超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶降解殼聚糖的工藝研究

楊慶紅　黃永春　張昆明

摘 要：采用超聲波技術(shù)聯(lián)合木瓜蛋白酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，以還原糖釋放量為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了殼聚糖質(zhì)量濃度、溶液pH、超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響。并利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）及X-射線衍射（XRD）分別對(duì)降解前后的殼聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析。結(jié)果表明：超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶可以有效降解殼聚糖，在殼聚糖質(zhì)量濃度為6 g/L、溶液pH為4.5、超聲功率為480 W、超聲時(shí)間為180 min條件下，加入木瓜蛋白酶，降解效果最明顯，還原糖釋放量達(dá)到1.456 g/L；FT-IR結(jié)果表明，降解后殼聚糖的結(jié)構(gòu)基本沒有變化；XRD結(jié)果表明，降解后殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)受到了破壞。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；超聲波；木瓜蛋白酶；降解工藝

中圖分類號(hào)：Q63 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2024.02.012

0 引言

殼聚糖是甲殼素脫乙?；饔煤蟮难苌铮亲匀唤缰形ㄒ淮罅看嬖诘膲A性多糖，具有較高的反應(yīng)活性和生物相容性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保以及化工等多個(gè)領(lǐng)域[1-6]。但是，殼聚糖是長鏈大分子且晶體結(jié)構(gòu)緊密，只能在某些酸性介質(zhì)中溶解，這在極大程度上限制了其應(yīng)用[7]。與殼聚糖相比，低聚殼聚糖顯示出了更好的水溶性、吸濕保濕性、螯合性、抗菌性等[8-11]，應(yīng)用更加廣泛。因此，降解殼聚糖成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

目前降解殼聚糖主要有化學(xué)降解法、酶降解法和物理降解法[12-14]。超聲降解是一種物理降解法，在降解過程中無其他試劑參加、無副反應(yīng)發(fā)生，后期易于提取回收，具備良好的工業(yè)前景[15]。Vallejo-Dominguez等[16]采用高頻超聲波對(duì)殼聚糖溶液進(jìn)行降解，得到了分子量分別為73.61、86.82和55.00 kDa的殼聚糖。但是隨著反應(yīng)時(shí)間延長，超聲波降解殼聚糖會(huì)達(dá)到一個(gè)極限，從而難以繼續(xù)降解[17]。而作為可以降解殼聚糖的非專一性酶的木瓜蛋白酶具有穩(wěn)定性好、對(duì)殼聚糖的降解效率高等優(yōu)點(diǎn)[18]，可以對(duì)超聲后的殼聚糖溶液繼續(xù)進(jìn)行降解。目前報(bào)道的超聲波和酶法降解殼聚糖的研究都是在殼聚糖充分溶解后進(jìn)行的，而殼聚糖的充分溶解需要較長的時(shí)間。例如李軍立等[19]將殼聚糖置于鹽酸溶液中磁力攪拌至充分溶解后再進(jìn)行超聲波降解實(shí)驗(yàn)；王奎蘭[20]將殼聚糖置于乙酸溶液中攪拌并放置過夜后再進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。

本研究選擇在殼聚糖與溶劑混合后，立刻放入超聲波細(xì)胞破碎儀中，利用超聲波作用加速殼聚糖的溶解和降解，然后將超聲波處理后的溶液進(jìn)行酶解，創(chuàng)新性地開展超聲波-木瓜蛋白酶聯(lián)合降解殼聚糖的工藝研究，以期獲得更好的降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖，脫乙酰度90%，購自深圳市中發(fā)源生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，酶活力≥3 U/mg，購自美國Sigma-Alrdich公司；冰醋酸、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、無水碳酸鈉，分析純（AR），購自西隴科學(xué)股份有限公司；N-乙酰氨基葡萄糖，分析純（AR），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SL-2010N智能溫控多頻超聲波細(xì)胞破碎儀購自南京順流儀器有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)購自島津儀器有限公司；H1850醫(yī)用離心機(jī)購自長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；NICOLET 6700紅外光譜儀購自美國賽默飛世爾公司；D/MAX-3A X射線衍射儀購自日本理學(xué)株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 殼聚糖的降解

