力信號對心肌細(xì)胞跳動的調(diào)控*

陳惠燕 李洛非 王煒 曹毅? 雷海

1) (南京大學(xué)物理學(xué)院,固體微結(jié)構(gòu)國家實(shí)驗(yàn)室,南京 210093)

2) (浙江大學(xué)物理學(xué)院,杭州 310027)

3) (浙江大學(xué)物理高等研究院,杭州 310027)

心肌細(xì)胞的機(jī)械行為對生命健康起至關(guān)重要的作用,通常認(rèn)為電信號和化學(xué)信號對心肌細(xì)胞的行為起調(diào)控作用.近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境的物理因素能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、鋪展、遷移和分化等行為,但其對心肌細(xì)胞機(jī)械行為的調(diào)控研究仍然缺乏.本文制備具有不同楊氏模量的水凝膠以模擬心肌細(xì)胞力學(xué)微環(huán)境,并通過加載力學(xué)刺激來探究細(xì)胞外基質(zhì)中不同配體對心肌細(xì)胞的力學(xué)調(diào)控.研究表明機(jī)械力信號可以通過基質(zhì)-配體-細(xì)胞的信號通路來調(diào)控心肌細(xì)胞的跳動,進(jìn)而引起細(xì)胞間的耦合振蕩實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的節(jié)律控制.這種力信號調(diào)控受細(xì)胞微環(huán)境的楊氏模量、細(xì)胞黏附配體種類和密度、以及力信號的強(qiáng)弱和節(jié)律三者共同影響,這為理解心率失調(diào)和心肌梗死后心力衰竭等疾病提供基礎(chǔ).

1 引言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization,WHO) 報(bào)道,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD) 是全球人口死亡的主要原因之一[1,2].在2019 年,估計(jì)有1790 萬人死于 CVD,占全球總死亡人數(shù)的32%[2].該疾病通常與心率變異性 (heart rate variability,HRV) 有很大關(guān)系[3].心臟組織內(nèi)數(shù)十億個心肌細(xì)胞相互協(xié)作，共同適應(yīng)不斷變化的生理環(huán)境，維持生物體的生命健康[4].作為心臟組織中的收縮細(xì)胞，心肌細(xì)胞以一種良好協(xié)調(diào)的模式進(jìn)行節(jié)律性收縮,這個過程通常被認(rèn)為是化學(xué)或電信號的調(diào)控作用[5].在心臟組織內(nèi),相鄰心肌細(xì)胞間通過插入盤 (intercalated disc,ID)相互連接[6].間隙連接通道連接相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),使得一定大小的分子和離子能通過被動擴(kuò)散,進(jìn)行細(xì)胞間化學(xué)信號通信[7].同時間隙連接結(jié)構(gòu)還能直接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間電脈沖傳播,觸發(fā)相連細(xì)胞的協(xié)調(diào)收縮[8].當(dāng)該復(fù)合體機(jī)械偶聯(lián)產(chǎn)生缺陷時會出現(xiàn)致命性心律失常[9].

近年,大量研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中物理因素對細(xì)胞黏附擴(kuò)散[10-12]、遷移[13-17]、增殖生長[10,18,19]、分化[20-23]等基本生命活動有很大的影響.其中,細(xì)胞外基質(zhì)硬度和成分組成對細(xì)胞行為起著很重要的調(diào)控作用.例如,將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)在具有梯度硬度分布 (0.5—22 kPa) 的聚丙烯酰胺水凝膠上,觀察到細(xì)胞出現(xiàn)向中間硬度遷移聚集的趨勢[14].在包被了不同濃度纖連蛋白的培養(yǎng)皿中,高黏附密度(大于500 ng/cm2)促進(jìn)細(xì)胞大面積鋪展貼壁,而低黏附密度(小于100 ng/cm2)條件下的細(xì)胞普遍為圓形,脫落和喪失活性[24].隨著對物理微環(huán)境可調(diào)控細(xì)胞行為的深入認(rèn)識,研究發(fā)現(xiàn)相鄰細(xì)胞可通過基質(zhì)進(jìn)行機(jī)械信號通信.細(xì)胞可檢測到由相鄰一定距離的細(xì)胞牽引力產(chǎn)生的底物應(yīng)變,并對該力學(xué)信號進(jìn)行響應(yīng),且該響應(yīng)依賴于基質(zhì)剛度[25].在不同楊氏模量的底物上,兩個單心肌細(xì)胞在40 μm內(nèi)進(jìn)行機(jī)械相互作用實(shí)現(xiàn)收縮耦合.當(dāng)?shù)孜镉捕仍酱髸r,能實(shí)現(xiàn)耦合的細(xì)胞距離和百分比越小且持續(xù)時間越短[26].通過加載不同外部機(jī)械振蕩可以實(shí)現(xiàn)對心肌細(xì)胞收縮頻率的調(diào)控[27,28].隨著年齡增長和生活環(huán)境的長久影響,心臟內(nèi)細(xì)胞成分及細(xì)胞外基質(zhì)組成都會發(fā)生相應(yīng)的變化.而目前的實(shí)驗(yàn)理論研究主要關(guān)注于影響心肌細(xì)胞自發(fā)跳動和成熟發(fā)育的物理機(jī)械因素[29-32]或外部信號的振蕩頻率和振幅驅(qū)動心肌細(xì)胞收縮耦合[27,28].尚未有綜合考慮基質(zhì)硬度、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白種類及濃度3 種因素相互耦合影響心肌細(xì)胞機(jī)械通信的相關(guān)研究.

