內(nèi)酯，然后在6-磷酸-葡萄糖內(nèi)酯酶（6-phosphogluconolactonase，6PGL）作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸，隨后在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，G6PDH）的作用下生成5-磷酸核酮糖，經(jīng)轉(zhuǎn)酮酶（transketolase，TKT）作用轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛或6-磷酸-果糖，3-磷酸甘油醛再通過磷酸丙糖異構(gòu)酶（triose phosphate isomerase，TPI）轉(zhuǎn)化生成磷酸二羥丙酮，繼而生成HDMF，而6-磷酸-果糖則通過EMP途徑生產(chǎn)HDMF（圖2）[40]。

6 微生物合成HDMF的培養(yǎng)條件

影響微生物合成HDMF的因素眾多，按其內(nèi)因和外因主要包括微生物菌種本身的基因特性和其培養(yǎng)發(fā)酵條件[61]。微生物菌種本身特性主要通過從不同環(huán)境中篩選、基因誘變或基因改造獲得優(yōu)良菌種而得到改善，而一旦菌種確定后就需要通過調(diào)控其培養(yǎng)條件，如碳源種類和濃度、氮源種類和濃度、鹽濃度、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間等因素對其合成HDMF產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)控[6，9]。

6.1 糖種類及其濃度

不同的糖種類對微生物合成HDMF會產(chǎn)生不同的影響。在前期研究中認(rèn)為，酵母合成HDMF的前體物質(zhì)是FDP，如DAHLEN T等[38]利用同位素標(biāo)記法證明，HDMF是魯氏酵母利用FDP產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。隨著對微生物合成HDMF研究的深入，后續(xù)研究表明，除FDP外，麥芽糖、乳糖、鼠李糖、D-果糖等也是微生物合成HDMF的前驅(qū)物質(zhì)，促進(jìn)HDMF的生成。如張海林[43]探究了葡萄糖、FDP、果糖、乳糖、鼠李糖和麥芽糖等不同碳源對酵母合成HDMF的影響，結(jié)果表明，雖然以FDP為碳源時最有利于酵母合成HDMF，但果糖、鼠李糖和麥芽糖也能促進(jìn)酵母合成HDMF；同樣，在王鵬霄[41]研究中也證明了鼠李糖、麥芽糖和果糖都是酵母菌發(fā)酵產(chǎn)HDMF的有效前體。另外，糖濃度會對酵母合成HDMF產(chǎn)生一定影響，較高的糖濃度會對微生物細(xì)胞產(chǎn)生一定的滲透壓脅迫，從而促進(jìn)EMP和PPP中相關(guān)酶活性的提高，增加HDMF的生成[62]。如在周亞男[39]研究中發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的FDP下酵母所產(chǎn)HDMF量有所不同，在0～120 g/L的FDP質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中FDP濃度的增加，酵母菌所產(chǎn)HDMF的能力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；HECQUET L等[37]研究發(fā)現(xiàn)在FDP含量為10%時，魯氏酵母所產(chǎn)HDMF較高，而當(dāng)其含量增加至20%時，其合成HDMF的能力則受到一定程度的抑制；DAHLEN T等[38]研究發(fā)現(xiàn)FDP濃度與HDMF濃度及酵母細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

6.2 氮源種類及其濃度

有研究表明，美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物可以促進(jìn)微生物生成HDMF。由此可以推測氮源對微生物合成HDMF具有重要的影響。如在無氮源的L-鼠李糖溶液中接種莢膜畢赤酵母發(fā)酵后未檢測到HDMF，而將L-鼠李糖加入到含有蛋白胨的培養(yǎng)基中進(jìn)行濕熱滅菌后，再接種莢膜畢赤酵母發(fā)酵后則檢測出HDMF，可見氮源會影響微生物合成HDMF[63]。然而，在張海林[43]研究中卻發(fā)現(xiàn)，不同種類的氮源對酵母NTG-SX-103合成HMDF的影響較小，這可能是由于其所采用的初始培養(yǎng)基為麥汁，其中含有比較豐富的氮源的緣故。雖然有關(guān)氮源種類及其濃度對微生物合成HDMF的研究較少，但從其對微生物生長繁殖及其對微生物生物酶的調(diào)控和表達(dá)以及可能通過美拉德反應(yīng)形成微生物合成HDMF的前體物質(zhì)等方面分析，氮源種類及其濃度一定會對微生物合成HDMF產(chǎn)生影響。

6.3 NaCl和Ca2+質(zhì)量濃度

有研究表明，在鹽脅迫培養(yǎng)條件下會增加EMP中各代謝產(chǎn)物含量及其相關(guān)基因的表達(dá)，繼而會影響微生物合成HDMF[64]。如周亞男[39]研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度的增加，魯氏酵母合成HDMF的能力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為180 g/L時，酵母所產(chǎn)HDMF濃度最高；HAUCK T等[51]研究結(jié)果也表明，在NaCl含量為17%時有利于微生物合成HDMF。另外，有研究表明，Ca2+是一種滲透壓傳遞信使，一定濃度的Ca2+有助于微生物合成HDMF，如有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加1 mol/L Ca2+有助于酵母合成HDMF，其產(chǎn)量相比未添加Ca2+的培養(yǎng)基增加了23.3%，并且在0～1 mol/L范圍內(nèi)，HDMF的產(chǎn)量隨著Ca2+濃度的增加而提高[43]；DAHLEN T等[38]探究了酵母在含有不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基中生長和產(chǎn)HDMF的情況，結(jié)果表明，在CaCl2質(zhì)量濃度為10～50 g/L時有助于促進(jìn)酵母合成HDMF。

