寧夏地區(qū)肉牛和灘羊多殺性巴氏桿菌流行調(diào)查分析

郭亞男,王建東*,張正剛,2,馬 科,陳建銀

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,寧夏銀川 750021;3.寧夏同心縣科技服務(wù)中心,寧夏同心 751300;4.原州區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏固原 756000)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種革蘭氏陰性的條件致病菌,能夠感染多種宿主[1],包括人、伴侶動(dòng)物、牲畜和野生動(dòng)物,是引起禽霍亂、牛和水牛及家兔出血性敗血病的病原菌,該病的發(fā)病率和死亡率很高。該病在世界各地廣泛傳播,是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展的病原菌之一,給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。P.multocida作為一種重要的呼吸道病原體,可誘發(fā)宿主上皮屏障的功能障礙,從而導(dǎo)致細(xì)菌入侵以及氣道和肺的多中炎癥性疾病的發(fā)展[2,3]。P.multocida病通常無(wú)明顯季節(jié)性,主要呈散發(fā)或地方流行性特征。環(huán)境條件,應(yīng)激和動(dòng)物的整體健康在疾病的發(fā)生和傳播過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[4]。寒冷季節(jié)呈散發(fā)性流行,在封閉潮濕的氣候條件下,本病更易發(fā)生[5]。同時(shí),圈舍中污染的水源、飼料及直接接觸的器具都可成為該病的傳播媒介,也可通過(guò)空氣飛沫進(jìn)行傳播,從而侵入健康動(dòng)物的呼吸道,誘發(fā)該病的發(fā)生[6-7]。肉牛和灘羊養(yǎng)殖作為寧夏的特色產(chǎn)業(yè),通過(guò)檢測(cè)疾病流行形勢(shì),制定合理的疾病防治措施,是推動(dòng)寧夏肉牛和灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要手段。為掌握寧夏地區(qū)多殺性巴氏桿菌的流行現(xiàn)狀,對(duì)寧夏地區(qū)肉牛和灘羊主要養(yǎng)殖地區(qū)P.multocida流行情況進(jìn)行調(diào)查,分析并掌握該病的分布規(guī)律與流行狀況,為寧夏地區(qū)肉牛和灘羊P.multocida的預(yù)防和治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 在2022年2月至2023年2月期間,在寧夏部分地區(qū),即同心縣、鹽池縣、原州區(qū)、平羅縣、海原縣、賀蘭縣、西夏區(qū)和靈武市等對(duì)這些區(qū)域集約化養(yǎng)殖牧場(chǎng)的肉牛和灘羊進(jìn)行隨機(jī)采樣,總共采集肉牛和灘羊鼻拭子382份(表1)。用酒精棉迅速擦去肉牛和灘羊鼻口周圍的污物,選用一次性無(wú)菌棉簽,插入肉牛和灘羊鼻腔內(nèi)5～10 cm深度,輕輕旋轉(zhuǎn)后抽出棉簽,并置于裝有2 mL生理鹽水的無(wú)菌管中。對(duì)采集的病料樣本低溫運(yùn)輸保存至寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所畜禽疫病防治實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離和鑒定。

表1 肉牛和灘羊鼻拭子采樣信息

1.1.2 主要試劑TaqProbe 2X qPCR-Multiplex 預(yù)混液(B630005),PCR 預(yù)混液(B110006),生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302),天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒(D2500-01),OMEGA公司產(chǎn)品;DL500 DNA Marker(3590A),寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;豆粉瓊脂培養(yǎng)基(WZ7030),金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;脫纖維羊血(1001339-1),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(BPN-0CH),上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫振蕩搖床(QYC-200),上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;Real-time PCR儀(CFX96),美國(guó)伯樂(lè)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考朱麗霞[8]依據(jù)P.multocidaKmt1基因合成Pm-F和Pm-R引物;根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的針對(duì)血清A型的hyaC-hyaD基因、B型的bcbD基因、D型的dcbF基因、E型的ecbJ基因、F型的fcbD基因熒光定量PCR檢測(cè)方法合成引物和探針,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2),引物和探針離心后用ddH2O稀釋至10 μmol/L的工作濃度,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 不同基因特異性引物和探針序列列表