本文制備了3 種不同楊氏模量的聚丙烯酰胺凝膠 (polyacrylamide gel,PA gel),通過鎢針在水凝膠中加載力信號模擬相鄰心肌細(xì)胞收縮舒張形成的正弦機(jī)械力振蕩,探究心肌細(xì)胞在不同物理微環(huán)境中對外部機(jī)械振蕩的響應(yīng)行為.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Laminin、Fibronectin 和Collagen I 三種基質(zhì)蛋白均介導(dǎo)心肌細(xì)胞對外界力振蕩刺激的響應(yīng),但其對機(jī)械力耦合的程度不同,其中Laminin 的響應(yīng)比例最高,也較為穩(wěn)定.進(jìn)一步分析不同硬度下心肌細(xì)胞對機(jī)械振蕩力的響應(yīng)過程,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)硬度、配體密度與力信號刺激強(qiáng)度三者存在復(fù)雜的耦合關(guān)系,共同影響心肌細(xì)胞的機(jī)械力響應(yīng).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 聚丙烯酰胺水凝膠 (PA gel) 制備

準(zhǔn)備3 種含丙烯酰胺單體(acrylamide,上海滬試公司產(chǎn)品)、交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺 (N,N methylene-bis-acrylamide,Aladdin 公司產(chǎn)品)、引發(fā)劑過硫酸銨 (ammonium persulphate,上海滬試公司產(chǎn)品)、催化劑四甲基乙二胺 (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine,Thermo Fisher 公司產(chǎn)品) 水凝膠前體溶液,其中acrylamide/bisacrylamide 終濃度分別為6%/0.06%,10%/0.1%和20%/0.18%[20].將3 種混合溶液過濾后注入間隙為0.75 mm 的無菌玻璃模具中.經(jīng)過2 h 聚合成膠后,將聚丙烯酰胺水凝膠取下后放置1X PBS溶液(pH 值為7.2—7.4,不含鈣離子和鎂離子)中進(jìn)行溶脹.待溶脹過夜后分成大小適當(dāng)?shù)娜舾蓧K,置于30 mm 直徑的培養(yǎng)皿中備用.在測量力場的實(shí)驗(yàn)中,我們在水凝膠前體溶液中同時混入0.02%,0.2 μm 的FluoSpheres? 羧基修飾微球 (Thermo Fisher 公司產(chǎn)品) .

2.2 水凝膠包被

為了將細(xì)胞外基質(zhì)的配體蛋白牢固修飾在PA gel 上,我們利用具有異雙功能的交聯(lián)劑sulfo-SANPAH(sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoate,Thermo Fisher 公司產(chǎn)品) 作為中間體,將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過化學(xué)交聯(lián)的方式連接在聚丙烯酰胺水凝膠上.將含有100 μg/mL sulfo-SANPAH 的HEPES溶液(pH 8.0,20 mmol/L,Thermo Fisher 公司產(chǎn)品)滴加在膠表面后,進(jìn)行紫外光活化硝基苯基肼,利用無菌水反復(fù)沖洗后用5,20,100 μg/mL 的細(xì)胞基質(zhì)外蛋白(Laminin/Fibronectin/Collagen I) 進(jìn)行低溫孵育過夜.水凝膠表面的配體蛋白密度較難定量表征,但與所加入的蛋白濃度正相關(guān),在本文中以所加的蛋白濃度表示表面黏附蛋白配體的密度.

