二氫卟吩載藥膠團的制備及體外光動力效應研究

蔣小紅 黃嬛

摘要 [目的]研究二氫卟吩e6（Ce6）載藥膠團的體外光動力療法（PDT）對子宮頸癌Hela細胞的殺傷作用。[方法]合成殼聚糖硬脂酸聚合物二氫卟吩e6載藥膠團（CSO-SA/Ce6）和葉酸修飾聚合物的二氫卟吩e6載藥膠團（FA-CSO-SA/Ce6）后，通過熒光顯微鏡觀察載藥膠團對細胞的毒性。以游離的Ce6、殼聚糖硬脂酸聚合物（CSO-SA）為對照組，應用MTT法檢測Ce6載藥膠團對Hela細胞的毒性作用；同時采用波長630 nm的半導體激光垂直照射到24孔培養(yǎng)板上，照射時間為180 s/孔，繼續(xù)孵育細胞24 h，應用MTT法檢測載藥膠團在光照條件下對Hela細胞的光動力殺傷效率。[結果]熒光顯微鏡顯示，Ce6載藥膠團不影響細胞的數量和形態(tài)，對Hela細胞毒性較小；MTT法表明，Ce6包載后，對Hela細胞的PDT殺傷作用顯著強于Ce6。[結論]Ce6載藥膠團對Hela細胞具有良好的光動力殺傷作用，且PDT殺傷效率優(yōu)于Ce6。

關鍵詞 二氫卟吩 e6；載藥體系；光動力療法；制備

中圖分類號 S859 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05034-03

光動力學治療 （photodynamict therapy，PDT） 是20世紀80年代初興起并在近年迅速發(fā)展的新穎治療腫瘤的方法，在臨床上得到了廣泛的應用。光動力學療法具有毒性小、收效快、靶向性強的特點，在殺傷增殖細胞的同時不危及正常組織[1-2]。通過生物光動力敏化作用，即在特定波長的激光照射后，光敏劑受到激發(fā)，由基態(tài)（S0）經激發(fā)單線態(tài)（S1）轉變?yōu)榧ぐl(fā)三線態(tài)（T1），然后由激發(fā)三線態(tài)（T1）使周圍介質中的分子氧成為單線態(tài)氧（1O2）等活性物質，它們與生物分子中的氧化敏感基團作用，導致其氧化失活，最終引起腫瘤細胞死亡而顯示其治療作用[3]。目前臨床上應用的光動力治癌藥物如血卟啉衍生物（HpD）、光敏素Ⅱ等均為成分復雜的卟啉混合制劑，存在著在紅光區(qū)的吸收系數小、有效光動力效應低、光毒反應大及化學組成不定等缺點。而二氫卟吩 e6（Ce6） 是葉綠素穩(wěn)定降解產物中與生物活性聯系最廣的成分之一，且已成為光動力治癌新藥研究中倍受矚目的研究對象。有報道表明，Ce6 具有兩親性能（親水性和親脂性），能產生良好的腫瘤/正常組織比率，且吸收波長移到了紅光區(qū)（664 nm），單線態(tài)氧產率Ф△較高，對腫瘤的抑制率遠好于HpD[4]。近年來，為了提高光敏劑在腫瘤細胞的濃度，許多研究組將第二代光敏劑負載在適當的載體上，制成脂質體、納米粒、乳劑等，通過正常生理過程選擇性地運送、積集至靶組織，大幅度提高光敏劑抗腫瘤活性，這對提高藥物治療作用、降低毒副作用具有十分重要的意義。Richter 等研究發(fā)現苯并卟啉衍生物單環(huán)酸A制成脂質體，能介導藥物迅速地進入組織[5]。Vargas 等將 meso-（對羥基苯）卜啉（p-THPP）制成 PLGA 納米粒，可明顯增強藥物對乳腺癌細胞的作用[6]。

殼聚糖是一種具有低毒、高生物相容性、可體內降解的陽離子型載體材料。但小分子量的殼聚糖即殼寡糖（chitosan oligosaccharide， CSO），本身缺乏親脂性，不易被細胞攝取即較難透過細胞膜；考慮到生物膜主要為脂質屏障，以脂溶性材料為主要組成成分的固體脂質納米粒，具備較強的細胞膜穿透能力。為此，設想將親水性多糖入核與脂溶性納米粒入膜的機理進行組合設計，利用殼寡糖的氨基與硬脂酸的羧基進行化學嫁接，形成陽離子嫁接物，該嫁接物在水性介質中形成內部疏水、外部含親水性多糖分子的陽離子嫁接物膠團。該試驗以碳二亞胺為交聯偶合劑對水溶性的低分子量殼聚糖進行疏水性改造，制備得殼聚糖硬脂酸聚合物，將該聚合物分散于水中，可通過自聚集形成聚合物膠團；以 Hela 細胞系為模型細胞，對殼聚糖硬脂酸聚合物載藥膠團進行細胞光動力效應研究，考察 Ce6 在被殼聚糖硬脂酸聚合物包載前后的體外光動力效應變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑。碳二亞胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide， EDC， 美國Sigma 公司）、殼聚糖硬脂酸聚合物（stearic acid grafted chitosan oligosaccharide，CSO-SA，自制，氨基取代度為3.48%）、葉酸（folic acid， FA，美國Sigma 公司）、細胞培養(yǎng)基1640（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號08062502）、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號080614）、四唑藍（3-（4，5-dimethyl-thiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide， MTT， 美國Sigma 公司，批號090318）、二氫卟吩 e6（chlorin e6， Ce6， 上海紅綠光敏劑有限公司，批號20080324），其他溶劑和試劑均為分析純。