1.2.2 病原分離培養(yǎng) 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),將裝有采集的鼻拭子樣本的離心管渦旋振蕩15 s后,用無(wú)菌接種環(huán)蘸取懸液劃線于5%無(wú)菌脫纖維綿羊血固體培養(yǎng)基,然后將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h后觀察菌落形態(tài)。并挑取典型單菌落于腦心浸出液培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離菌株P(guān)CR鑒定 取分離菌株的液體培養(yǎng)物2 mL,12 000 r/min離心5 min,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)分離菌株進(jìn)行基因組DNA的提取。采用Kmt-F和Kmt-R引物進(jìn)行病原鑒定,Kmt1基因PCR反應(yīng)體系為50 μL體系:模板2 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),2×TaqMaster Mix 25 μL,ddH2O 21 μL。Kmt1反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物,將PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 多殺性巴氏桿菌分型 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取測(cè)序分析后確定為P.multocida的分離菌株DNA組,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的P.multocida血清型分型方法,按照表2中分型引物和探針進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR分型鑒定。TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL體系:2×Premix ExTaqTM10 μL,hyaC-hyaD、fcbD上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL(終濃度為 0.4 μmol/L),bcbD、dcbF、 ecbJ、上、下游引物(10 μmol/L)各 0.6 μL(終濃度為 0.6 μmol/L)、hyaC-hyaD探針(10 μmol/L)0.45 μL(終濃度為 0.45 μmol/L),bcbD、ecbJ、fcbD探針(10 μmol/L)0.6 μL(終濃度為 0.6 μmol/L),dcbF探針(10 μmol/L)0.55 μL(終濃度為 0.55 μmol/L),模板1 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL;反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,59 ℃ 30 s,并收集熒光信號(hào),共39個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線圖和CT值,根據(jù)不同血清型所選用的熒光基團(tuán)不同進(jìn)行分型判定,CT<35視為結(jié)果可信。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 檢測(cè)結(jié)果使用Excel軟件進(jìn)行陽(yáng)性率分析;采用Graphpad prism 7統(tǒng)計(jì)分析軟件中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析,并進(jìn)行分析圖的繪制。P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病原分離培養(yǎng)結(jié)果

接種于5%脫纖維羊血固體培養(yǎng)基的樣品在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)基上可觀察到淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑、黏稠、濕潤(rùn)的露珠狀小菌落,無(wú)溶血現(xiàn)象。

2.2 多殺性巴氏桿菌PCR鑒定結(jié)果

以挑取單菌落培養(yǎng)物DNA為模板,多殺性巴氏桿菌特異性鑒定引物擴(kuò)增Kmt1基因,結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物在456 bp處出現(xiàn)目的條帶,與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).multocida(CVCC1662)陽(yáng)性對(duì)照條帶大小一致(圖1),標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株菌株擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并分析,與P.multocida基因序列同源性高達(dá)100%,由此可判定分離到的菌為P.multocida。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500;2～23.樣品;1.陽(yáng)性對(duì)照;24.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 500; 2-23.Sample; 1.Positive control; 24.Negative control

2.3 不同縣區(qū)多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析

從寧夏8個(gè)縣(區(qū))規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)共采集382份肉牛和灘羊鼻拭子,分離鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。共分離到P.multocida77株,總陽(yáng)性率為20.2%(77/382),不同地區(qū)陽(yáng)性率在12.7%～34.3%之間,其中在靈武市采集的樣品陽(yáng)性率最高,為34.3%;其次是鹽池縣、賀蘭縣,陽(yáng)性率分別為28.6%、26.2%,同心縣采集的樣品陽(yáng)性率最低,陽(yáng)性率為12.7%。

表3 不同地區(qū)樣品P.multocida分離情況

2.4 多殺性巴氏桿菌病分型檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的382份樣品進(jìn)行病原分離,分子生物學(xué)鑒定共分離到77株P(guān).multocida,分離率為20.2%。對(duì)所分離菌株經(jīng)莢膜PCR分型,其中A型44株(57%),B型29株(38%),D型4株(5%)(圖2)。在分離得到的77株P(guān).multocida中,同心縣分離到6株莢膜A型菌、2株莢膜B型菌;分離率為10.4%;鹽池縣分離到7株莢膜A型菌、1株莢膜B型菌,分離率為10.4%;原州區(qū)分離到7株A型菌、2株B型菌,1株D型菌,分離率為13.0%;靈武市分離到5株A型菌、6株B型菌,分離率為14.3%;平羅縣分離到2株A型菌,3株B型菌,1株D型菌;海原縣分離到2株A型菌,4株B型菌,2株D型菌;賀蘭縣分離到7株A型菌,4株B型菌;西夏區(qū)分離到8株A型菌,7株B型菌(圖3)。