2.3 新生大鼠心肌細(xì)胞提取[33]

本實(shí)驗(yàn)中所提取的細(xì)胞均為出生0—1 天的SD 級乳大鼠(購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)的心肌細(xì)胞.用75% 乙醇對乳大鼠消毒殺菌后直接斷頸致死,迅速取出心臟置于無菌HBSS(Thermo Fisher 公司產(chǎn)品) 溶液中進(jìn)行反復(fù)清洗,盡可能去除殘留的血液及心包膜.待清洗完畢后,將心臟放置在Isolation Medium(含0.01% 胰酶的HBSS 溶液)中,用彎頭剪刀剪碎成1 mm 左右的組織碎塊.放置于低溫環(huán)境消化過夜(約16 h),去除心臟外膜組織.待消化過夜后,將上清溶液去除后加入Digestion Medium(含0.5 mg/mL Collagenase/Dispase (Sigma 公司產(chǎn)品) 的L-15 溶液 (Thermo Fisher 公司產(chǎn)品)),經(jīng)1 min 空氣氧化和2 min/37 ℃水浴后進(jìn)行37 ℃恒溫消化.在充分消化后,將全部上清細(xì)胞懸液一同注入孔徑為70 μm 的細(xì)胞過濾網(wǎng)中,進(jìn)行反復(fù)過濾數(shù)次后得到均勻的單細(xì)胞懸液.通過5—10 min 轉(zhuǎn)速為100 xg 的離心后可得到心肌細(xì)胞沉淀.用Plating Medium(加有20% M199 培養(yǎng)基、13% 馬血清、7% 胎牛血清和100 unit/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基,均購買于為賽默飛)重懸細(xì)胞沉淀后接種在100 mm 直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中.培養(yǎng)1—2 h 后,將未貼壁的心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),加入1 mmol/L CaCl2(Sigma)和0.05 mg/mL 5-BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine,Sigma 公司產(chǎn)品),并以106個/cm2的密度接種到水凝膠表面上.通過差速貼壁方法將成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞去除,可提取到高純度心肌細(xì)胞.培養(yǎng)36 h 后,用1X PBS溶液盡可能洗掉未貼壁的心肌細(xì)胞,并換成新鮮的Plating Medium (含1 mmol/L Ca2+).該動物研究均按照南京大學(xué)科學(xué)與技術(shù)倫理委員會的規(guī)定和指南進(jìn)行,并按照機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會指南進(jìn)行,審批件編號為IACUC-D2310006.

2.4 原子力顯微鏡 (AFM) 測量PA gel 楊氏模量

本文所使用的原子力顯微鏡為NanoWizard II (JPK,德國),所使用的探針為MLCT (Bruker,德國),標(biāo)定后懸臂的勁度系數(shù)約為60 pN/nm.下壓速度設(shè)置為1.0 μm/s.測試樣品放置在經(jīng)鉻酸處理過的自制玻璃凹槽中,整個測量均在磷酸鹽溶液中進(jìn)行.所測得的力曲線由JPK SPM Data Processing 軟件處理分析.楊氏模量通過對下壓曲線用(1)式赫茲模型 (Hertz model) 擬合獲得,

其中F表示下壓力,h表示探針下壓深度,R為針尖曲率半徑,E為楊氏模量,v是泊松比.本計(jì)算中v取0.4.

2.5 心肌細(xì)胞成像及力學(xué)刺激加載

待心肌細(xì)胞在水凝膠上接種滿48 h 后,將其置于熒光顯微鏡(奧林巴斯,IX73)中進(jìn)行成像觀察.在該成像平臺上自搭建了單細(xì)胞力學(xué)刺激裝置(如圖1 所示),將剛性鎢針(TELAIMY,直徑40 μm)插入水凝膠中并利用精密電機(jī) (SUTTER INSTRUMENT,MP-285) 控制鎢針移動并拉伸水凝膠,力信號通過彈性水凝膠傳遞到鄰近心肌細(xì)胞,從而模擬心肌細(xì)胞間的力學(xué)傳導(dǎo).