6.4 初始pH值

pH值對微生物的生長有多方面影響，主要是通過影響關(guān)鍵酶酶活、微生物細(xì)胞膜所帶電荷狀態(tài)等，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和新陳代謝。每種微生物都有其最適生長pH值和一定的生長pH值范圍以及所產(chǎn)代謝產(chǎn)物的最佳pH值，適宜的初始pH值有利于促進(jìn)微生物生長代謝和產(chǎn)代謝產(chǎn)物。如彭輝等[31]研究發(fā)現(xiàn)，魯氏酵母QOR6在不同的初始pH值條件下所產(chǎn)HDMF含量有所不同，隨著發(fā)酵液初始pH值的增加（由3.7增加至5.7時），其所產(chǎn)HDMF的量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在初始pH值為4.2時，產(chǎn)量最高，為2.18 mg/L；HAUCK T等[51]的研究結(jié)果也同樣證實了初始pH值對微生物合成HDMF具有較大的影響。

6.5 搖床轉(zhuǎn)速

搖床轉(zhuǎn)速會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)與微生物細(xì)胞的接觸、氧氣傳遞效率以及對微生物細(xì)胞的剪切力，從而影響微生物生長代謝，對HDMF的合成產(chǎn)生影響。彭輝等[31]研究表明，轉(zhuǎn)速對酵母合成HDMF也具有較大的影響，隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中HDMF含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在轉(zhuǎn)速為180 r/min時最高，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速為其生長提供了充足的氧氣；同樣，在HECQUET L等[37]研究中也充分證明了相比厭氧發(fā)酵而言，有氧發(fā)酵更有利于其合成HDMF。

6.6 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度會對酵母生長和代謝產(chǎn)生重要的影響，從而影響到其合成HDMF的能力，而不同的微生物其發(fā)酵合成HDMF的最佳培養(yǎng)溫度會有所不同。如畢赤酵母菌株P(guān)3發(fā)酵產(chǎn)HDMF的最佳培養(yǎng)溫度為34 ℃，其產(chǎn)量相比在38 ℃時提高了50%以上[41]；而酵母QOR6的最佳發(fā)酵溫度則為28 ℃，顯著高于其他溫度條件下發(fā)酵HDMF產(chǎn)量[31]。研究表明，發(fā)酵溫度主要是通過影響微生物生物酶活性來調(diào)控其產(chǎn)HDMF的量，溫度過低或過高都會影響到微生物代謝途徑中合成HDMF的生物酶活性[65]。

6.7 接種量

接種量能調(diào)節(jié)微生物的生長代謝，適宜的接種量對微生物代謝產(chǎn)物的積累具有積極影響[66]。彭輝等[31]研究表明，隨著接種量的增加，魯氏酵母QOR6合成HDMF的產(chǎn)量先升高后降低，不同接種量之間存在著差異；周亞男[39]研究也發(fā)現(xiàn)，接種量會對酵母產(chǎn)HDMF產(chǎn)生一定影響；張海林[43]研究發(fā)現(xiàn)，接種量對酵母NTG-SX-103產(chǎn)HDMF影響不顯著，這可能是與其所選用的接種量水平相關(guān)，在其所選用的不同接種量水平下，發(fā)酵后期酵母菌體濃度都沒有太大的差異，從而導(dǎo)致HDMF含量差異不明顯。

6.8 培養(yǎng)時間

培養(yǎng)時間不同，微生物代謝過程中相關(guān)生物酶的表達(dá)水平有所差異，對微生物合成HDMF會產(chǎn)生影響，因此，需要選擇合適的培養(yǎng)時間[62]。如LI X等[40]在探索添加D-果糖條件下酵母合成HDMF的分子機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵等3天時，HDMF的合成主要是通過EMP產(chǎn)生，而在第5天時，EMP和PPP則都是生成HDMF的主要途徑，且HDMF含量達(dá)到最大；周亞男[39]在探究培養(yǎng)時間對微生物生成HDMF的影響時，均發(fā)現(xiàn)HDMF的含量隨著發(fā)酵時間的增加先上升后下降，分別在第4天、7天和6天時HDMF含量達(dá)到最大。

7 結(jié)論與展望

基于HDMF本身具有的風(fēng)味特性，未來其將會在眾多食品中有著更為廣泛的應(yīng)用，尤其是天然源HDMF。目前，雖然化學(xué)法是生產(chǎn)HDMF的主要方法，但隨著人們對天然性的偏愛，具有天然屬性來源的HDMF的市場需求將會更大。天然源HDMF可以采用天然提取法和微生物法獲得，但天然提取方法由于受原料來源及其本身含量的限制，無法滿足市場的需求，而微生物法則因其產(chǎn)量相對較高且步驟簡單，有希望成為天然HDMF的主要來源。然而，目前仍十分缺乏有關(guān)微生物合成HDMF的研究，當(dāng)前已報道產(chǎn)HDMF的微生物主要集中于酵母菌株，并且產(chǎn)量都相對較低，尚無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。另外，有關(guān)其形成內(nèi)在機(jī)制尚不清楚，無法對其發(fā)酵進(jìn)行有效的調(diào)控。因此，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)微生物法合成HDMF的研究，首先從不同環(huán)境中網(wǎng)羅一批高產(chǎn)HDMF性能優(yōu)良的菌株，并對其合成機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，然后采用基因工程和酶工程等技術(shù)改造或構(gòu)建相應(yīng)工程菌株，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而逐漸滿足人們對天然HDMF的需求。