圖2 77株P(guān).multocida莢膜分型情況

a.同心縣;b.鹽池縣;c.原州區(qū);d.靈武市;e.平羅縣;f.海原縣;g.賀蘭縣;h.西夏區(qū)

2.5 寧夏地區(qū)不同月齡肉牛和灘羊多殺性巴氏桿菌流行調(diào)查

在對(duì)不同月齡的肉牛和灘羊進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在采集的382份病料中,1月齡、2月齡肉牛P.multocida陽(yáng)性率分別10%和6%,相對(duì)較低,3～7月齡是P.multocida高發(fā)期,陽(yáng)性率范圍為16.7%～31.3%,相對(duì)1～2月齡感染有所增加,且3月齡肉犢牛陽(yáng)性率最高,占3月齡采樣總數(shù)31.3%,可能是肉母牛通過(guò)乳汁將病原菌傳播給肉犢牛,或者是帶毒肉牛通過(guò)與肉犢牛密切接觸而傳播。8月齡～1歲肉牛,P.multocida陽(yáng)性率則呈下降趨勢(shì),可能是隨年齡的增長(zhǎng)機(jī)體抵抗力增強(qiáng)的原因,而2歲肉牛幾乎不發(fā)病,陽(yáng)性率為0(表4)。灘羊P.multocida感染率主要集中在2～5月齡,陽(yáng)性率為21.4%～30.8%;9月齡和2歲的灘羊陽(yáng)性率最低,分別為8.3%、0(表4)。對(duì)不同月齡的肉牛P.multocida陽(yáng)性率差異性分析可知,3～7月齡的肉牛P.multocida陽(yáng)性率最高,與2月齡、1歲和2歲肉牛陽(yáng)性率相比差異性極顯著(P<0.01);4～6月齡與7～9月齡肉牛P.multocida陽(yáng)性率相比差異性顯著(P<0.05),而在不同月齡灘羊P.multocida陽(yáng)性率差異性分析可知,3月齡、4月齡和8月齡陽(yáng)性率最高,與1月齡、9月齡和1歲灘羊P.multocida陽(yáng)性率相比差異性極顯著(P<0.01);其余月齡之間相比差異性不顯著(圖4)。

**.差異性極顯著;*.差異性顯著;a.1月齡;b.2月齡;c.3月齡;d.4月齡;e.5月齡f.6月齡;g.7月齡;h.8月齡;i.9月齡;j.1歲;k.2歲

表4 不同月齡的肉牛和灘羊多殺性巴氏桿菌的陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

3 討論

多殺性巴氏桿菌是動(dòng)物呼吸道常見(jiàn)的致病菌之一[9]。該病原廣泛的存在于各種健康動(dòng)物的鼻腔、咽及肺等部位,當(dāng)機(jī)體受到外界不良刺激造成免疫水平下降時(shí),該菌大量繁殖引發(fā)疾病[10-11]。本研究所采集的病料來(lái)源都是寧夏主要肉牛和灘羊養(yǎng)地區(qū),所以對(duì)這些規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行P.multocida的調(diào)查具有代表性。研究發(fā)現(xiàn),P.multocida在靈武市的陽(yáng)性率最高,為34.3%,而同心縣的陽(yáng)性率最低,為12.7%;其他6個(gè)縣(區(qū))平均陽(yáng)性率為21.7%。對(duì)不同月齡肉牛和灘羊多殺性巴氏桿菌的流行情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),肉牛P.multocida的高發(fā)期主要集中在3～8月齡之間,平均陽(yáng)性率為23.4%,3月齡以下和8月齡以上感染率相對(duì)較低;灘羊P.multocida陽(yáng)性率最高月齡是3月齡,陽(yáng)性率為30.6%;1月齡、9月齡和2歲齡陽(yáng)性率最低(0～12.5%)。以上結(jié)果說(shuō)明了P.multocida發(fā)病階段主要集中在幼齡階段,可能是幼畜對(duì)病原菌的抵抗力較弱,故感染率較高,當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境擁擠,春秋季節(jié)更替,動(dòng)物機(jī)體免疫力下降的情況時(shí),更易發(fā)生P.multocida感染。