圖1 力學(xué)刺激加載平臺示意圖Fig.1.Diagram of mechanical loading platform.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 水凝膠的力學(xué)表征

心外膜形成對心肌的正常發(fā)育至關(guān)重要.隨著年齡的增加和環(huán)境的長久影響,心肌層會發(fā)生許多細(xì)胞和基質(zhì)成分的變化[34].而這些變化直接或間接改變了心肌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)硬度和基質(zhì)多聚蛋白的含量.除了心肌細(xì)胞之外,其他細(xì)胞成分和心肌間質(zhì)的形成是保證正常心臟功能的必要條件.Engler 等[30]曾用AFM 測量胚胎心肌組織表面的楊氏模量,發(fā)現(xiàn)其楊氏模量直方圖呈雙峰型,分別為3—4 kPa 的較軟峰值和11—12 kPa 的剛性峰值.較軟峰會隨著生長發(fā)育不斷偏移,11—12 kPa的剛性峰基本保持不變且該硬度下的基質(zhì)最適合心肌細(xì)胞的生長與成熟[30,32].當(dāng)發(fā)生心肌梗死時,梗死區(qū)域的楊氏模量達(dá)到了30—70 kPa[35].因此,我們制備了3 種不同硬度的聚丙烯酰胺膠來模擬相應(yīng)的機(jī)械力環(huán)境(如圖2(a)所示).通過AFM表征,三種水凝膠的楊氏模量分別為(1.824 ±0.111) kPa,(11.688 ± 0.493) kPa 和(27.358 ±2.331) kPa (如圖2(b)—(d)所示).掃描電子顯微鏡 (SEM) 展示了凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(如圖2(e)—(g)所示).這3 種不同楊氏模量的聚丙烯酰胺膠可以分別模擬心肌組織微彈性雙模量峰和心肌梗塞變硬后3 種情況的基質(zhì)硬度,進(jìn)而探索心肌細(xì)胞在3 種不同彈性環(huán)境下受力刺激后的響應(yīng).

圖2 聚丙烯酰胺水凝膠的制備與表征(a)聚丙烯酰胺水凝膠的制備示意圖;(b)—(d) 基于AFM 的3 種不同水凝膠的楊氏模量分布,其楊氏模量分別為(1.824 ± 0.111) kPa,(11.688 ± 0.493) kPa 和(27.358 ± 2.331) kPa;(e)—(g)對應(yīng)3 種水凝膠的SEM 結(jié)果Fig.2.Preparation and characterization of PA gel: (a)Schematic illustration of the preparation of PA gel;(b)-(d) the Young’ modulus distributions of three different of PA gel measured by AFM,which are (1.824 ± 0.111) kPa,(11.688 ± 0.493) kPa,and (27.358± 2.331) kPa,respectively;(e)-(g) SEM images of three different of PA gel.

3.2 細(xì)胞成像

在制備好水凝膠后,對其進(jìn)行不同配體蛋白質(zhì)分子包被,包括層粘連蛋白(Laminin)、纖連蛋白(Fibronectin) 和膠原蛋白 (Collagen I).將心肌細(xì)胞接種到水凝膠上培養(yǎng)48 h 后,用熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞在不同條件下的貼壁狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁數(shù)量隨著配體濃度升高和基質(zhì)硬度增強(qiáng)而增多直至成片生長(詳見補(bǔ)充材料圖S1 和圖S2 (online)).雖然在不同配體的基質(zhì)上,心肌細(xì)胞貼壁數(shù)量有所差別,但都呈梭形伸展開且具有很高的活性.高細(xì)胞活性是后續(xù)加載力學(xué)振蕩測試的前提.在實(shí)驗(yàn)過程中,發(fā)現(xiàn)當(dāng)相鄰細(xì)胞靠得較近時,細(xì)胞間會出現(xiàn)一起跳動的情況,這與先前的研究發(fā)現(xiàn)類似[26],也說明了所獲得的細(xì)胞活性較高.在測試過程中,盡量選擇“孤立” (周邊100 μm 范圍內(nèi)沒有其他細(xì)胞)心肌細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)刺激(如圖3(a)所示).