1）木瓜蛋白酶降解殼聚糖

將0.2 mol/L乙酸溶液與0.1 mol/L乙酸鈉溶液混合配制成不同pH的緩沖溶液，稱取不同量的殼聚糖原料于燒杯中，加入100 mL緩沖溶液，磁力攪拌3 h至完全溶解，加熱至45 ℃，加入木瓜蛋白酶（酶與殼聚糖質(zhì)量比為0.2），磁力攪拌恒溫反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min滅酶，用2.0 mol/L的NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)為9左右，靜置離心，取下層沉淀物，洗滌，抽濾，在50 ℃下真空干燥得到降解后的殼聚糖降解產(chǎn)物。

2）超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶降解殼聚糖

將0.2 mol/L乙酸溶液與0.1 mol/L乙酸鈉溶液混合配制成不同pH的緩沖溶液，稱取不同量的殼聚糖原料于雙層夾套燒杯中，加入200 mL緩沖溶液攪拌30 s，立刻放入超聲波細(xì)胞破碎儀中，超聲期間溫度控制在25 ℃，在設(shè)定功率下，將殼聚糖溶液間歇式（工作間歇比4∶8）超聲處理一段時(shí)間（僅計(jì)超聲工作時(shí)間）后，取100 mL超聲后的殼聚糖溶液，再進(jìn)行1）中的殼聚糖酶解實(shí)驗(yàn)，收集產(chǎn)物。

1.3.2 殼聚糖降解的單因素實(shí)驗(yàn)

1）殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)殼聚糖降解的影響

在溶液pH 4.5、超聲功率480 W、超聲時(shí)間30 min條件下，考察不同殼聚糖質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 g/L）下殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量，分析殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)殼聚糖降解的影響。

2）溶液pH對(duì)殼聚糖降解的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度6 g/L、超聲功率480 W、超聲時(shí)間30 min條件下，考察不同溶液pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）下殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量，分析溶液pH對(duì)殼聚糖降解效果的影響。

3）超聲功率對(duì)殼聚糖降解的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度6 g/L、溶液pH 4.5、超聲時(shí)間30 min條件下，考察不同超聲功率（30、120、210、300、390、480、570 W）下殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量，分析超聲功率對(duì)殼聚糖降解的影響。

4）超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度6 g/L、溶液pH 4.5、超聲功率480 W條件下，考察不同超聲時(shí)間（15、30、45、60、90、120、150、180 min）下殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量，分析超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響。

1.3.3 還原糖釋放量的測(cè)定

采用Imoto改良法[21-22]測(cè)定殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量。首先配置一系列不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在420 nm處測(cè)定吸光度（A420），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后取2 mL稀釋至適當(dāng)倍數(shù)的殼聚糖酶解液于具塞試管中，加入3 mL 0.5 mol/L堿性鐵氰化鉀溶液，混合均勻，試管加塞后，沸水浴20 min，冷卻，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液在420 nm處測(cè)定吸光度A420，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及其稀釋倍數(shù)計(jì)算出殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量。

1.3.4 紅外光譜分析

取殼聚糖原料及降解產(chǎn)物1～2 mg，加入100～200 mg KBr研磨，混合均勻，將混合粉末置于紅外壓片模具中壓成透明薄片，放入儀器中檢測(cè)。測(cè)定范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.5 X射線衍射分析

將殼聚糖原料及降解產(chǎn)物充分研磨成細(xì)粉，將樣品加入到樣品架的凹槽中，取載玻片輕壓樣品表面將樣品表面刮平，放入儀器中檢測(cè)。測(cè)定范圍為5°～40°，掃描速率0.01 （°）/s。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，使用Origin 2021軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)殼聚糖降解的影響

不同殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)殼聚糖降解的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度從2 g/L增加到10 g/L，未超聲的殼聚糖酶解液的還原糖釋放量由0.394 g/L增加到1.790 g/L；超聲處理后殼聚糖酶解液的還原糖釋放量均有所提高，其變化趨勢(shì)與未超聲時(shí)大致相同，由0.477 g/L增加到1.840 g/L。尤其是質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，殼聚糖酶解液的還原糖釋放量升高至1.310 g/L，較未超聲處理提高了0.186 g/L，當(dāng)質(zhì)量濃度超過6 g/L時(shí)，殼聚糖酶解液的還原糖釋放量增加趨勢(shì)減緩，一方面，超聲波的機(jī)械作用和空化作用加速了殼聚糖的溶解和降解，更有利于后續(xù)酶解反應(yīng)的進(jìn)行；另一方面，較高的質(zhì)量濃度增加了殼聚糖溶液的黏度，導(dǎo)致超聲的空化效應(yīng)減弱[17]。綜合考慮，本研究選擇質(zhì)量濃度為6 g/L殼聚糖進(jìn)行其他單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 溶液pH對(duì)殼聚糖降解的影響