對(duì)采集的382份鼻拭子進(jìn)行檢測(cè)與病原分離,分離出77株P(guān).multocida菌株,陽(yáng)性率為20.1%,其中肉牛陽(yáng)性率為19.4%,灘羊陽(yáng)性率為20.8%,每個(gè)地區(qū)均檢出P.multocida,說(shuō)明了P.multocida在寧夏地區(qū)普遍流行。Wang等[12]2011-2012年期間在我國(guó)江蘇省禽霍亂疫情中分離并確定了40株菌株,通過(guò)莢膜分型發(fā)現(xiàn)這些菌株全部為莢膜A型。日本學(xué)者Katsuda等2009-2012年期間從臨床健康和患病牛鑒定分離出378株P(guān).multocida,其中A型菌354株(93.7%),D型菌24株(6.3%),證實(shí)莢膜A型分離株比莢膜D型分離株更為常見(jiàn)[13]。Christa Ewers等1982-2004年期間在德國(guó)通過(guò)PCR和DNA-DNA雜交從臨床不同宿主分離出289株P(guān).multocida,通過(guò)莢膜分型發(fā)現(xiàn)牛源和禽源莢膜A型占比分別高達(dá)92.3%、85.7%,另外在41株豬源多殺性巴氏桿菌中,莢膜A型占34.9%,莢膜D型占58.1%[14]。鮑娟[15]等2003-2008年期間針對(duì)莢膜生物合成位點(diǎn)hyaD、bcbD、dcbF堿基序列分別合成3對(duì)特異性引物,對(duì)17株待檢P.multocida分離物進(jìn)行莢膜PCR分型,其中8株鑒定為A型,占47.06%;9株鑒定為D型,占52.94%。唐先春等2005年在海南、湖北、湖南等地區(qū)從豬的鼻拭子中分離出66株P(guān).multocida,其中有46株為D型,18株為A型,1株為B型P.multocida,1株無(wú)法定型[16]。本研究中分離得到77株多殺性巴氏桿菌中,多數(shù)為莢膜血清型A(57%)和莢膜血清B(38%)、莢膜血清D(5%),沒(méi)有檢出E和F型。以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明,寧夏地區(qū)P.multocida主要以莢膜A型和莢膜B 型為主,莢膜血清D型次之。在寧夏地區(qū)普遍流行。Wang等[12]2011-2012年期間在我國(guó)江蘇省禽霍亂疫情中分離并確定了40株菌株,通過(guò)莢膜分型發(fā)現(xiàn)這些菌株全部為莢膜A型。日本學(xué)者Katsuda等2009-2012年期間從臨床健康和患病牛鑒定分離出378株P(guān).multocida,其中A型菌354株(93.7%),D型菌24株(6.3%),證實(shí)莢膜A型分離株比莢膜D型分離株更為常見(jiàn)[13]。Christa Ewers等1982-2004年期間在德國(guó)通過(guò)PCR和DNA-DNA雜交從臨床不同宿主分離出289株P(guān).multocida,通過(guò)莢膜分型發(fā)現(xiàn)牛源和禽源莢膜A型占比分別高達(dá)92.3%、85.7%,另外在41株豬源多殺性巴氏桿菌中,莢膜A型占34.9%,莢膜D型占58.1%[14]。鮑娟[15]等2003-2008年期間針對(duì)莢膜生物合成位點(diǎn)hyaD、bcbD、dcbF堿基序列分別合成3對(duì)特異性引物,對(duì)17株待檢P.multocida分離物進(jìn)行莢膜PCR分型,其中8株鑒定為A型,占47.06%;9株鑒定為D型,占52.94%。唐先春等2005年在海南、湖北、湖南等地區(qū)從豬的鼻拭子中分離出66株P(guān).multocida,其中有46株為D型,18株為A型,1株為B型P.multocida,1株無(wú)法定型[16]。本研究中分離得到77株多殺性巴氏桿菌中,多數(shù)為莢膜血清型A(57%)和莢膜血清B(38%)、莢膜血清D(5%),沒(méi)有檢出E和F型。以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明,寧夏地區(qū)P.multocida主要以莢膜A型和莢膜B 型為主,莢膜血清D型次之。