圖3 力學(xué)刺激加載及熒光表征 (a),(b)分別為對單個心肌細(xì)胞施加力學(xué)刺激前后的實(shí)物圖;(c) 鎢針運(yùn)動到最大振幅時,PA gel 上各點(diǎn)的位移分布圖(單位為 μm);(d) 心肌細(xì)胞機(jī)械行為檢測,紅色虛線為鎢針輸出的力振蕩信號,黑色實(shí)線是心肌細(xì)胞達(dá)到同頻后Fluo4 探針檢測到的Ca2+ 振蕩信號Fig.3.Mechanical loading and fluorescence characterization: (a),(b) Phase-contrast images of individual cardiomyocyte before and after mechanical stimulation;(c) displacement distribution of each point on PA gel when the tungsten probe moves to the maximum amplitude (unit: μm);(d) mechanical behavior detection of cardiomyocytes,the red dotted line is the signal of mechanical oscillation output by tungsten probe,and the black solid line is the Ca2+ oscillation signal detected by Fluo4 probe after cardiomyocytes reach the same frequency with the tungsten probe.

3.3 外界機(jī)械力振蕩調(diào)控心肌細(xì)胞

為探索機(jī)械力信號對心肌細(xì)胞跳動行為的影響，我們利用力學(xué)刺激加載平臺對心肌細(xì)胞施加力學(xué)刺激,且實(shí)時觀察心肌細(xì)胞的跳動行為.如圖3(a)所示，在力學(xué)刺激過程中,鎢針與水凝膠接觸的深度控制為10 μm,鎢針邊緣與受力信號刺激的心肌細(xì)胞相距約75 μm.控制鎢針以1 Hz 的頻率進(jìn)行位移振蕩,振幅為2—4 μm,拉伸方向與心肌細(xì)胞長軸垂直.心肌細(xì)胞收縮節(jié)律由Ca2+鐘控制,Ca2+瞬態(tài)變化與心肌細(xì)胞收縮同步[27,28].在心肌細(xì)胞動作電位期間出現(xiàn)鈣離子引發(fā)的鈣離子釋放 (Ca2+-induced Ca2+-release,CICR)時,細(xì)胞質(zhì)中鈣離子與肌節(jié)中的肌鈣蛋白結(jié)合后,肌鈣蛋白構(gòu)象發(fā)生變化最終導(dǎo)致肌節(jié)收縮[36-38].本研究利用鈣離子探針Fluo-4AM (Thermo Fisher 公司產(chǎn)品) 來指示鈣離子振蕩頻率,從而確定心肌細(xì)胞收縮變化(如圖3(d)所示).在施加力學(xué)刺激前,先觀察單個心肌細(xì)胞在初始10—15 min內(nèi)的跳動狀態(tài),當(dāng)心肌細(xì)胞在鎢針輸出正弦力學(xué)振蕩的過程發(fā)生收縮行為(頻率、振幅)變化時,則認(rèn)為心肌細(xì)胞對外部機(jī)械力產(chǎn)生響應(yīng).鎢針加載的強(qiáng)振蕩力信號不斷影響細(xì)胞內(nèi)的鈣離子動力學(xué),最終使心肌細(xì)胞達(dá)到自身的本征跳動頻率或者出現(xiàn)與鎢針同頻節(jié)律性振蕩的現(xiàn)象.當(dāng)心肌細(xì)胞與外界機(jī)械振蕩產(chǎn)生耦合同頻時,則停止力學(xué)刺激.