不同溶液pH對(duì)殼聚糖降解的影響如圖2所示。由于pH可以影響酶分子上有關(guān)活性部位的解離，進(jìn)而影響酶分子與底物的結(jié)合以及后續(xù)催化反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)過高或過低的pH也可能影響酶分子的空間結(jié)構(gòu)，影響酶的活性，降低反應(yīng)速率[23]。由圖2可知，未超聲的殼聚糖酶解液中還原糖釋放量在溶液pH為4.5時(shí)達(dá)到最大，這時(shí)木瓜蛋白酶降解殼聚糖的效果最佳。超聲處理后殼聚糖酶解液的還原糖釋放量先增大后減小，在溶液pH為4.5時(shí)由未超聲的1.124 g/L增加到1.310 g/L，當(dāng)溶液pH大于4.5時(shí)，還原糖釋放量下降，一方面，較高的pH條件下殼聚糖溶解更加困難，不利于降解反應(yīng)的進(jìn)行，且較高的pH抑制了·OH的產(chǎn)生，降低了殼聚糖分子基團(tuán)與·OH反應(yīng)的概率[24]，自由基效應(yīng)作為超聲空化的主要效應(yīng)在較高的pH下的效果也隨之變差。另一方面，殼聚糖酶解反應(yīng)的最佳pH為4.5。綜合考慮，本研究選擇溶液pH為4.5進(jìn)行其他單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 超聲功率對(duì)降解效果的影響

不同超聲功率對(duì)殼聚糖降解的影響如圖3所示。由圖3可知，超聲作用可以明顯提高殼聚糖的降解效果，隨著超聲功率的增加，殼聚糖酶解液的還原糖釋放量也從1.254 g/L增加到1.312 g/L。這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)促進(jìn)了殼聚糖的溶解和殼聚糖的β-（1，4）糖苷鍵的隨機(jī)性切斷，使得溶液黏度降低，更有利于后續(xù)酶解反應(yīng)進(jìn)行。但從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，在480 W和570 W條件下，還原糖釋放量僅從1.310 g/L增加到1.312 g/L，變化很小，而且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著超聲功率的增大，殼聚糖溶液的顏色逐漸加深，綜合考慮殼聚糖降解產(chǎn)物在實(shí)際操作中的成本及損耗，選擇超聲功率為480 W進(jìn)行其他單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)降解效果的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)，還原糖釋放量為1.196 g/L，較未超聲的殼聚糖酶解液僅增加了0.072 g/L；隨著超聲時(shí)間延長，殼聚糖酶解液中的還原糖釋放量不斷增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到180 min左右時(shí)，還原糖釋放量達(dá)到1.456 g/L，較未超聲的殼聚糖酶解液僅增加了0.332 g/L。180 min后還原糖釋放量幾乎不再增加，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是隨著超聲時(shí)間的延長，殼聚糖溶解得越來越充分，同時(shí)有更多的殼聚糖因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)被降解，但是180 min后趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長，大分子量的殼聚糖被切斷為中分子量和小分子量的殼聚糖，時(shí)間越久，殼聚糖大分子越少，發(fā)生斷裂的概率越低，超聲作用達(dá)到極限[25]，再繼續(xù)反應(yīng)作用不大，因此，選擇超聲處理時(shí)間為180 min。