1.1.2 細胞。子宮頸癌細胞（Henrietta Lacks，Hela，中科院上海細胞所）。

1.1.3 儀器。Millipore 超濾離心管（MWCO 10，000，USA）、Thermo 3110 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）、Olympus 71-22型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、JD-1 型氦氖激光電源（南京來創(chuàng)激光科技有限公司）、USC-302 型超聲波清洗器（上海船舶電子設備廠）、85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）、BS 110S型電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 葉酸修飾殼聚糖硬脂酸聚合物的合成。采用碳二亞胺法[7]對CSO-SA進行葉酸修飾。精密稱取CSO-SA 200 mg和葉酸（folic acid， FA）2.0 mg，加入100 ml蒸餾水探頭超聲使溶解，然后加入EDC 20 mg，維持90 °C水浴加熱， 攪拌5 h后停止加熱，待反應產物冷卻至室溫后將其置于透析袋中（MWCO 3.5 KDa， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）透析48 h，以除去水溶性的小分子副產物，將透析液冷凍干燥，即得葉酸修飾的殼聚糖-硬脂酸聚合物（FA modified CSO-SA micelles， FA-CSO-SA）。

1.2.2 Ce6載藥膠團制備。取一定量的 Ce6 醇溶液，與等體積的 CSO-SA 分散液混合，探頭超聲 20 次，制備載藥膠團，用透析袋封裝溶液，在 500 ml 水溶液中于室溫下透析 24 h 除去乙醇，透析保留液即為 Ce6 載藥膠團，凍干備用。

1.2.3 葉酸修飾聚合物的二氫卟吩e6載藥膠團的制備。稱取葉酸修飾聚合物 FA-CSO-SA 10 mg，配制成5.0 g/L的FA-CSO-SA 水溶液，同時配制 0.5 g/L的Ce6 醇溶液。兩溶液等體積混合，冰浴探頭超聲20次，轉移至透析袋中，用去離子水于室溫下透析 24 h 除去乙醇。透析保留液即為 Ce6載藥膠團（chlorin e6 loaded FA-CSO-SA micelles， FA-CSO-SA/Ce6），凍干備用。

1.2.4 細胞培養(yǎng)。取子宮頸癌細胞Hela在含有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）的 1640 培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)（5% CO2， 37 ℃孵箱）。用常規(guī)的胰酶/EDTA消化傳代。

1.2.5 載藥膠團的細胞毒性。

1.2.5.1 載藥膠團對細胞毒性的熒光顯微鏡觀察。將 Hela 細胞按 1.0 ×105個/（ml · 孔）接種于24孔培養(yǎng)板，置37 ℃，5%CO2 孵箱培養(yǎng) 24 h，待細胞完全貼壁后，加入 CSO-SA/Ce6，以未處理的空白細胞為對照，每孔設 3 個復孔。將培養(yǎng)板直接置于熒光倒置顯微鏡下，定時觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.5.2 載藥膠團對細胞毒性作用。采用四唑藍比色法[8]（MTT Assay）進行細胞毒性研究。取對數生長期的 Hela 細胞，經胰蛋白酶消化后，用含 10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的 1640 培養(yǎng)基調整細胞密度為 1.0 ×105個/（ml·孔），接種于24孔培養(yǎng)板，每孔 1.0 ml，置 37 ℃，5%CO2 孵箱培養(yǎng) 24 h，待細胞完全貼壁后，加入不同濃度的 CSO-SA、Ce6 和 CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，以未處理的空白細胞為對照，每孔設 3 個復孔。正常 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，然后加 60 μl MTT（5.0 g/L）溶液，置于 37 ℃，5%CO2 孵箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜 400 μl，振蕩 10 min，用多功能酶標儀測定 570 nm 處吸光度（A），計算細胞增殖抑制率，其公式為IC50 24 h= （Acontrol-Atreat）/Acontrol × 100%，式中，IC50 24 h表示24 h細胞增殖抑制率，Acontrol表示空白對照組吸光度，Atreat表示試驗組吸光度。