首先探究了心肌細(xì)胞在相同基質(zhì)但不同配體環(huán)境下的機(jī)械響應(yīng)行為.選擇楊氏模量為11 kPa的水凝膠為研究體系[30,32],包被不同種類和濃度的配體蛋白.心肌細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)結(jié)果如圖4(a)所示,在沒有修飾配體情況下,心肌細(xì)胞基本沒有力學(xué)響應(yīng),而3 種基質(zhì)蛋白都具有不同程度的機(jī)械力耦合調(diào)控作用,且隨著配體濃度的增大,出現(xiàn)了下降或持平的“飽和情況”,其中修飾了Laminin 的機(jī)械響應(yīng)比例最高,達(dá)到了41.94%—56.25%.隨著配體濃度的變化,Fibronectin 實(shí)驗(yàn)組的響應(yīng)比例變化不大,維持在21.88%—27.27%.而對于Collagen I而言,配體濃度對心肌細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)影響較大.當(dāng)Collagen I 濃度從5 μg/mL 增加到100 μg/mL時,心肌細(xì)胞的機(jī)械響應(yīng)比例從15.15%上升到45.00%.對心肌細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)行為進(jìn)行深入分析后,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞在不同配體和濃度的情況下,所需的力刺激時間不同,且與外界振蕩耦合狀態(tài)的保持也不同,均受配體蛋白調(diào)控.在包被不同濃度的Laminin 組中,心肌細(xì)胞響應(yīng)所需要的力學(xué)刺激時間均較長且不受濃度影響,表現(xiàn)“穩(wěn)定”;在Fibronectin 組中,與中濃度 (20 μg/mL) 相比,較低 (5 μg/mL) 或較高濃度 (100 μg/mL)條件下的心肌細(xì)胞所需的力刺激時間很短;而在Collagen I 組中,心肌細(xì)胞力刺激時間則與配體濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性,如圖4(b)所示.在對心肌細(xì)胞達(dá)到同頻所需的刺激時間和保持與鎢針同頻的時長進(jìn)行綜合分析(圖4(c),(d))時,發(fā)現(xiàn)在低濃度的Laminin基質(zhì)中,心肌細(xì)胞所需的力刺激時間較長且保持同頻的時間也較長.Fibronectin 實(shí)驗(yàn)在中濃度配體條件下,心肌細(xì)胞達(dá)到同頻振蕩所需的力刺激時間最長.與Laminin 和Collagen I 相比,同配體濃度下的Fibronectin 組心肌細(xì)胞保持同頻的時間均為最短.隨著Collagen I 濃度增大,心肌細(xì)胞所需要的刺激時間變化不大,中濃度條件下的心肌細(xì)胞所需刺激時間最久,但也是與鎢針保持同頻時間最長的一組.

圖4 心肌細(xì)胞在不同種類及濃度配體的基質(zhì)(E=11 kPa)上發(fā)生機(jī)械響應(yīng)行為(a)心肌細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)百分比(n ＞ 31);(b) 心肌細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)所需的機(jī)械刺激時間 (n ＞ 7);(c)心肌細(xì)胞與鎢針同頻所需的機(jī)械刺激時間 (n ＞ 5);(d) 心肌細(xì)胞同頻持續(xù)時長(n ＞ 5);(e) 3 種不同配體(Laminin/ Fibronectin/ Collagen I) 分別與心肌細(xì)胞膜受體結(jié)合示意圖Fig.4.Mechanical response behavior of cardiomyocytes on the matrix (E=11 kPa) with different kinds and concentrations of ligands: (a)The fraction of mechanical response of cardiomyocytes (n ＞ 31);(b) the mechanical stimulation time required for cardiomyocytes to respond the stimulation (n ＞ 7);(c) the mechanical stimulation time required for cardiomyocytes to couple with the tungsten probe (n ＞ 5);(d) duration of cardiomyocyte coupling with tungsten probe (n ＞ 5);(e) schematics of three different ligands (Laminin/Fibronectin/Collagen I) binding to myocardial cell membrane receptors.