2.2 紅外光譜分析

殼聚糖原料及降解產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖5所示，3 440 cm-1附近強(qiáng)而寬的吸收峰是O—H和N—H伸縮振動(dòng)吸收峰重疊所得的多重吸收峰；2 925 cm-1和2 875 cm-1附近是C—H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 660 cm-1附近是酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰，1 590 cm-1附近是酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，1 320 cm-1附近是酰胺III帶的特征吸收峰；1 156 cm-1附近是C—O—C的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 080 cm-1附近是C—O的伸縮振動(dòng)吸收峰；895 cm-1附近是殼聚糖β-構(gòu)型糖苷鍵的特征吸收峰[26]。由圖5可知，殼聚糖原料與2種降解產(chǎn)物的紅外譜圖基本一致，沒有新的吸收峰出現(xiàn)或消失，經(jīng)過超聲聯(lián)合木瓜蛋白酶降解后，殼聚糖的結(jié)構(gòu)以及官能團(tuán)幾乎沒有發(fā)生改變，吸收峰的強(qiáng)度稍改變。這就說明降解后的產(chǎn)物依舊保持了原來的分子結(jié)構(gòu)。

2.3 XRD分析

殼聚糖原料及降解產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖6所示。由圖6可知，原料殼聚糖在2θ分別為12.55°和20.07°處有2個(gè)特征衍射峰，這與文獻(xiàn)［27］報(bào)道的殼聚糖的X-射線衍射圖的形狀基本一致。但是降解產(chǎn)物在 2θ = 20.07°處的特征峰比原料殼聚糖的特征峰更強(qiáng)、更尖銳，這可以間接說明降解產(chǎn)物的結(jié)晶度略高于原料殼聚糖，這可能是由于殼聚糖的降解首先發(fā)生在殼聚糖的非結(jié)晶區(qū)，使得殼聚糖的酶解產(chǎn)物的結(jié)晶度增加[28]。

3 結(jié)論

在本研究中，采用超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，研究了殼聚糖質(zhì)量濃度、溶液pH、超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響，并采用FT-IR和XRD對(duì)殼聚糖的降解產(chǎn)物進(jìn)行了表征。所得結(jié)論如下：

1）隨著殼聚糖質(zhì)量濃度、超聲功率和超聲時(shí)間的增加，還原糖釋放量逐漸增加；隨著溶液pH的增大，還原糖釋放量先增加后減少。在殼聚糖質(zhì)量濃度為6 g/L、溶液pH為4.5、超聲功率為480 W、超聲時(shí)間為180 min條件下，加入木瓜蛋白酶，溶液的還原糖釋放量為1.456 g/L，比未超聲直接溶解后加入木瓜蛋白酶降解殼聚糖增加了0.332 g/L。

2）降解后殼聚糖分子的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)幾乎沒有發(fā)生改變；降解后的殼聚糖晶體結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)晶度有所增加。

以上結(jié)果表明，超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶能更高效地降解殼聚糖，超聲波的直接處理減少了傳統(tǒng)溶解殼聚糖所需時(shí)間，同時(shí)可以促進(jìn)殼聚糖的降解，再加入木瓜蛋白酶可以使殼聚糖得到更進(jìn)一步的降解。后續(xù)可對(duì)降解產(chǎn)物的分子量分布、水溶性及抑菌性等展開進(jìn)一步研究。

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Study on the process of chitosan degradation by ultrasonic combined with papain

YANG Qinghong1，2， HUANG Yongchun*1，2， ZHANG Kunming1，2

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of

Science and Technology）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： Chitosan was degraded by ultrasonic technology combined with papain. Taking the release of reducing sugars as an index， the effects of chitosan concentration， solution pH， ultrasonic power and ultrasonic time on chitosan degradation were investigated by univariate experiments. Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and X-ray diffraction （XRD） were used to characterize the structure of chitosan before and after degradation. The results showed that ultrasonic combined with papain could effectively degrade chitosan. Under the condition of chitosan concentration of 6 g/L， the solution pH of 4.5， ultrasonic power of 480 W， ultrasonic time of 180 min， papain was added to continue the reaction， and the degradation effect was the most obvious， and the release of reducing sugars reached 1.456 g/L. The FT-IR results showed that the structure of chitosan remained basically unchanged after degradation. XRD results show that the crystal structure of chitosan was destroyed after degradation.

Keywords： chitosan; ultrasound; papain; degradation process

（責(zé)任編輯：于艷霞）

收稿日期：2023-03-15；修回日期：2023-05-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660472）資助

第一作者：楊慶紅，在讀碩士研究生

*通信作者：黃永春，博士，教授，研究方向：生物資源加工及過程強(qiáng)化，E-mail：huangyc@yeah.net