1.2.5.3 載藥膠團在光照條件下對細胞毒性作用。將培養(yǎng)的 Hela 細胞用 0.25%的胰蛋白酶消化，吹打，制成單細胞懸液，調整細胞數約 1.0 ×105個/（ml·孔）接種于 24 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃含5% CO2 的孵育箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后棄去上清培養(yǎng)液，嚴格避光的條件下按試驗設計加入不同濃度Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，在嚴格避光的條件下置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h，然后照光。采用波長630 nm的半導體激光進行照射，使光束均勻地垂直照射到24 孔培養(yǎng)板上，照射時間為180 s/孔，每孔設3個復孔。照光后置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育24 h，然后監(jiān)測細胞IC50。

1.2.6 統計方法。采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理，MTT法檢測的細胞毒性之間的比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 載藥膠團對細胞毒性的熒光顯微鏡觀察 以 Hela 細胞為模型，加入投藥量為 5%的 CSO-SA/Ce6，培養(yǎng)板在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。結果（圖1）顯示，加入載藥膠團后，經過24 h后細胞數量和形態(tài)基本保持完好。

2.2 載藥膠團對細胞毒性作用 采用四唑藍比色法（MTT Assay）進行細胞毒性研究，考察 CSO-SA、Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在無光照條件下對Hela 細胞的毒性作用。結果顯示，在無光照存在的條件下，載體、Ce6、CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6對細胞有一定的毒性，這種毒性是無選擇性的，在殺死腫瘤細胞的同時也會造成對正常細胞及系統的損害，而理想的光敏劑藥物則需要在無光照條件下，藥物的毒性越小越好。Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包載后，對 Hela 細胞的24 h 半數致死量增加，IC50為89.72 mg/L，說明載藥膠團可以降低藥物的毒性。但CSO-SA/Ce6和FA-CSO-SA/Ce6對Hela 細胞的IC50 24 h則分別為 104.77和101.05 mg/L，沒有明顯差異。

2.3 載藥膠團在光照條件下對細胞毒性作用

2.3.1 載藥膠團在光照條件下對Hela 細胞毒性作用。 采用四唑藍比色法（MTT Assay）考察Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6 在光照條件下對Hela 細胞的毒性作用。光敏劑在受到一定波長照射后，吸收光子能量，發(fā)生光敏化反應，產生單線態(tài)氧或其他活性氧物質，與多種生物大分子相互作用，損傷細胞結構或影響細胞功能，導致細胞死亡或凋亡，從而起到治療腫瘤的作用。研究表明，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在630 nm、5 mA、照光180 s 的條件下，對Hela 細胞的毒性作用明顯增加，其光動力細胞毒性PDT IC50分別為47.76、42.41和26.33 mg/L。

2.3.2 不同載藥膠團的安全系數比較。采用細胞毒性IC50與光動力細胞毒性PDT IC50之比，表示載藥膠團的安全系數，此比值越大，表示載藥膠團本身的毒性越小、光毒性越大，安全系數越大。結果（表1）顯示，CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 的安全系數分別達 2.11 和 3.84，光照后明顯提高載藥膠團對細胞的殺傷效應，說明用極小的光敏劑量就可以達到很好的光動力效應，其本身的毒副作用隨之降低。

3 結論與討論

該試驗利用殼聚糖-硬脂酸嫁接物具有兩親性特征，在水中自聚形成膠團，以二氫卟吩e6為藥物模型，合成了殼聚糖硬脂酸聚合物二氫卟吩 e6 載藥膠團（CSO-SA/Ce6）和葉酸修飾聚合物的二氫卟吩 e6 載藥膠團（FA-CSO-SA/Ce6）；以Hela細胞系為模型細胞，采用熒光顯微鏡觀察載藥膠團對細胞的毒性，采用四唑藍比色法（MTT Assay）從細胞水平探討了Ce6 載藥膠團的細胞光動力殺傷效應，并與游離Ce6進行了比較；采用波長630 nm的半導體激光垂直照射到 24孔培養(yǎng)板上，照射時間為180 s/孔，繼續(xù)孵育細胞24 h，應用MTT法檢測載藥膠團在光照條件下對 Hela 細胞的光動力殺傷效率。結果顯示，在無光照條件下，Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包載后，對 Hela細胞的24 h半數致死量增加，說明載藥膠團可以降低藥物的毒性；在光照條件下，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 對 Hela 細胞的毒性作用明顯增加；FA-CSO-SA/Ce6 的安全系數最大，說明用極小的光敏劑量就可以達到很好的光動力效應，其本身的毒副作用隨之降低。

光動力效應的強弱受光源、組織氧濃度、光敏劑種類、光敏劑濃度、光源能量密度等諸多因素的影響，選擇合適的條件是進一步提高Ce6的光動力學療效，降低毒性的必要保證，有待于今后試驗的深入研究。

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