心肌細(xì)胞的力響應(yīng)不同,可能跟力信號傳導(dǎo)有關(guān).心肌細(xì)胞表達(dá)的整合素α類型有α1,α3,α5,α6,α7,α9,α10,β類型有β1,β3和β5.其中α3β1可與Collagen I,Fibronectin 及Laminin 結(jié)合;α1β1可與Collagen I 和Laminin 結(jié)合;α5β1可與Fibronectin 結(jié)合;α7β1,α6β1可與Laminin 結(jié)合[39,40].Laminin 除了能與整合素結(jié)合外,還可與連接抗肌萎縮蛋白復(fù)合體 (dystrophin glycoprotein complex,DGC) 連接[41,42](如圖4(e)所示),因而能同時通過兩種途徑將外界機(jī)械信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),耦合鈣離子循環(huán),從而實(shí)現(xiàn)雙通道調(diào)控,提高了Laminin 對外界機(jī)械力振蕩的敏感度.當(dāng)心肌細(xì)胞通過較低濃度的Laminin 與外界建立連接時,雖然細(xì)胞在基質(zhì)上錨定的面積有限,但同時降低了細(xì)胞收縮跳動時拉伸外界基質(zhì)所需的功[43],因此同頻耦合后耗散得較慢.在3 種蛋白的綜合比較下,發(fā)現(xiàn)雖然Fibronectin 在基質(zhì)剛性感應(yīng)方面比較敏感[44-46],但在動態(tài)力學(xué)振蕩刺激中并不占優(yōu)勢,耦合振蕩耗散快.隨著配體濃度的增大,細(xì)胞表面的機(jī)械傳感器數(shù)量變多[43],但這種因機(jī)械傳感器數(shù)量增多引起響應(yīng)比例的增大在低濃度時才呈現(xiàn)出較為明顯的現(xiàn)象(從0 μg/mL 到5 μg/mL).在低濃度或高濃度Fibronectin 情況下,心肌細(xì)胞所具有的力傳感分子數(shù)量和收縮時需對外界做的功較為匹配,表現(xiàn)出響應(yīng)所需的力刺激時間相對較短,同頻耦合持續(xù)時間較長.而對Collagen I 而言,細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)方式可能與Collagen I 的彈性結(jié)構(gòu)有關(guān)(見圖4(e)配體示意圖).Collagen I 在力信號傳遞中具有非線性響應(yīng)特性[47-49],且在高濃度下易出現(xiàn)自組裝現(xiàn)象.這不僅增強(qiáng)了力信號強(qiáng)度，并且可能改變了基質(zhì)順應(yīng)性[50],表現(xiàn)出了力信號非線性增強(qiáng)和細(xì)胞收縮需做的功相互耦合影響產(chǎn)生的結(jié)果.

由于心肌細(xì)胞在包被了Laminin 的基質(zhì)上表現(xiàn)出較好的力學(xué)響應(yīng),我們繼續(xù)探究在不同硬度和Laminin 配體濃度下,心肌細(xì)胞的機(jī)械力響應(yīng)行為.如圖5(a)所示,我們發(fā)現(xiàn)不論是很軟還是很硬的基質(zhì)中,隨著配體濃度的增加,心肌細(xì)胞響應(yīng)的比例先上升后下降.其中1.8 kPa 條件下的變化幅度最大,從25% 增加到64.52%,再降到36.67%.而在27 kPa 實(shí)驗(yàn)中,低配體濃度條件下細(xì)胞響應(yīng)就已經(jīng)達(dá)到較高的比例,且基本不受配體濃度增加的影響,在44.44%—53.33% 之間,11 kPa 次之.值得注意的是,在低配體濃度或高配體濃度的情況下,在1.8 kPa 水凝膠上心肌細(xì)胞的響應(yīng)比例都是低于較硬 (11 kPa) 和最硬 (27 kPa) 的水凝膠.統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞響應(yīng)和同頻行為在1.8 kPa 與27 kPa 水凝膠上均有相同的變化趨勢(如圖5(b)—(d)所示).心肌細(xì)胞在1.8 kPa 軟水凝膠且低配體濃度的條件下響應(yīng)所需的刺激時間較短,且同頻振蕩保持的時間相對較短.在高配體濃度條件下,細(xì)胞同頻保持的時間有明顯增長.而在27 kPa 水凝膠中,隨著配體濃度的增大,細(xì)胞響應(yīng)達(dá)到同頻所需的力刺激時間越短,且同頻耦合后耗散得很快.

圖5 心肌細(xì)胞在不同Laminin 濃度和基質(zhì)硬度上的機(jī)械響應(yīng)行為(a)心肌細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)百分比 (n ＞ 23);(b) 心肌細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)所需的機(jī)械刺激時間 (n ＞ 8);(c) 心肌細(xì)胞與鎢針同頻所需的機(jī)械刺激時間 (n ＞ 5);(d)心肌細(xì)胞同頻持續(xù)時長 (n ＞ 5)Fig.5.Mechanical response behavior of cardiomyocytes at different Laminin concentrations and matrix stiffness: (a)The fraction of mechanical response of cardiomyocytes (n ＞ 23);(b) The mechanical stimulation time required for cardiomyocytes to respond the stimulation (n ＞ 8);(c)The mechanical stimulation time required for cardiomyocytes to couple with the tungsten probe (n ＞ 5);(d) Duration of cardiomyocytes coupling with tungsten probe (n ＞ 5).

心肌細(xì)胞在不同硬度基質(zhì)上的力學(xué)響應(yīng)行為與力學(xué)信號傳導(dǎo)有關(guān).鎢針的機(jī)械運(yùn)動使得心肌細(xì)胞所在的基質(zhì)產(chǎn)生固定的形變位移,因此當(dāng)水凝膠的楊氏模量越高時,心肌細(xì)胞能感受到的力信號刺激則越強(qiáng).配體濃度較低時,心肌細(xì)胞整合素與外界的連接數(shù)量有限,心肌細(xì)胞感應(yīng)外界的力學(xué)刺激信號不夠強(qiáng)[43].而在較高配體濃度的情況下,雖然心肌細(xì)胞與外界連接的力信號感受器數(shù)量足夠多,但由于此時心肌細(xì)胞與外界連接比較緊密[51],細(xì)胞肌節(jié)收縮需要對外界做的功更大.在很軟的水凝膠上,低配體濃度使得心肌細(xì)胞收縮舒張過程中對外界所需要做的功較小[30,31,42],力信號改變心肌細(xì)胞機(jī)械行為更加迅速,但衰減得很快,即保持同頻時長最短.隨著配體濃度的增大,由于與外界連接更緊密,相應(yīng)所需要的功變大,因此所需要的力信號刺激時間更長,同時這種耦合衰減也變得更慢.當(dāng)基質(zhì)硬度較大時,心肌細(xì)胞所受的力信號較強(qiáng)的同時,心肌細(xì)胞收縮舒張所需做功也較大[52],由于低配體濃度造成機(jī)械力信號感受器較少,因而所需要的刺激時間更長.在高配體濃度下,心肌細(xì)胞能感受到的力信號強(qiáng)弱和收縮舒張所需做功共同影響,使得心肌細(xì)胞在最硬基質(zhì)上所需要的刺激時間更短,但同時也衰減得很快.基質(zhì)硬度、配體濃度與力信號強(qiáng)弱三者存在復(fù)雜的耦合關(guān)系,共同影響心肌細(xì)胞的力響應(yīng).

4 總 結(jié)

本文通過探究心肌細(xì)胞在不同微環(huán)境下對外界機(jī)械力振蕩信號的響應(yīng)行為,發(fā)現(xiàn)外界加載的力信號能夠通過微環(huán)境的力學(xué)傳導(dǎo)不斷影響細(xì)胞內(nèi)的鈣離子動力學(xué),最終引入的強(qiáng)耦合使心肌細(xì)胞達(dá)到自身的本征頻率或者與所加載的力信號同頻節(jié)律性振蕩.細(xì)胞外基質(zhì)中的配體蛋白Laminin,Fibronectin 和Collagen I 蛋白具有不同程度的機(jī)械力耦合調(diào)控作用,其中心肌細(xì)胞對包被Laminin的水凝膠的力響應(yīng)效果最好.這可能是因?yàn)長aminin既能與整合素結(jié)合,還可與DGC 連接,因而能通過兩種通路將外界機(jī)械力信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),耦合鈣離子循環(huán),從而實(shí)現(xiàn)雙通道調(diào)控,這也導(dǎo)致其對力學(xué)刺激的響應(yīng)較慢.Fibronectin 在基質(zhì)剛性感應(yīng)方面比較敏感,但在動態(tài)力學(xué)振蕩刺激中并不占優(yōu)勢.Collagen I 具有應(yīng)力硬化的機(jī)械特性,增強(qiáng)力學(xué)信號的同時還會改變細(xì)胞外基質(zhì)硬度,因此表現(xiàn)出不一樣的響應(yīng)行為.通過分析在不同基質(zhì)硬度下心肌細(xì)胞的機(jī)械振蕩力響應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)硬度、細(xì)胞黏附配體密度和力信號強(qiáng)度存在復(fù)雜的耦合關(guān)系,共同影響心肌細(xì)胞對外界力學(xué)刺激的機(jī)械響應(yīng).細(xì)胞間的機(jī)械交流已被證明在生理中扮演著很重要的角色,本研究加深了對心律不齊、心肌梗塞后產(chǎn)生心力衰竭等心血管疾病的理解,為病理研究和疾病治療提供了基礎(chǔ).